甘精胰岛素和三亚乙基四胺(TETA)的制作方法

背景

当前的胰岛素市场包括许多不同产品，包括普通人胰岛素(rhi)和许多胰岛素类似物。已通过氨基酸取代开发出类似物，以提供与rhi相比一定的优势。尤其地，这些优势涉及胰岛素的作用速度。已开发出一些类似物(例如，赖脯胰岛素、门冬胰岛素和赖谷胰岛素)，以便更快的起效，因此对于用餐是首选选项(即，餐前/与餐食一起)。这些胰岛素被称作“快速起效的胰岛素类似物”。相比之下，已开发其他类似物例如甘精胰岛素和德谷胰岛素(insulindegludec)，非常缓慢地起效，因此被用作基础胰岛素，提供～24小时期间的基础血糖控制。这些胰岛素类似物被称作“长效胰岛素类似物”或“缓效胰岛素类似物”或“基础胰岛素”。

甘精胰岛素是基础胰岛素类似物，其是胰岛素分子a链21位的门冬酰胺用甘氨酸残基取代，并在b链30位加入两个精氨酸残基(有时用gly(a21)，arg(b31)，arg(b32)-人胰岛素表示)。这些结构修饰引起分子的等电点的移动，在酸性ph更易溶，在生理学ph下溶解度显著降低。甘精胰岛素一般在无缓冲剂存在的ph4下配制。在注入到(ph-中性)皮下组织后，甘精胰岛素形成微沉淀物，随后从微沉淀物中缓慢释放(http：//www.lantus.com/hcp/about-lantus/how-lantus-works)。沉淀是ph从4变化到～7.4(生理ph)的直接后果。这种缓慢的释放确保小量的甘精胰岛素被持续释放至身体，给出一个几乎无峰的曲线。

赛诺菲安万特(sanofiaventis)以商品名已上市了甘精胰岛素100u/ml。最近，赛诺菲安万特开始上市商品名的甘精胰岛素300u/ml，其与相比具有更长效的pk/pd曲线，可产生更长的葡萄糖控制。此外，礼来(elililly)以商品名上市了甘精胰岛素生物类似物(100u/ml)。

以注射笔和多剂量小瓶两种形式上市。笔芯的组成如下：100u/ml甘精胰岛素(与约3.6mg/ml等效)；25mm间甲苯酚(防腐剂)；185mm甘油和30μg/ml离子形式的锌(氧化锌或氯化锌)；ph4.0。

瓶的组成与笔芯相同，只是其中还包含聚山梨酯20(20μg/ml)，将其加至小瓶制剂中，以防搅拌相关的聚集。因小瓶形式存在顶空，搅拌相关的聚集作用是该制剂形式的一个重大问题，笔芯因不存在顶空则无此问题。

目前仅有注射笔形式，且组成与相同。

(含300u/ml甘精胰岛素)在与具有相同的组分、相同的浓度，只是锌离子浓度除外-胰岛素/锌(w/w)比值保持与产品相同，因此的锌水平为90μg/ml。

wo2013/114112(arecorlimited)公开了含至少约10mg/ml浓度抗体蛋白的水溶液和乙撑亚胺寡聚体，其中乙撑亚胺的重复单元数(n)在n＝2-12范围。

torosantucci等人(europeanjournalofpharmaceuticsandbiopharmaceutics，2013，84，pp464-471)描述了在cu²⁺/抗坏血酸盐氧化体系存在下观察到的尤其是三亚乙基四胺防止蛋白氧化、聚集和破碎的能力。

目前已上市的甘精胰岛素产品在使用前必须贮存在2-8℃。在28天的使用中阶段期间(即从笔芯或小瓶首次使用开始的阶段)，产品可贮存在高至30℃的温度下(建议冷藏或15-30℃非冷藏)。

