用于递送水性诱饵以控制害虫蚂蚁的可生物降解水凝胶的制作方法

本申请要求2017年9月27日提交的美国专利申请序列号62/400,161的优先权，该申请的全部内部通过引用并入本文。

本发明涉及城市、农业和自然环境中的害虫蚂蚁管理，更具体地，涉及可生物降解水凝胶基质的开发以针对入侵的害虫蚂蚁种群递送液体诱饵。

背景

阿根廷蚁linepithemahumile(mayr)是世界范围内广泛存在的入侵物种(wild,2004,wetterer等人，2019)。它是城市、农业和自然环境中最具破坏性的害虫蚂蚁种类之一。与其他流浪蚁种如小黄家蚁(monomoriumpharaonic(l.))(passera,1994;tay和lee,2015)一样，l.humile繁殖率高，具有一夫多妻的群体结构，表现出联合殖民性，并可通过芽殖繁殖。此外，即使只有一只蚁后和少许工蚁，阿根廷蚁群体也可继续繁殖。阿根廷蚁生物学的这一方面可解释为什么一旦在新的地方建立了种群就特别难以消除该物种的原因。

阿根廷蚁常常在城市环境中造成广泛的区域性虫害，这使其成为严重骚扰性害虫。例如，在加利福尼亚的城市居住环境中，阿根廷蚁是害虫管理专业人员防治的最常见的害虫蚂蚁种类之一。在农业环境中，阿根廷蚁很容易与产蜜露的半翅目害虫建立取食共生关系。半翅目昆虫蜜露充当重要的营养来源，支持大量的阿根廷蚁，并且招来的阿根廷蚁的存在会保护半翅目害虫使之免受天敌如寄生蜂的伤害。因此，通过提供有效的蚂蚁管理程序来破坏蚂蚁-半翅目昆虫的互动是至关重要的，以避免它们干扰农业环境中的生物控制程序。

由于其若干实际优点如易于施用和相当快地抑制害虫蚂蚁种群，故杀虫剂喷雾剂是在城市和农业环境中控制阿根廷蚁的常见选择之一。在城市居住环境中，害虫管理专业人员通常采用含有活性成分如苯基吡唑和拟除虫菊酯的喷雾剂来控制阿根廷蚁。在加利福尼亚的柑橘园和葡萄园中，有机磷酸酯喷雾剂是限制害虫蚂蚁接近蜜露和产蜜露的半翅目昆虫的典型选择之一。然而，对常用的喷雾杀虫剂一直有顾虑，如土壤和水污染以及对工人和非目标生物的潜在健康风险。另外，已知某些类型的喷雾剂产品(例如，可乳化浓缩物(ec))会显著贡献于挥发性有机化合物(voc)排放，从而可能影响空气质量。

因此，已考察液体诱饵作为这些杀虫剂喷雾剂的替代物之一来控制蚂蚁。用适当浓度的慢效有毒物配制的含糖液体诱饵已被证实是大型阿根廷蚁群体的有效控制方法。理论上，含糖液体会是理想的诱饵，因为它与蚂蚁的天然液体食物来源蜜露相似。然而，几个因素会阻止液体诱杀被广泛用于实际的蚂蚁管理。例如，液体诱饵不能撒施，从而需要诱饵站来容纳和分配诱饵。诱饵站昂贵并且需要频繁维护(例如，检查、清洁、再填充等)。为了达到可接受的控制水平，常常需要在大片区域里安装和维护许多诱饵站。另外，也存在来自当前诱饵站的常见设计因素例如诱饵贮存器和分配器的挑战。水从分配器中的液体诱饵蒸发会增大诱饵中糖和活性成分的浓度，最终使得分配器中的诱饵对于觅食蚁不那么适口。另外，含在诱饵贮存器中的水性糖饵往往会在温暖的环境条件下发酵，因此损害目标蚂蚁物种的继续觅食和接受性。

为了克服常规液体诱杀的这些限制，已研究了水凝胶基质作为在没有诱饵站的情况下递送水性液体诱饵的方法。迄今为止，已测试了由聚丙烯酰胺构成的合成水凝胶来针对阿根廷蚁递送蔗糖液体诱饵。水凝胶基质的使用使得可以将液体诱饵直接施用于蚂蚁通常觅食和筑巢的地面上。高吸收性水凝胶基质通过保留水来长时间保持液体诱饵适口，从而实质上充当控制释放媒介物。

然而，聚丙烯酰胺水凝胶不易生物降解，因此在施用后它们往往积聚在土壤表面上。另外，暴露于光和热会使聚丙烯酰胺分解为其单体即丙烯酰胺，这种化学物质被世界卫生组织(worldhealthorganization,1985)和加利福尼亚州列为有毒物质。一些研究甚至表明，丙烯酰胺可能是一种周围神经毒素并且是对人类的一种潜在致癌物质。

概述

考虑到上述问题，希望有一种使用可生物降解水凝胶的新型诱杀技术，其不需要常规的诱杀站，从而为蚂蚁诱杀提供更价廉且劳动强度更低的选择。根据一个示例性实施方案，与其他合成水凝胶选择如聚丙烯酰胺不同，使用可生物降解水凝胶的新型诱杀技术不会从水凝胶化合物产生任何潜在有害的降解产物。另外，可生物降解水凝胶一旦在现场施用就会很容易分解。与其他常规喷雾剂相比，在这种新型诱杀技术中施用于现场的杀虫剂的量将低得多。在可生物降解水凝胶诱饵中添加物种特异性信息素将增加诱杀的功效。

根据一个示例性实施方案，已开发并评价了可生物降解水凝胶诱饵，该水凝胶诱饵可在许多不同的环境情况中彻底改变蚂蚁诱杀实践。水凝胶诱饵包裹掺有少量杀虫剂的蔗糖液体，允许蚂蚁从水凝胶表面摄食。这种新型诱杀方法不需要常规的诱饵站，诱饵站通常昂贵且难以保养/维护。在水凝胶中添加物种特异性信息素也将增加可生物降解水凝胶诱饵对目标蚂蚁物种的吸引力。

公开了一种用于递送水性诱饵以控制害虫蚂蚁的可生物降解水凝胶，所述可生物降解水凝胶包含：与钙离子交联的藻酸盐的天然聚合物。

一种形成用于递送水性诱饵以控制害虫蚂蚁的可生物降解水凝胶的方法，所述方法包括：使藻酸钠与钙离子离子交联。

附图简述

图1为示出在不同%rh和基底湿度条件下水凝胶基质的失水百分数(平均值±se)的图表，并且其中对于每个时间段，标记有相同字母的符号没有显著差异，p=0.05(tukey’shsd)。

图2为在引入到测试场地中后5分钟时对有失去0%、25%、50%、75%水的水凝胶基质的摄食场地的选择的示意。

图3为示出在水凝胶珠粒上摄食的蚂蚁的数量(平均值±se)随时间变化的图表，其中图例示出水凝胶基质的不同失水水平，并且对于每个时间段，标记有相同字母的符号没有显著差异，p=0.05(平方根变换数据，tukey’shsd试验)。

图4a-4c为ca-alg水凝胶珠粒的表面形貌的sem图像，其中图4a为放大80倍(湿水凝胶珠粒，hitachitm-1000台式sem)，图4b为放大250倍(feinovananosem450)，图4c为放大1000倍(feinovananosem450)。

图5为表1，其示意了水凝胶基质制备条件的27种不同组合。

图6为表2，其为在不同的制备条件组合下水凝胶重量百分数的方差结果分析。

图7为表3，其示意了在各种溶液中调理的水凝胶珠粒的直径增加和重量增加的百分数。

图8为表4，其示意了不同浓度的噻虫嗪水凝胶诱饵对实验室工蚁群体的减少百分数的影响。

图9为表5，其示意了不同浓度的噻虫嗪水凝胶诱饵对实验室蚁后群体的减少百分数的影响。

图10为表6，其示意了不同浓度的噻虫嗪水凝胶诱饵对实验室蚁雏(brood)群体的减少百分数的影响。

详述

使用易于生物降解的天然水凝胶基质将消除与合成聚合物相关的一些上述限制。在本研究中，考察了由藻酸盐——一种从海草或海藻提取的多糖——制成的天然聚合物用作替代的水凝胶材料来递送水性液体诱饵的潜在用途。藻酸盐水凝胶已被用来递送各种化合物如肥料、触杀性杀虫剂和药物。通过优化藻酸钠与钙离子的离子交联过程，设计了具有必要吸收性的藻酸盐水凝胶。使用噻虫嗪作为杀虫活性成分，进行了实验室研究以确定该藻酸盐水凝胶吸收和递送针对阿根廷蚁种群的液体诱饵的有效性。

材料和方法

进行实验1以确定产生具有最佳性质的藻酸盐水凝胶珠粒的方法。使用通过从实验1确定的方法产生的藻酸盐水凝胶珠粒，进行实验2-5以确定藻酸盐水凝胶珠粒作为基质来递送针对阿根廷蚁的液体诱饵的潜力。进行实验2来确定藻酸盐水凝胶珠粒在模拟湿度条件下的失水特性。进行实验3来评估随着藻酸盐水凝胶诱饵失水，觅食阿根廷蚁对诱饵的接受性。进行实验4来表征当在含有各种浓度的杀虫剂活性成分噻虫嗪的蔗糖溶液中调理时藻酸盐水凝胶珠粒。进行实验5来确定在蔗糖液体诱饵中调理后噻虫嗪是否迁移到整个藻酸盐水凝胶珠粒中。最后，进行实验6和7来确定藻酸盐水凝胶诱饵在实验室和现场条件下控制阿根廷蚁的功效。

实验1：设计具有最佳性质的藻酸盐水凝胶

具有较大直径的球形水凝胶诱饵更容易在现场施用。另外，单位重量吸收最大量液体诱饵的水凝胶基质将允许液体诱饵的更高效递送。因此，坚固的球形形状和对蔗糖水溶液的高吸收性(以在蔗糖溶液中完全溶胀时的重量增加百分数表示)被认为是藻酸盐水凝胶的最佳性质。通过离子交联藻酸钠与钙离子来制备藻酸盐水凝胶。水凝胶制备使用以下参数的总共27种不同组合：藻酸钠(na-alg)浓度(1%、1.5%和2%)，氯化钙(cacl2)浓度(0.5%、1%和2%)和交联时间(5分钟、15分钟和30分钟)(表1)。为了获得1%、1.5%或2%的na-alg溶液，分别将1g、1.5g或2g中等粘度的na-alg(sigmaaldrich,st.louis,mo,usa)在100ml去离子水中混合。在搅拌的同时将混合物逐渐加热至60℃以实现na-alg的完全溶解，随后冷却至室温。接下来，使用5ml注射器(bectondickinsonlabware,franklinlakes,nj,usa)将na-alg溶液加到交联剂：0.5%、1%或2%的cacl2(重量:体积)溶液中。通过100mmtygon管件(vincon柔性pvc管，内径9.5mm，外径12.7mm，壁厚1.7mm；saint-gobainperformanceplastics,gardengrove,ca,usa)从注射器逐滴分配na-alg溶液，该管件末端覆盖一块细织物(30mm×30mm)。这种改进允许在液滴分离并滴入交联溶液中之前在管末端处积聚相对大量(≈0.15ml)的na-alg溶液，从而使所形成水凝胶珠粒的尺寸最大化。在整个该过程中用磁力搅拌棒连续搅拌交联剂。最后，在5分钟、15分钟或30分钟后将所得水凝胶珠粒从cacl2溶液中滤出并用去离子水短暂冲洗以从表面去除交联溶液。