为了提高患者使用和运输物流的便利性，有改善稳定性的甘精胰岛素组合物的需要，尤其是需要具有以下性质的组合物：

·可提高使用中阶段期间产品的保存温度，例如至40℃；

·使用中阶段的时长可延长，例如至2个月，优选3个月；

·产品可在升高的温度下贮存，例如部分货架期贮存在受控室温下(20-25℃)，例如3个月、6个月或整个货架期，同时使用中稳定性保持在30℃下28天。

因此，本发明的一个目标是提供具有改善稳定性的甘精胰岛素为活性成分的水溶液组合物。

本发明的概述

因此，根据本发明，提供了包含甘精胰岛素为活性成分和三亚乙基四胺(teta)作为稳定剂的水溶液组合物。

附图

图1：用sec法评估的甘精胰岛素(100u/ml)在氯化钠存在下在30℃贮存4周和12周的稳定性(见实施例1的表2)。

图2：用rp-hplc法评估的甘精胰岛素(100u/ml)在氯化钠存在下在30℃贮存4周和12周的稳定性(见实施例1的表3)。

图3：用sec法评估的甘精胰岛素(100u/ml)在teta存在下在30℃贮存4周和12周的稳定性(见实施例2的表5)。

图4：用rp-hplc法评估的甘精胰岛素(100u/ml)在teta存在下在30℃贮存4周和12周的稳定性(见实施例2的表6)。

图5：用sec法评估的甘精胰岛素(100u/ml)在teta存在下在30℃贮存4周和8周的稳定性(见实施例3的表8)。

图6：用rp-hplc法评估的甘精胰岛素(100u/ml)在teta存在下在30℃贮存4周和8周的稳定性(见实施例3的表9)。

图7：用sec法评估的甘精胰岛素(500u/ml)在teta存在下在30℃贮存4周和8周的稳定性(见实施例4的表11)。

图8：用rp-hplc法评估的甘精胰岛素(500u/ml)在teta存在下在30℃贮存4周和8周的稳定性(见实施例4的表12)。

序列表的描述

seqidno.1：甘精胰岛素的a-链

seqidno.2：甘精胰岛素的b-链

发明详述

本文使用的“甘精胰岛素”是指具有seqidno.1中列出的a链和seqidno.2中列出的b链，并包含天然分子中的二硫桥并通过其连接(cysa6-cysa11，cysb7至cysa7和cys-b19-cysa20)。此处所指的“组合物”指的是水溶液组合物。

该组合物中甘精胰岛素的浓度通常在10u/ml至1000u/ml之间，例如在50u/ml至500u/ml、或100u/ml至200u/ml之间。或者组合物中的甘精胰岛素浓度可在200u/ml至500u/ml或500u/ml至700u/ml之间。在一个实施方案中，甘精胰岛素的浓度约为100u/ml。在一个实施方案中，甘精胰岛素的浓度约为200u/ml。在另一个实施方案中，甘精胰岛素的浓度约为300u/ml。在另一个实施方案中，甘精胰岛素的浓度约为400u/ml。在另一个实施方案中，甘精胰岛素的浓度约为500u/ml。本文中使用的“u/ml”描述了甘精胰岛素以每体积的单位数表示的浓度，其中“u”描述了甘精胰岛素的活性，其生物学上相当于34.7μg纯结晶胰岛素。100u相当于3.64mg甘精胰岛素。

本发明的组合物包括三亚乙基四胺(teta)作为稳定剂。teta适当地以1-50mm的浓度存在，例如2-45mm、5-45mm、2-40mm、5-40mm或2-25mm例如5-15mm、6-14mm、7-13mm、8-12mm。

组合物的ph值适宜在3至5之间，例如在3.5至4.5之间。优选是在ph4左右。在这种ph值下，组合中的甘精胰岛素通常是完全可溶的。

该组合物还可以包括可带电荷或不带电荷的张力调节剂。不带电荷的张力调节剂包括甘油、1，2-丙二醇、甘露醇、山梨醇、海藻糖、peg300和peg400。当包括张力调节剂时，不带电荷者通常以50-1000mm的浓度加入，例如100-500mm，例如约300mm。带电荷的张力调节剂的例子包括氯化钠、硫酸钠和氨基酸，例如甘氨酸或精氨酸。当加入时，通常带电荷的张力调节剂加入浓度为25-500mm，例如50-250mm，例如大约150mm。一般不带电荷的张力调节剂比带电荷的张力调节剂更优选。