在用实验室纸巾(kimberly-clarkprofessional,roswell,ga,usa)轻轻去除多余的水分后，在分析天平(ae240,mettler-toledo,columbus,oh,usa)上对每个水凝胶珠粒称重。将该重量记录为“初始”重量。然后将每个珠粒浸入100ml25%(重量:体积)的蔗糖溶液中24小时(“调理”)。在24小时(24h)调理期后，从蔗糖溶液取出完全溶胀的珠粒并在用实验室纸巾去除表面上的过量水分后称重。将该重量记录为“最终”重量。每一处理重复十次。

使用单因素方差分析(anova)来评价不同制备参数(例如，na-alg浓度、交联剂浓度和交联时间)下的水凝胶重量增加百分数，以及不同制备参数的全因子交互作用。使用逐步多元线性回归分析确定变量的预测能力，该预测能力可解释重量增加百分数的回归模型中显著比例的方差(spssinc,2002)。

实验2：在模拟湿度条件下藻酸盐水凝胶珠粒的失水

阿根廷蚁在温暖的夏季表现出最高的觅食活动，同时更喜欢有灌溉的地方。因此，可将针对阿根廷蚁的藻酸盐水凝胶诱饵暴露于不同的湿度条件。由于诱饵基质中的水分含量将影响诱饵对觅食蚁的适口性，故了解藻酸盐水凝胶珠粒在若干现实湿度条件下的失水动力学是很重要的。为了模拟地表和大气的不同湿度条件，测试干燥或潮湿基底条件与三种不同相对湿度(rh)水平的六种不同组合。对在25%蔗糖溶液中调理的藻酸盐水凝胶珠粒称重并置于装在未加盖培养皿(直径100mm，高15mm)中的湿砂或干砂(40g,playsand,thequikreteinternationalinc.,atlanta,ga)的表面上。通过在搅拌的同时添加0.1g水每克砂来制备湿砂，从而提供10%(重量:重量)的水分水平(aceglass,inc.,vineland,nj,usa)。对于干砂处理，在不添加水的情况下使用砂。将含有水凝胶珠粒的砂皿放入含有500g硅胶(0-5%rh)、饱和mgcl2盐溶液(32%rh)或饱和nacl盐溶液(75%rh)的干燥器(直径240mm)中。将干燥器置于25.6℃的温育箱中。使用hoboux100检测器(onsetcomputercorp.,bourne,ma,usa)连续记录干燥器内的温度和湿度水平。在2小时(2h)、4小时(4h)、6小时(6h)、8小时(8h)和24小时(24h)时对水凝胶珠粒称重。称重之前小心去除附着在水凝胶表面上的砂粒。24h后，将所有水凝胶珠粒置于保持在0-5%rh水平下(硅胶)的干燥器中。每天对水凝胶珠粒称重直至出现连续相同的重量，这表明所有的水均已失去。初始水凝胶珠粒与完全脱水的水凝胶珠粒之间的重量差视为最初被水凝胶珠粒吸收的水的总量。使用水凝胶珠粒中的初始总水量来确定给定时间点的失水百分数。实验重复十次。使用反正弦平方根变换使失水百分数正态化。使用单向anova和tukey’shsd试验来比较每个时间点的平均失水百分数(spssinc,2002)。

实验3：使用部分脱水水凝胶基质的摄食选择研究

为了确定蚂蚁对处于不同干燥水平下的水凝胶珠粒的摄食反应，让蚂蚁选择四种不同干燥水平(失水0%、失水25%、失水50%和失水75%)下的水凝胶珠粒。为了制备失水25%、50%和75%的水凝胶珠粒，首先将藻酸盐水凝胶珠粒在25%蔗糖溶液中调理24小时，然后在干燥器内经受恒定的湿度条件(湿沙上0-5rh)，分别持续2.5小时(2.5h)、6.3小时(6.3h)和14.5小时(14.5h)(基于实验2，参见图1)。

从位于加州大学，riverside，ca的一个柑橘园连同它们的筑巢材料一起收集l.humile蚁群。通过将这些筑巢材料薄薄地铺在大木箱内来从土壤、落叶和碎屑引出蚂蚁。潮湿的灰泥巢位于箱子中央。随着筑巢材料变干，整个蚁群搬入灰泥巢中，随后将蚁群转移到保持在实验室中的塑料容器中。对于摄食选择研究，每个群体准备在一个聚乙烯容器(330mm×190mm×100mm)中，其内侧表面涂有teflon的薄膜(聚四氟乙烯悬浮液；bioquip,ranchodominguez,ca)以防止蚂蚁逃跑。每个群体由300只工蚁、两只蚁后和0.1g蚁雏组成。

在蚁群箱的底部上同时放置失水0%、25%、50%和75%的四种水凝胶珠粒(图2)。于5分钟、15分钟、30分钟、45分钟和60分钟时记录在水凝胶珠粒上摄食的蚂蚁的数量。使用五个不同的蚁群将实验重复五次。使用log10(x+1)变换将蚂蚁计数数据正态化。使用单向anova和tukey’shsd试验来比较每个时间段时在水凝胶基质上摄食的蚂蚁的数量(spssinc,2002)。

实验4：在含有噻虫嗪的液体诱饵中调理的藻酸盐水凝胶珠粒的表征

基于实验1的结果，选择1%na-alg溶液、0.5%cacl2溶液和5min交联时间来制备藻酸盐水凝胶珠粒。在从交联剂中取出并用去离子水冲洗后，使用cen-tech数字卡尺(harborfreighttools,camarillo,ca,usa)测量藻酸盐水凝胶珠粒的初始直径。还用分析天平测量珠粒的重量。然后将珠粒在100ml25%(重量:体积)的蔗糖溶液中调理24h，所述蔗糖溶液具有不同浓度的工业级噻虫嗪[0、0.00001%、0.00004%、0.00007%和0.0001%(重量:体积)]。所有溶液均用去离子水制备。作为阴性对照，将水凝胶珠粒在不含蔗糖和噻虫嗪的去离子水中调理。在24小时调理期后，从溶液中取出珠粒并使用实验室纸巾轻轻去除表面上的过量水分。测量完全溶胀的珠粒的直径和重量。该实验重复十次。使用单向anova和tukey’shsd试验来比较不同处理之间的直径增加百分数和重量增加百分数(spssinc,2002)。

使用扫描电子显微镜(sem)(feinovananosem450,feicorp.,or,usa)检查经调理的藻酸盐水凝胶珠粒的表面形貌。使用的加速电压为10kv。将水凝胶珠粒真空干燥并在sem之前涂覆金/钯。使用hitachitm-1000台式sem(tokyo,japan)观察水凝胶珠粒，无需真空干燥和涂覆金/钯。

实验5：水凝胶中噻虫嗪的量

为了确定来自水溶液的噻虫嗪是否被吸收到水凝胶基质中，估计水凝胶珠粒的外部和内部中噻虫嗪的量并使用酶联免疫吸附测定(elisa)进行比较。rust等人(2015)描述了该方法的细节。将藻酸盐水凝胶珠粒在100ml含有0.0001%(重量:体积)噻虫嗪的25%蔗糖溶液中调理。将对照水凝胶珠粒在25%蔗糖溶液中调理。在24h(24小时)调理期后，从溶液中取出水凝胶珠粒。使用干净的解剖刀从外部修剪水凝胶珠粒，留下小的内部立方体。称量每个部分的水凝胶珠粒(即，从表面修整下的片和从内部获得的立方体)的最终样品量，精确称取0.05g。将样品置于单独的1.5ml离心管中并向每个管中加入0.3ml蒸馏水。用塑料研杵将水凝胶样品均质并离心(thermoscientificiecmedilitemicrocentrifuge,waltham,ma,usa)5分钟。然后，移取4μl上清液并在996μl蒸馏水中稀释(稀释250倍)。使用市售的elisa试剂盒(thiamethoxamh.s.platekit,商品号20-0102,beaconanalyticalsysteminc.,saco,me)用byrne等人(2005)中描述的程序估计水凝胶样品中噻虫嗪的量。该实验重复四次。使用配对t-检验(spssinc,2002)比较水凝胶珠粒的外部和内部之间噻虫嗪的估计量。

实验6：实验室小蚁群试验

用实验室阿根廷蚁群测试含有若干不同浓度噻虫嗪的藻酸盐水凝胶诱饵的功效。每个实验蚁群有得自主要储备蚁群的300只工蚁、两只蚁后和0.1g蚁雏(卵、幼虫和蛹的混合物)。将实验蚁群保持在聚乙烯容器(330×190×100mm)中，容器内侧表面涂有teflon的薄膜以防止它们逃跑。带有四个小入口孔、含折叠瓦楞纸(140×60mm)的培养皿(直径100mm，高15mm)充当人工巢址。一周向蚂蚁提供一次水、25%蔗糖溶液、刚杀死的蟑螂和金枪鱼罐头。在进行实验之前让蚁群适应七天。在诱杀前三天从蚁群箱中取走所有食品。

用四种不同的噻虫嗪比率测试藻酸盐水凝胶诱饵的功效。将藻酸盐水凝胶珠粒在含有0.00001%、0.00004%、0.00007%或0.00010%(重量:体积)工业级噻虫嗪(sigmaaldrich,st.louis,mo)的25%蔗糖溶液中调理。将三个新制备的水凝胶珠粒置于蚁群箱的底部上。向对照性蚁群提供在25%蔗糖溶液中调理的藻酸盐水凝胶珠粒。在处理后24h，重新给实验蚁群分配其正常食品。

从各个角度拍摄的人工巢址的照片，计数在处理后1天、3天、5天、7天和14天时活着的蚁后和工蚁的数量。还在这些时间点测量蚁雏的重量。在实验蚁群中，蚁雏通常在人工巢址内部发现。该实验重复五次。在分析之前，对工蚁和蚁后数量及蚁雏重量的减少百分数作反正弦平方根变换。使用单向anova分析数据。然后用tukey’shsd试验(spssinc,2002)分离平均值。(表5和6)。

实验7：现场功效试验

2016年7月28日至9月23日在美国加州河滨市于五处住宅测试含有0.0001%噻虫嗪[基于实验室研究的最有效浓度(见“结果”)]的藻酸盐水凝胶诱饵的功效。所有地点都有阿根廷蚁为主要害虫蚂蚁。