该组合物还可以包括表面活性剂。在一个实施方案中，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。在另一实施方案中，所述表面活性剂为阳离子型表面活性剂。合适的阳离子型表面活性剂包括苄烷铵(benzalkonium)和苄索铵(benzethonium)盐。在一个实施方案中，阳离子型表面活性剂选自从苄索铵盐，如卤化苄索铵，如苄索氯铵。在另一个实施方案中，阳离子表面活性剂是选自苄烷铵盐，如苄烷铵卤化物，如氯苄烷铵。在进一步实施方案中，阳离子型表面活性剂是苄索铵盐和苄烷铵盐的混合物，如苄索氯铵和氯苄烷铵的混合物。

当包括表面活性剂时，其浓度通常是5-200μm，如10-100μm或20-100μm。

本发明的组合物还可包括防腐剂，如酚类或苄基防腐剂。防腐剂宜选自苯酚、间甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸甲酯，特别是苯酚、间甲酚和苯甲醇。

防腐剂的浓度一般为1-100mm，如20-80mm，如25-50mm。在该组合物中选择防腐剂的最佳浓度，以确保该组合物通过药典抑菌效力试验(usp<51>，vol.32)。

组合物可包含一种缓冲剂。合适的缓冲剂包括醋酸盐、琥珀酸盐、枸橼酸盐、组氨酸、苹果酸盐和马来酸盐。

该组合物适当地包含离子锌，即zn²⁺阳离子。离子锌的来源一般为水溶性锌盐，如zncl2、zno、znso4、zn(no3)2或zn(醋酸)2，最适合为zncl2或zno。适当地，锌离子存在的数量是10-100μg/100u的甘精胰岛素，如20-50μg，例如大约30μg/100u的甘精胰岛素。离子锌的量在浓度计算中不包括反离子的质量。

适当地，组合物中带电荷物种的总浓度较低。在本发明的背景下，带电荷物种被定义为在组合物的条件下携带至少一个电荷的化学实体，例如钠阳离子(na⁺)、氯阴离子(cl^-)或氨基酸如组氨酸。适当地，带电荷物种的总浓度，不止源于离子锌、teta，且组合物中甘精胰岛素小于150mm，例如小于100mm，如小于50mm或小于25mm。在一个实施方案中组合物基本上无拥有超过1个荷电基团或多于1个总电荷的离子型物种(除了甘精胰岛素、离子锌和teta)。例如，该组合物基本上不含离子物种(除了甘精胰岛素、离子锌和teta)，这些离子物种具有2、3、4个或更多的荷电基团。例如，该组合物基本上不含总电荷为2、3、4或更多个的离子物种(除了甘精胰岛素、离子锌和teta)。

组合物的离子强度可根据以下公式计算：

其中cx为离子x的摩尔浓度(moll^-1)，zx为离子x电荷的绝对值，其总和包含组合物中存在的所有离子(n)。在计算时应忽略甘精胰岛素本身、离子锌、teta的贡献。该组合物的离子强度适当地保持在最低水平，因为较高离子强度的组合物通常不如可比较的较低离子强度组合物稳定。适当地，该组合物的总离子强度小于40mm，例如小于20mm，例如小于10mm。

可能设想的具体实施方案是一个根据本发明的ph约为4的组合物，其包含甘精胰岛素作为活性成分，浓度在50u/ml至500u/ml，作为稳定剂的teta的浓度为2-45mm，例如5-40mm，和选自甘油、1，2-丙二醇、甘露醇、山梨醇、海藻糖、peg300和peg400的张力调节剂。

当前主张的本发明来源于一项令人惊讶的观察结果，即通过加入三亚乙基四胺(teta)使甘精胰岛素作为活性成分的组合物稳定。观察到了化学稳定性和物理稳定性的改善(见实施例2-4)。

鉴于发明人的观察结果，该结果是令人惊讶的，即增加甘精胰岛素组合物中的离子强度导致物理稳定性和化学稳定性的降低(见实施例1)。在通常用于配制甘精胰岛素的酸性ph值下，teta是带电荷的，因此会增加组合物的离子强度。基于实施例1的观察结果，可以预期离子强度的增加不会导致稳定性的变化或降低。