为了增大藻酸盐水凝胶诱饵的生产规模以用于现场实验，使用100喷嘴淋浴头(akdyaz-60218英寸浴室铬淋浴头，美国加州)产生1%na-alg溶液的液滴。将na-alg溶液缓慢倒入与淋浴头相连的大漏斗(直径15mm)中，并将来自淋浴头的na-alg溶液液滴收集在具有0.5%cacl2交联剂溶液的塑料容器(381×292×152mm)中。漏斗加淋浴头由夹子固定在铁架台上。在整个该过程中用玻璃棒连续搅拌交联剂以防止形成的珠粒彼此粘附。过滤出由5lna-alg溶液制备的所得藻酸盐水凝胶珠粒并在5l具有0.0002%噻虫嗪的50%蔗糖溶液中调理24h。认为在24h调理期结束时，水凝胶珠粒内部和外部的噻虫嗪和蔗糖溶液的浓度达到平衡，这产生含有约25%蔗糖溶液和约0.0001%噻虫嗪的藻酸盐水凝胶诱饵。将水凝胶诱饵从液体诱饵中筛出并贮存在4±1℃和20±5%rh的冰箱中的塑料罐中直至使用。

每个实验位点用约1kg水凝胶诱饵以10g/m²的施用率处理。在距离建筑物5m内及在蚂蚁活动踪迹上施用约20堆水凝胶诱饵，每一堆由约50g藻酸盐水凝胶诱饵组成。基于蚂蚁在24h期间摄食的蔗糖溶液的量来估计处理前后阿根廷蚁的觅食活动水平。在每个监测日，在沿着每栋房子的周边均匀分布的10个不同点处放置总共20个监测管(15mlfalcon塑料管，bdbioscience,sanjose,ca,usa)，每个管含有12ml25%的蔗糖溶液。在每个点处放置一组两个管，开口端支撑在两个lincolnlogs™的凹口中并用花盆(直径155mm，高115mm)覆盖以保护管使之免受喷灌、宠物、降水和阳光的影响。通过测量24h内管的初始重量和最终重量之间的差异并然后校正蒸发量来确定被蚂蚁摄食的蔗糖溶液的量。蒸发量校正基于的是来自另一组监测管的重量损失，这些监测管在美国加州河滨市的另一位点放置24小时，在该位点，蚂蚁无法进入。根据以往的研究，阿根廷蚁每次访问平均摄食0.3mg蔗糖溶液。基于该假设，估计每个管的蚂蚁访问次数，并使用两个管之间的平均值进行进一步分析。在处理前1天及处理后第1周、第2周和第4周监测现场位点。在第4周监测后立即用水凝胶诱饵进行第二次处理，并在处理后第5周、第6周和第8周(从在位点处第一次处理部署的日期算起)进一步监测位点。第二次施用的每个位点部署的藻酸盐水凝胶诱饵的量和施用方法与第一次施用相同。

根据拿起时对监测管的目视检查，在整个实验期间只发现阿根廷蚁在监测管中觅食。对所有监测日在每个位点记录的平均蚂蚁访问次数作平方根变换以满足正态假设。将每个处理后监测日的蚂蚁访问次数与处理前的水平加以比较，配对t检验的显著性水平为0.05。

结果

实验1：设计具有最佳性质的藻酸盐水凝胶

单因素方差分析揭示，na-alg浓度(f=124.2;df=2,p<0.05)、cacl2浓度(f=1612.1;df=2,p<0.05)和交联时间(f=1058.6;df=2,p<0.05)对水凝胶重量增加百分数的影响在统计学上是显著的(表2)。此外，在这三个因素之间观察到显著的相互作用(f=27.1;df=8,p<0.05)(表2)。采用na-alg浓度、cacl2浓度和交联时间的影响的水凝胶重量增加百分数的多元线性回归分析分别给出r=0.141、r=-0.661、r=-0.529的相关系数，揭示了所有影响都是显著的(p<0.05)。对该线性关系建模的回归方程为y=352.580–150.662x1–7.317x2+49.000x3(r²=0.737,f=248.877,df=3,266,p<0.05)，其中x1=cacl2浓度，x2=交联时间，x3=na-alg浓度且y=水凝胶重量增加百分数，意味着cacl2浓度和交联时间增加一单位将分别使水凝胶重量增加百分数减小150.662和7.317%。另一方面，na-alg浓度增加一个单位会使水凝胶重量增加百分数增加49.000%。因此，选择0.5%cacl2溶液的配方与5min的交联时间，因为其在蔗糖溶液中调理时产生具有最高重量增加百分数的珠粒。然而，选择1%na-alg溶液的配方而不是2%，因为1%na-alg溶液产生坚固的球形珠粒，在蔗糖溶液中调理时该水凝胶珠粒不会崩解。

实验2：在模拟湿度条件下藻酸盐水凝胶珠粒的失水

将在25%蔗糖溶液中调理的水凝胶基质于六种不同的湿度条件(干砂基底vs.湿砂基底及大气中0%、32%和75%rh)的组合下暴露24h。对于最初的前8小时，在0%和32%rh下保持于湿砂基底上的水凝胶珠粒彼此之间没有显著差异；在0%和32%rh下保持于干砂基底上的水凝胶基质之间也没有发现显著差异(2h,f=44.85,df=5,54,p<0.05;4h,f=71.12,df=5,54,p<0.05;6h,f=102.58,df=5,54,p<0.05;8h,f=97.00,df=5,54,p<0.05)(图1)。与整个实验期间的所有其他处理相比，在75%rh下保持于湿砂基底上的水凝胶基质具有最低的失水百分数(p<0.05)(图1)。