正如实施例2和3中所见，加入teta导致稳定性的显著改善。不受理论约束的情况下，所述组合物似乎为甘精胰岛素的稳定性提供了最佳的成分和浓度，这是由于在teta的稳定作用与增加该组合物的离子强度的不稳定作用之间取得了平衡。

如实施例2和3所示，本发明的组合物证实了贮存在30℃4周、8周和12周后良好的稳定性。

在更高浓度的甘精胰岛素(500u/ml)中也观察到了稳定性的改善，如实施例4所示。

甘精胰岛素组合物的物理稳定性是指由于尤其与表面和界面的不稳定相互作用和温度波动所致的甘精胰岛素分子形成不溶性聚集体的趋势。聚集体在本文被描述为“高分子量物种”，是指蛋白质内容物的任何不可逆形成的组分，其表观分子量至少是甘精胰岛素分子原形分子量的两倍。因此，高分子量物种是甘精胰岛素分子原形的多聚体，其可能包括构象发生显著改变的甘精胰岛素分子原形，或者可能使甘精胰岛素原形单位以天然或近天然构象形式的组装。甘精胰岛素组合物的物理稳定性可通过本领域已知方法进行了评价，包括目视检查、尺寸排除色谱(sec)、电泳、分析超离心、光散射、动态光散射、静态光散射和场流分级分离。一般程序中描述了使用目视检查和尺寸排除色谱(sec)的示例性方法。

甘精胰岛素组合物的化学稳定性是指甘精胰岛素分子共价蛋白结构的变化导致化学相关的甘精胰岛素物种(降解产物)的形成。甘精胰岛素组合物的化学稳定性可按照一般程序中的描述，通过反相hplc(rp-hplc)评价，来测定总的甘精胰岛素化学相关物种的比例(即通过甘精胰岛素化学修饰在贮存期间或其他压力条件下产生的物种，包括谷氨酰胺或天冬酰胺残基的脱氨基作用，形成环酰亚胺或各种水解过程)。

适宜地，本发明的组合物与目前市面上销售的甘精胰岛素产品相比，在更长的时间内保持为澄清的溶液，允许更长的使用周期。因此，在一个实施方案中，本发明组合物贮存在15-30℃例如在30℃超过4周，例如5周、6周、7周、8周、10周或12周期间仍然是澄清的溶液。“澄清溶液”是指在贮存期间未观察到可见的沉淀。

适宜地，本发明组合物在暴露于高于目前市面上销售的甘精胰岛素产品推荐温度的环境中时，仍然是澄清的溶液。因此，在一个实施方案中，本发明的组合物在贮存4周期间，在高于30℃的温度下，例如在32℃、在34℃、在35℃、在37℃、在38℃或在40℃贮存4周期间仍然是澄清的溶液。

优选地，本发明的组合物提供了一种更加用户友好的使用中周期，即该组合物可以在更高的温度下贮存，并且比目前市面上销售的甘精胰岛素产品推荐的贮存时间更长。因此，在一个实施方案中，本发明的组合物在32℃或更高温度下贮存期间仍然是一个澄清的溶液，例如在32℃、在34℃、在35℃、在37℃、在38℃或在40℃；贮存至少4周，例如4周、5周、6周、7周、8周、10周或12周。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物是一个具有低粘度的澄清溶液(例如低于20cp的动力粘度，如在25℃低于10cp，如低于5cp，动力粘度使用微流体毛细管挤出粘度计如m-vroc^tm，rheosenseinc.测量)。

适宜地，本发明的组合物在升高温度下具有改善的贮存稳定性，同时保持了使用中稳定性。因此，在一个实施方案中，本发明的组合物在25℃贮存期间仍然是一个澄清的溶液，贮存时间至少3个月，例如3个月、6个月、12个月或24个月；并且在贮存期结束后即时开始，在30℃下的28天使用中阶段期间也仍然是一个澄清的溶液。

在一个实施方案中，本发明的组合物在15-30℃例如30℃贮存长于4周后，例如贮存5周、6周、7周、8周、10周或12周后，包含不超过4％(组合物中甘精胰岛素总重)的高分子量物种，优选不超过3％、2％或1％。“澄清溶液”是指在贮存过程中没有观察到可见的沉淀。

在一个实施方案中，本发明的组合物在高于30℃的温度下贮存至少4周后，例如在32℃、34℃、35℃、37℃、38℃或40℃，例如贮存4周期间，包含不超过4％(组合物中甘精胰岛素总重)的高分子量物种，优选不超过3％、2％或1％。

在一个实施方案中，本发明的组合物在32℃或更高的温度下贮存后，例如在32℃、34℃、35℃、37℃、38℃或40℃下贮存至少4周，例如贮存4周、5周、6周、7周、8周、10周或12周后，包含不超过4％(组合物中甘精胰岛素总重)的高分子量物种，优选不超过3％、2％或1％。

在一个实施方案中，本发明的组合物在25℃下贮存至少3个月，如3个月、6个月、12个月或24个月后，包含不超过4％(组合物中甘精胰岛素总重)的高分子量物种，优选不超过3％、2％或1％；并且自贮存期结束后即时开始在30℃下28天的使用中周期后也包含不超过4％(组合物中甘精胰岛素总重)的高分子量物种，优选不超过3％、2％或1％。

在一个实施方案中，本发明的组合物表现出在贮存期间高分子量物种的增加，与不存在作为稳定剂的teta(浓度为1-50mm)、其他成分相同的组合物在相同条件和时长下贮存后相比，增加幅度至少低10％，优选至少低25％，更优选至少低50％。

适宜地，本发明的组合物在15-30℃，例如30℃下贮存至少4周，例如4周、5周、6周、7周、8周、10周或12周后，保留至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％天然甘精胰岛素(按在时间t＝0时组合物中甘精胰岛素的总重计)。

适宜地，本发明的组合物在大于30℃的温度下贮存至少4周，例如在32℃、34℃、35℃、37℃、38℃或40℃下贮存4周期间，保留至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％天然甘精胰岛素(按在时间t＝0时组合物中甘精胰岛素的总重计)。

适宜地，本发明的组合物在32℃或更高的温度下，例如在32℃、34℃、35℃、37℃、38℃或40℃下贮存至少4周，例如4周、5周、6周、7周、8周、10周或12周，保留至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％天然甘精胰岛素(按在时间t＝0时组合物中甘精胰岛素的总重计)。

适宜地，本发明的组合物在25℃下贮存至少3个月，如3个月、6个月、12个月或24个月后，本发明的组合物保留至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％天然甘精胰岛素(按在时间t＝0时组合物中甘精胰岛素的总重计)；并且自贮存期结束后即时开始在30℃下28天的使用中周期后，也保留至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％天然甘精胰岛素(按在时间t＝0时组合物中甘精胰岛素的总重计)。

适宜地，本发明的组合物与不存在作为稳定剂的teta、但其他成分相同的组合物相比，在相同条件和时长下贮存后化学相关的甘精胰岛素物种的增加幅度应当至少低10％，优选至少低25％，更优选至少低50％。

适宜地，在15-30℃，例如30℃下贮存至少4周，例如4周、5周、6周、7周、8周、10周或12周，甘精胰岛素总化学相关物种的比例仍然低于4％(按重量)，优选3％以下，更优选2％以下，甚至更优选1％以下。

适宜地，在高于30℃的温度下贮存至少4周，例如在32℃、34℃、35℃、37℃、38℃或40℃下贮存4周期间，甘精胰岛素总化学相关物种的比例仍然低于4％(按重量)，优选3％以下，更优选2％以下，甚至更优选1％以下。

适宜地，在至少32℃或更高的温度下，例如在32℃、34℃、35℃、37℃、38℃或40℃下贮存至少4周，例如4周、5周、6周、7周、8周、10周或12周期间，甘精胰岛素总化学相关物种的比例仍然低于4％(按重量)，优选3％以下，更优选2％以下，甚至更优选1％以下。