实验3：对部分脱水水凝胶基质的摄食选择研究

总的来说，所有水凝胶基质对阿根廷蚁都具有吸引力，因为觅食工蚁在将水凝胶基质引入给蚁群后立即开始以它们为食(图2)。然而，在整个实验期间的所有时间段，在失水0%和25%的水凝胶基质与失水50%和75%的水凝胶基质之间都发现在水凝胶基质上觅食的工蚁数量的显著差异(p<0.05)(图3)。

实验4：在含有噻虫嗪的液体诱饵中调理的藻酸盐水凝胶珠粒的表征

得到的ca-alg水凝胶珠粒形成直径范围在5.81±0.05mm至6.00±0.05mm之间的球形形状(表3)。然而，在调理期后，珠粒显著溶胀，直径增加至8.84±0.06mm至10.00±0.06mm(表3)。而在蔗糖溶液中调理的珠粒的平均直径增加百分数无一在统计学上不同(p<0.05)。但是，在去离子水中调理的珠粒的平均直径增加百分数显著大于在25%蔗糖溶液中调理的珠粒的平均直径增加百分数(p<0.05)(表3)。

交联后，本工作中使用的所有水凝胶珠粒的初始重量为0.14g(表3)。调理后，它们的最终重量范围在0.48±0.00g至0.57±0.01g之间(表3)。有趣的是，与发现的平均直径增加百分数相似，在蔗糖溶液和去离子水中调理的水凝胶珠粒之间记录到了重量增加百分数的显著差异(p<0.05)。然而，无论是否存在杀虫剂，在这些蔗糖溶液中调理的水凝胶珠粒都具有相似的重量增加百分数(p<0.05)，这进一步支持了液体诱饵中的噻虫嗪不影响水凝胶珠粒的水合作用的观点(表3)。

扫描电子显微镜揭示，湿的水凝胶珠粒在24h调理期后具有几乎光滑的凝胶表面结构而无可见的孔隙(图4a)；真空干燥的藻酸盐水凝胶珠粒具有少许小孔隙并且一些褶皱打开成细长的孔隙，大小估计为大约(≈)50µm(图4b和4c)。

实验5：水凝胶中噻虫嗪的量

噻虫嗪在整个藻酸盐水凝胶基质中均匀地迁移。对于藻酸盐水凝胶基质的表面和内部，每克水凝胶的噻虫嗪估计量分别为1539.77±93.05ng和1214.28±50.69ng(平均值±sem)。它们没有显著差异(t=2.27,df=3,p=0.11)。尽管通过elisa检测到低水平的吸光度(25.46±2.99和12.29±0.62)，但吸光度值可忽略不计并可能由较小的基质效应引起。

实验6：实验室小蚁群试验

藻酸盐水凝胶诱饵在受试的噻虫嗪浓度(0.00001-0.0001%)下提供了对阿根廷蚁工蚁的有效控制。在第1天，在所有处理和未处理的蚁群之间没有观察到工蚁减少百分数的显著差异(p<0.05)。在第3天，记录到了与对照性蚁群相比用两种较高浓度的噻虫嗪处理的蚁群的工蚁减少百分数的显著差异(p<0.05)。此外，在第5天，记录到了与对照性蚁群相比所有经处理的蚁群的工蚁减少百分数的显著差异(p<0.05)。用在0.0001%、0.00007%和0.00004%的噻虫嗪中调理的水凝胶诱饵处理的蚁群别在第5天、第7天和第14天实现工蚁的完全死亡(表4)。

水凝胶诱饵提供了对蚁后和蚁雏的有效控制。从第3天开始，在用在0.0001%的噻虫嗪中调理的水凝胶诱饵处理的蚁群中记录到了蚁后和蚁雏减少百分数与对照物相比的显著差异(p<0.05)。另外，在第7天，记录到了与对照性蚁群相比所有经处理的群体的蚁后和蚁雏减少百分数的显著差异(p<0.05)。在含有0.00004-0.0001%的噻虫嗪的25%蔗糖诱饵中调理的水凝胶诱饵在第7天提供了蚁后的100%死亡率，并在第14天提供了蚁雏的100%死亡率(表5和6)。

实验7：现场功效试验

在整个实验期间，所有处理后监测日对监测管的平均蚂蚁访问量均显著低于其各自的处理前估计值(第1周,t=3.6,df=4,p=0.023;第2周,t=3.6,df=4,p=0.022;第4周,t=4.4,df=4,p=0.012;第5周,t=5.7,df=4,p=0.005;第6周,t=3.7,df=4,p=0.020;第8周,t=6.9,df=4,p=0.002)。对于处理后的前两周，水凝胶诱杀提供了很大变化的控制功效，蚂蚁访问量减少7.8%至65.1%。平均而言，在处理后第4周和第6周之间记录到蚂蚁访问量减少了61-72%，其中一个位点在第4周时显示出88%的减少。在处理后第8周结束时，与相应的处理前数据相比，蚂蚁访问量减少了64-91%。平均而言，这相当于蚂蚁访问量总体减少了79%。

讨论

藻酸盐是广泛分布于自然界中的多糖。它们由不同比例和顺序的(1-4)-连接β-d-甘露糖醛酸(m)和α-l-古洛糖醛酸(g)单体组成。ca-alg通过在交联剂分子(钙离子)和官能团(来自沿着藻酸盐聚合物链延伸的古洛糖醛酸残基的嵌段的羧基基团)之间形成三维网络结构而产生。根据一个示例性实施方案，由海藻制成的藻酸盐水凝胶基质可用作农业、天然和城市环境中的液体诱饵递送系统，因为它们可生物降解、无毒、成本有效并可商购获得用于大规模操作。