适宜地，本发明的组合物在25℃下贮存3个月、6个月、12个月或24个月后，甘精胰岛素总化学相关物种的比例仍然低于4％(按重量)，优选3％以下，更优选2％以下，甚至更优选1％以下；并且自贮存期结束后即时开始在30℃下28天的使用中周期后，仍然低于3％(按重量)，优选2％以下，更优选1％以下。

在本发明的另一方面，提供了使用teta用于稳定甘精胰岛素组合物的用途。

本发明的又一方面，提供了提高包含甘精胰岛素作为活性成分的水溶液组合物稳定性的方法，包括向组合物中加入teta作为稳定剂。

本发明的组合物是治疗性组合物。

因此，本发明的另一个方面提供了一种治疗糖尿病的方法，该方法包括向需要的个体施用治疗有效量的本文所述组合物。本发明还提供了本发明所述的组合物用作药物，特别是用于治疗糖尿病。例如，所述糖尿病的治疗是慢性治疗。

本发明组合物在1型糖尿病患者中的典型起始剂量应为每日总胰岛素需求量的约三分之一。根据患者的体量和病症，相应为5-50u，例如5-25u，例如15u，通常每天施用一次。

本发明组合物在2型糖尿病患者中的典型起始剂量为每kg体重0.2u，每日给药一次，随后应根据患者的需要进行调整。

还提供了容器，例如由塑料或玻璃制成，包含本文所述组合物的一个剂量或多个剂量。例如，容器可以是小瓶或设计成可替换的药芯与注射装置一同使用。

本发明的组合物可适当包装用于注射，特别是皮下注射或肌肉注射。优选皮下注射。注射可以使用传统的注射器或更优选的通过适合糖尿病患者使用的笔装置。示范性的笔装置包括和

本发明的一个方面是注射装置，特别是适于皮下注射或肌肉注射的装置，用于单次或多次使用，包括包含本发明组合物的一个剂量或多个剂量的容器以及注射针。在实施方案中，所述容器是包含多个剂量的可更换筒体。在实施方案中，所述针是可更换的，例如在每次使用之后。在一个实施方案中，所述注射装置采用笔形式。

本发明的另一个方面是医疗装置，包括含多个剂量的本发明的组合物贮库和适配自动或远程操作的泵，这样在自动或远程操作时，一个或多个剂量的本发明组合物被例如皮下或肌内施用于体内。这种装置可以戴在体外，或可以植入体内。

根据本发明，期望含有甘精胰岛素的组合物应具有以下一项或多项优点：

·使用中阶段期间在温度高达40℃时具有良好的稳定性；

·在延长的使用中阶段期间，例如长达12周，具有良好的稳定性；

·在例如20-25℃的升高温度下良好的贮存稳定性，同时保留良好的使用中稳定性；

预期根据本发明的组合物具有本文所述的良好的物理稳定性和化学稳定性。

实施例

材料

实施例1-3中使用的甘精胰岛素是从hecpharm获得的。实施例4中使用的甘精胰岛素是从另一家供应商获得的。

一般程序

甘精胰岛素物理稳定性分析

目视评估

使用2.9.20欧洲药典专论(微粒污染：可见微粒)适当地检测可见微粒。所需仪器由观察站组成，包括：

·适当尺寸的哑光黑色面板，垂直放置

·适当尺寸的非眩光白色面板，垂直放置在黑色面板旁边

·可调节的灯座，配备一个合适的、有阴影的白光光源和一个合适的光扩散器(包含两个13w荧光灯管的可视光源，每个525mm长，是合适的)。观测点的照度维持在2000lux至3750lux之间。

从容器取下任何附着的标签，将外部清洗和干燥。将容器轻轻涡旋或翻转，确保不引入气泡，并在白色面板前观察约5秒。这个过程在黑色面板前重复。记录任何粒子的存在情况。

尺寸排阻色谱(sec)