在本公开中，水凝胶基质制备条件如na-alg浓度、交联剂浓度和交联时间显著影响在蔗糖溶液中调理后的水凝胶重量增加百分数。使用水凝胶初始和最终重量来计算水凝胶重量增加百分数，其中水凝胶基质的初始重量在从交联溶液中取出水凝胶基质并用去离子水冲洗后记录。观察到，在蔗糖溶液中调理之前在室温或真空烘箱中干燥水凝胶基质数小时(例如，通过将它们在室温或真空烘箱中暴露数小时直至数天)可能影响它们的重量增加百分数(数据未发表)。因此，在交联并用去离子水冲洗后立即在蔗糖溶液中调理水凝胶珠粒；在24h调理期后记录水凝胶珠粒的最终重量。随着na-alg浓度因聚合物量的增加而增加，水凝胶重量增加百分数也增加。然而，在本研究中，在用较高浓度的na-alg(1.5%和2%)产生的那些水凝胶珠粒中的一些在蔗糖溶液中调理后崩解。由具有较高浓度的聚合物溶液产生的水凝胶基质每单位量的水凝胶将含有更多的聚合物，这可允许其吸收更大量的水。结果，由于过度水合，聚合物网络在24h调理期后可能不能支撑体积的增加而崩解成小碎片。因此，使用1%的na-alg以产生坚固的球形形状珠粒。另一方面，当交联剂浓度从0.5%增至2%和当交联时间从5分钟增至30分钟时，水凝胶重量增加百分数减小。交联剂浓度(钙离子浓度)和交联时间的增加导致珠粒交联密度的增加，使刚性增加，从而降低水凝胶重量增加百分数。交联密度的增加将减小目数和孔隙大小，因此抑制水分子渗透通过聚合物网络结构和对水分子的吸收并随后影响引入的化合物从水凝胶诱饵的释放。因此，在本研究中使用0.5%的交联剂和5min的交联时间。

本公开还基于27种不同的制备条件组合提供了对回归模型的有用洞悉，这可有助于针对各种应用制造具有不同重量增加百分数的藻酸盐水凝胶珠粒，使得它们用途广泛。例如，对于大规模诱杀程序，通过在大容器中混合/浸渍特定浓度的na-alg和cacl2，也可容易地形成ca-alg水凝胶基质。已探索了备选的凝胶形成水胶体如明胶来包裹和递送针对阿根廷蚁的糖液诱饵。明胶将形成热可逆的双组分凝胶(例如，明胶和水)。另一方面，藻酸盐水凝胶为三组分体系(例如，藻酸盐、水和盐)，其中第三组分可以受控的方式添加以产生具有所需重量或尺寸量级的珠粒，这可影响引入的化合物从水凝胶的释放。此外，明胶具有35℃的低熔融温度。与明胶相反，藻酸盐水凝胶是热不可逆的，例如，是热稳定的。因此，藻酸盐具有优于明胶的优点，并且具有在世界各地的温暖地区(包括热带地区)使用的潜力。然而与明胶一样，藻酸盐水凝胶在施用于土壤表面时会经由物理、化学和生物过程发生降解。

以往的研究寻求通过在珠粒合成过程中通过在na-alg溶液中添加杀虫剂来引入杀虫剂如西维因和毒死蜱而包封农业杀虫剂。相比之下，本研究的珠粒是先形成珠粒而后通过在已知浓度的蔗糖基液体诱饵中调理它们而加载以诱饵溶液。由于大多数害虫蚂蚁天然适应以含糖液体为食，因此毫无疑问，基于糖的液体蚂蚁诱饵将成为城市、农业和自然环境中害虫蚂蚁管理的理想选择。在本公开中，珠粒充当液体诱饵的载体，设计用于在完全溶胀后对蚂蚁进行诱饵的施用。因此，我们的新型诱饵制造方法可被认为首次提供可生物降解的含杀虫剂的蔗糖基藻酸盐水凝胶基质以用作针对蚂蚁的液体诱饵递送系统的。

本公开还提供了关于藻酸盐水凝胶基质的与不同大气和基底湿度条件相关的失水百分数的有用数据，因为发现失水量取决于环境中的这些参数。在商业果园接受定期灌溉时，使用湿砂来模拟灌溉时的湿土壤表面(personalcommunication)。在湿/干砂中，水凝胶基质在0%和32%rh的大气湿度下的失水动力学表明，除非大气湿度≥75%rh，否则在前8h基底湿度与大气湿度水平相比更具影响力(图1)。因此，通过增加基底(即土壤)的湿度水平来减缓水凝胶诱饵通过蒸发失水是至关重要的，从而增加水凝胶诱饵保持其对蚂蚁的吸引力的窗口期。这可通过在现场的湿土壤上施用水凝胶诱饵来实现。因此，未来的研究可在具有受控灌溉的现场进行。

从失水研究中的发现可以推断，藻酸盐水凝胶基质能够从基底(例如，砂)吸收水分，并且作为诱饵更长时间地保持其对蚂蚁的吸引力和适口性以及保持有效性。接下来，我们寻求通过让蚂蚁选择具有不同失水量的水凝胶基质来确切地确定随着水凝胶基质失去其水分含量藻酸盐诱饵对蚂蚁保持多长时间的吸引力。结果表明，当通过干燥失去≥50%的水时，水凝胶基质失去了其对阿根廷蚁的吸引力(图3)，这与rust等人(2015)的研究结果有一些相似之处。观察到水凝胶基质随着时间的推移逐渐失去水分，但在向蚁群引入水凝胶基质后数小时仍然具有吸引力。可在水凝胶失去过多水分之前增强觅食蚁对诱饵的初始发现和摄食。可向藻酸盐水凝胶诱饵中引入阿根廷蚁信息素以减少初始诱饵发现时间。

根据对水凝胶珠粒表面形貌的观察，在湿水凝胶珠粒上未发现孔隙(图4a)。然而，认为湿水凝胶珠粒具有孔隙，其吸收水凝胶基质中吸收的水，该孔隙与在真空干燥的水凝胶珠粒上观察到的那些孔隙相似(图4b和4c)。然而，它们在低放大倍数(80x)sem下不可见，因为在sem上的高放大倍数可能使新鲜的湿水凝胶珠粒暴露于更长时间的真空下，这可能损害/改变水凝胶珠粒的表面(个人观察)。

噻虫嗪是一种新烟碱类杀虫剂，其作为烟碱型乙酰胆碱受体激动剂作用于昆虫的中枢神经系统。它是目标位点选择性的，对害虫具有高功效，而对哺乳动物、无脊椎动物和鱼类是安全的。应指出，它不会刺激皮肤或眼睛。根据一个示例性实施方案，由于其在25℃下具有4.1g/l的较高水溶性——在蔗糖水溶液中配制杀虫剂时最重要的性质之一，故以噻虫嗪作为用于在蔗糖溶液中制备的水凝胶诱饵开发的候选杀虫化合物进行了测试。应指出，在24h调理期间，实现在水凝胶基质内已含的水与周围的蔗糖基液体诱饵之间的水溶液的完全替换是至关重要的。在本研究中，elisa试验揭示，液体诱饵和杀虫剂的活性成分具有均匀扩散通过整个水凝胶基质的能力，表明当蚂蚁从水凝胶表面吮吸时，噻虫嗪将持续可及。此外，从elisa试验获得的水凝胶基质中噻虫嗪的量与用来调理水凝胶基质的0.0001%噻虫嗪液体诱饵的量几乎相似，表明新制得的水凝胶珠粒中的液体通过扩散被蔗糖-噻虫嗪溶液有效地替换并可能在24小时调理期间达到平衡。

以往的研究表明，0.001%的液体噻虫嗪在城市环境中成功地减少了阿根廷蚁。据报道，用0.0007%的噻虫嗪液体诱饵调理的聚丙烯酰胺水凝胶在实验室研究和在商业化李子园进行的现场研究中都提供了有效的阿根廷蚁控制。boser等人(2014)在聚丙烯酰胺水凝胶中使用0.0006%的噻虫嗪成功地减少了自然环境中的入侵阿根廷蚁群。提供在1至4天内的觅食工蚁的lt50的诱饵被认为具有延迟毒性作用，以允许诱饵有足够的时间在整个群体中递送。快速作用的有毒物将减少踪迹的建立和保持，因为工蚁可能很快死亡。rust等人(2004)报道，宽浓度范围的噻虫嗪浓度(0.00001-0.005%)的液体诱饵在14天的时间内提供了实验室蚁后和工蚁群体的完全死亡。本研究表明甚至更低的噻虫嗪浓度(0.00010-0.00001%)也可杀灭蚁后，尽管其已经由交哺行为得到稀释。这是因为噻虫嗪具有宽的(10至1000倍)延迟毒性浓度范围。此外，在所有噻虫嗪浓度下调理的藻酸盐水凝胶诱饵都不具有排斥性；在引入藻酸盐水凝胶诱饵后数分钟内就形成蚂蚁踪迹。然而，在第14天，在对照性群体中记录到21.20±2.78%的工蚁死亡率。我们在对照性群体中记录到的死亡率百分数低于rust等人(2015)的死亡率百分数，rust等人在对照性群体中于第8天记录到32.6%的工蚁死亡率。另外，choe和rust(2008)在第7天记录到8-10%的蚂蚁死亡率，这与本研究中第14天的结果相当。

本研究中选择工业级噻虫嗪而不是optigard蚂蚁凝胶诱饵，因为前者具有更高的水凝胶重量增加百分数和更低的成本。在本研究中，需要极低浓度的工业级噻虫嗪来减少蚂蚁种群。通过使用水凝胶基质作为递送系统，可以用与常规施用噻虫嗪所需相比至多百分之一的噻虫嗪量实现对现场阿根廷蚁种群的有效控制。另外，使用藻酸盐水凝胶基质来递送液体诱饵将通过消除合成水凝胶化合物的积累来减少不期望的环境影响，同时使得使用极小量的杀虫剂实现有效的蚂蚁管理成为可能。尽管在几个性质方面与聚丙烯酰胺水凝胶相当，但它不会在环境中留下任何潜在的有毒单体。旨在确定藻酸盐水凝胶诱饵作为针对阿根廷蚁种群的液体诱饵的替代递送系统在现场条件下的失水速率和功效的未来研究正在进行中。未来可进行试验以探索藻酸盐水凝胶基质在贮存和递送除噻虫嗪外还含有其他活性成分的液体诱饵中的有效性。使用藻酸盐水凝胶基质来贮存和递送液体诱饵可能潜在地改变液体诱饵用于自然、农业和城市环境中害虫蚂蚁管理的方式。

然而，本发明不限于上文描述及附图中示意的实施方案和变型。在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可实现各种改变、修改和等同物，本发明的精神和范围在附随的权利要求中限定。明确的是，落在权利要求范围内的所有这些改变、修改和等同物都被权利要求所涵盖。