甘精胰岛素制剂的超高效尺寸排阻色谱法是使用watersacquityh-classbio系统1.7μmethylenebridgedhybrid孔隙填装材料在300mmx4.6mm的色谱柱上进行的。用0.65mg/mll-精氨酸、20％v/v乙腈、15％v/v冰醋酸流动相平衡柱。流速为0.4ml/min，紫外检测(276nm)。注入体积是10μl。所有分析都是在环境温度下进行的。

甘精胰岛素化学稳定性分析反相高效液相色谱法(rp-hplc)

超高效反相色谱法使用watersacquityh-classbio系统，1.7μmethylenebridgedhybrid粒子，三功能性固定了c18配体的孔树脂，柱长50mmx2.1mm的色谱柱进行。胰岛素样品以82％w/vna2so4、18％v/v乙腈、ph2.3流动相结合，50％w/vna2so4、50％v/v乙腈梯度洗脱。样品2μl用0.01m盐酸酸化，并在0.61ml/min下，214nmuv检测分析。所有的分析均在40℃下进行。

例1-离子强度(无机盐)对甘精胰岛素(100u/ml)稳定性的影响

离子强度对甘精胰岛素(100u/ml)稳定性的影响是通过比较目前已上市制剂中在包含和不包含特定浓度的氯化钠和硫酸钠下甘精胰岛素(100u/ml)的稳定性进行研究的。当前已上市的制剂包含25mm间甲酚、185mm甘油和30μg/ml离子锌，并调整至ph4.0。

结果表明(表1-3，图1-2)，氯化钠的加入导致了物理稳定性(目视评估和sec评估(见一般程序))和化学稳定性(rp-hplc评估(见一般程序))的损害。结果表明，硫酸钠显示对样品的物理稳定性有显著影响，导致大量沉淀物，从而阻碍了sec和rp-hplc法对样品的进一步分析。

表1：甘精胰岛素(100u/ml)在30℃贮存4周和12周后的稳定性进行目视评估。所有制剂均包含25mm间甲酚、185mm甘油和30μg/ml离子锌并调整至ph4.0。可见沉淀程度按1-3级评级；1＝溶液澄清无可见微粒；2＝轻度微粒形成，3＝更显著的沉淀。

表2：用sec法评估甘精胰岛素(100u/ml)在30℃贮存4周和12周后的稳定性。所有制剂均包含25mm间甲酚、185mm甘油和30μg/ml离子锌，并调整至ph4.0。

表3：用rp-hplc法评估的甘精胰岛素(100u/ml)在30℃贮存4周和12周后的稳定性。所有制剂均包含25mm间甲酚、185mm甘油和30μg/ml离子锌并调整至ph4.0。

实施例2-三亚乙基四胺(teta)对甘精胰岛素(100u/ml)稳定性的影响

teta作为添加剂对甘精胰岛素(100u/ml)稳定性的影响通过比较目前已上市甘精胰岛素(100u/ml)制剂在teta存在和不存在情况下的稳定性进行研究。当前已上市的制剂包含25mm间甲酚、185mm甘油和30μg/ml离子锌，并调整至ph4.0。

由下表4-6(和图3-4)可以看出，teta的添加改善了甘精胰岛素在制剂中的物理稳定性(通过目视评估和sec评估(见一般程序))和化学稳定性(通过rp-hplc评估(见一般程序))。如果使用10mm的teta与使用较低的1mmteta相比，观察到更大程度的稳定性提高。

表4：目视评估甘精胰岛素(100u/ml)在30℃贮存4周和12周的稳定性。所有制剂均包含25mm间甲酚和185mm甘油，并调整至ph4.0。可见沉淀程度按1-3级评级；1＝溶液澄清无可见微粒；2＝轻度微粒形成，3＝更显著的沉淀。

表5：sec法评估甘精胰岛素(100u/ml)在30℃贮存4周和12周后的稳定性。所有制剂均包含25mm间甲酚、185mm甘油和30μg/ml离子锌，并调整至ph4.0。

表6：用rp-hplc法评估的甘精胰岛素(100u/ml)在30℃贮存4周和12周的稳定性。所有制剂均包含25mm间甲酚、185mm甘油和30μg/ml离子锌，并调整至ph4.0。

实施例3-三亚乙基四胺(teta)对甘精胰岛素(100u/ml)的影响-进一步研究

进行了附加试验以研究teta作为添加剂对甘精胰岛素(100u/ml)稳定性的影响。通过比较目前已上市制剂在特定浓度的teta存在和不存在下的稳定性研究其影响。当前已上市制剂包含25mm间甲酚、185mm甘油和30μg/ml离子锌，并调ph值至4.0。

确认实施例2的结果，如下表7-9(和图5-6)可以看出，甘精胰岛素的物理稳定性和化学稳定性得到改善。如果使用10mm的添加剂与更高添加剂浓度相比，观察到最大幅度的稳定性提高。

表7：目视评估甘精胰岛素(100u/ml)在30℃贮存4周和8周的稳定性。所有制剂均包含25mm间甲酚、185mm甘油和30μg/ml离子锌，ph值调至4.0。可见沉淀程度按1-3级评级；1＝溶液澄清无可见微粒；2＝轻度微粒形成，3＝更显著的沉淀。

表8：sec法评估甘精胰岛素(100u/ml)在30℃贮存4周和8周的稳定性。所有制剂均包含25mm间甲酚、185mm甘油和30μg/ml离子锌，ph值调至4.0。

表9：用rp-hplc法评估的甘精胰岛素(100u/ml)在30℃贮存4周和8周后的稳定性。所有制剂均包含25mm间甲酚、185mm甘油和30μg/ml离子锌，ph值调至4.0。

实施例4-三亚乙基四胺(teta)对甘精胰岛素(500u/ml)稳定性的影响

teta对甘精胰岛素(500u/ml)稳定性的影响，是通过比较在teta存在和不存在下，目前已上市的制剂(对照制剂)中的甘精胰岛素(500u/ml)的稳定性进行研究的。因甘精胰岛素的浓度升高调整所试验的所有组合物中的锌水平，使甘精胰岛素与锌之间的重量比与已上市的制剂相同。对照制剂因此包含500u/ml胰岛素、25mm间甲酚、185mm甘油和150μg/ml离子锌，并调ph值至4.0。

如下表10-12所示，teta的加入改善了甘精胰岛素的物理稳定性(通过目视评估和sec评估(见一般程序))和化学稳定性(通过rp-hplc评估(见一般程序))。以海藻糖代替甘油作为张力调节剂，稳定性也得到进一步的轻微改善。

表10：目视评估甘精胰岛素(500u/ml)在30℃贮存4周和8周后的稳定性。所有制剂均包含25mm间甲酚和150μg/ml离子锌，ph值调至4.0。可见沉淀程度按1-3级评级；1＝溶液澄清无可见微粒；2＝轻度微粒形成，3＝更显著的沉淀。

表11：sec法评估甘精胰岛素(500u/ml)在30℃贮存4周和8周后的稳定性。所有制剂均包含25mm间甲酚和150μg/ml离子锌，ph值调至4.0。

表12：用rp-hplc法评估甘精胰岛素(500u/ml)在30℃贮存4周和8周后的稳定性。所有制剂均包含25mm间甲酚和150μg/ml离子锌，并调ph值至4.0。

在整个说明书和权利要求中，除非上下文另有要求，“包含”(comprise)这个词及其变体例如“包含”(comprises)和“包含”(comprising)，将理解为是指包括所标示的整数、步骤、整数组或步骤组，但不排除任何其他整数、步骤、整数组或步骤组。

本发明说明书中涉及的所有专利、专利申请和参考文献在此全部引用作为参考。

本发明包括以上引用的优选和更优选组和适宜和更适宜组和实施方案组的全部组合。

序列表

seqidno.1：

a链：nh2-gly-ile-val-glu-gln-cys-cys-thr-ser-ile-cys-ser-leu-tyr-gln-leu-glu-asn-tyr-cys-gly-cooh

seqidno.2：

b链：nh2-phe-val-asn-gln-his-leu-cys-gly-ser-his-leu-val-glu-ala-leu-tyr-leu-val-cys-gly-glu-arg-gly-phe-phe-tyr-thr-pro-lys-thr-arg-arg-cooh