长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂的制作方法

技术领域

本发明涉及一种长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂以及制备所述制剂的方法，所述液体制剂包括药学有效量的长效促胰岛素分泌肽缀合物和不含白蛋白的稳定剂，其中生理活性肽是促胰岛素分泌肽，所述生理活性肽与免疫球蛋白Fc区相连；其中所述稳定剂包括缓冲剂、糖醇、非离子表面活性剂和等渗剂。

背景技术：

糖尿病是由多种致病因素引起的疾病，并且通常存在两种类型的糖尿病。患有I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的患者很少产生或不能产生胰岛素，胰岛素是调节碳水化合物的利用的激素。患有II型糖尿病或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)的患者与不患有糖尿病的患者相比显示相同或增加的血浆胰岛素水平。然而，II型糖尿病患者在主要的对胰岛素敏感的组织即肌肉、肝和脂肪组织中形成对胰岛素刺激的葡萄糖和脂质代谢的抗性。尽管血浆胰岛素水平可增加，但其不足以克服明显的胰岛素抗性，由此引起高血糖症。持续的或不受调节的高血糖症与增加的早期发病率和死亡率相关。血糖水平的异常增加常常直接地和间接地与和脂质、脂蛋白、脱脂载脂蛋白等的代谢有关的疾病中的代谢和血液动力学变化相关。例如，II型糖尿病患者发生冠心病、中风、周围性血管疾病、高血压、肾病、和神经病以及巨大血管瘤和微血管并发症的风险特别高。

目前使用的用于治疗II型糖尿病的疗法包括施用外源性胰岛素、口服药物、饮食疗法和运动疗法。在2005年，艾塞那肽(exenatide)(毒蜥外泌肽(exendin)-4:)被FDA批准为用于甚至服用二甲双胍(metformin)和/或磺酰脲也不能获得适宜的葡萄糖调节的II型糖尿病患者的补充疗法。

艾塞那肽(毒蜥外泌肽-4)是强GLP-1受体激动剂并且在蜥蜴的唾液腺中产生。毒蜥外泌肽-4表现出对胰岛素的亲和性，抑制摄食和胃排空，并且在啮齿动物中表现出对β-细胞的亲和性(Parks等人,Metabolism.50:583-589,2001；Aziz和Anderson,J.Nutr.132:990-995,2002；和Egan等人,J.Clin.Endocrinol.Metab.87:1282-1290,2002)。另外，当甘氨酸存在于毒蜥外泌肽-4的N-末端的2位时，不像GLP-1，其不是DPPIV的底物。使用艾塞那肽的缺点是半衰期(t1/2)短，仅为2-4小时，因此不得不每天注射两次(Kolterman等人,J.Clin.Endocrinol.Metab.88:3082-3089,2003和Fineman等人,Diabetes Care.26:2370-2377,2003)。

类似上述艾塞那肽的肽类由于稳定性低而容易被身体中的蛋白酶变性或降解并丧失活性。此外，艾塞那肽的尺寸相对小，因此容易被肾脏清除。因此，含有肽类作为药学活性成分的药物不得不频繁施用于患者以便维持其目标血清水平和效价。大多数情况下，肽药物以注射液的形式以高的频率施用于患者以维持生理活性肽的血清水平，但这导致患者很多疼痛。

已经进行了许多尝试来解决这些问题，其中之一是将肽药物经口或经鼻吸入通过增加肽药物的生物膜渗透性来递送至身体。然而，这种方法与注射液相比将肽递送至身体的效率显著低。因此，在体内将肽药物的活性维持在所需要的水平仍然存在许多限制。

同时，一直不断地尝试通过提高肽药物在血液中的稳定性并长时间地维持血液中高的药物水平来使药物的疗效最大化。肽药物的这些长效制剂应当促成肽药物的增加的稳定性并且还维持药物本身足够高的效价，而不诱发患者的免疫反应。

作为稳定肽并防止蛋白酶降解肽的方法，已经进行了许多尝试以改变对蛋白酶敏感的特定氨基酸序列。例如，通过降低血糖水平而有效治疗II型糖尿病的GLP-1(7-37或7-36酰胺)的半衰期短至低于4分钟(Kreymann等人,1987)。短半衰期是由于通过二肽基肽酶IV(DPP IV)在GLP-1的第8氨基酸(Ala)和第9氨基酸(Asp)之间的肽裂解引起GLP-1的效价丧失所导致。因此，在开发对DPP IV具有抗性的GLP-1衍生物中已经进行了许多研究，并且在这些研究中，Ala⁸被Gly置换(Deacon等人,1998；Burcelin等人,1999),或被Leu或D-Ala置换(Xiao等人,2001)以增加对DPP IV的抗性，同时维持肽活性。此外，GLP-1的N-末端氨基酸His⁷是GLP-1活性的重要氨基酸并且也是DPP IV的靶标，因此在US 5,545,618中，N-末端被烷基或酰基取代。同样，在Gallwitz等人中，His⁷是N-甲基化或α-甲基化的，或整个His被咪唑取代以增加肽对DPP IV的抗性同时维持生物活性(Baptist Gallwitz等人,Regulatory Peptides 86,103-111,2000)。

除了这些变体以外，艾塞那肽(毒蜥外泌肽-4,US 5,424,686)是从吉拉毒蜥(glia monster)的唾液腺纯化的GLP-1衍生物，其具有对DPP IV的抗性和比GLP-1更高的生物活性，从而在体内具有2-4小时长的半衰期，该半衰期比GLP-1长很多。然而，仅仅通过增加肽对DPP IV的抗性不能得到足够的体内生物活性持续时间。例如，目前可得到的毒蜥外泌肽-4(艾塞那肽)不得不对患者通过注射而一天给药两次，这给患者带来过多的负担。

这些促胰岛素分泌肽的局限性在于肽的尺寸太小以致不能收集在肾脏中，因此其很容易丢失至体外。因此，为了防止肽在肾中的损失，已经将高度可溶的大分子诸如聚乙二醇(PEG)连接至肽的表面。

PEG非特异性地结合至靶肽的特定位点或多个位点并且增加肽的分子量，然后防止肽在肾中的丢失和肽的水解，而不引起副作用。例如，WO2006/076471公开了通过将PEG连接至B-型利尿钠肽(BNP)，BNP通过结合至NPR-A激活cGMP的产生并降低动脉内血压，由此有效地作为充血性心力衰竭的治疗剂，BNP的生物活性可以得到保持。同样，US 6,924,264描述了一种通过将PEG连接至毒蜥外泌肽-4的赖氨酸残基来增加毒蜥外泌肽-4的体内持久性的方法。然而，尽管这些方法可以通过增加PEG分子量来延长肽药物的体内持久性，但随着PEG分子量的增加，肽药物的效价显著减小，并且PEG与肽的反应性也下降，由此降低了收率。

作为增加生理活性肽的体内稳定性的另一种方法，已经开发了一种制备融合蛋白的方法，其中肽和生理活性蛋白质的基因通过基因重组连接在一起，并且培养利用该重组基因转化的细胞。例如，以前报道了产生毒蜥外泌肽-4的融合蛋白，其中毒蜥外泌肽-4通过多肽接头与转铁蛋白(Tf)融合(韩国专利申请号10-2009-7003679)。此外，作为一种使用免疫球蛋白的方法，以前还公开了一种其中GLP-1衍生物与IgG4Fc融合的GLP-1衍生物的融合蛋白(韩国专利申请号10-2007-7014068)。

近年来，作为可以促成活性的最小减少和增加的稳定性的长效蛋白质和肽药物制剂，在韩国专利登记号10-0567902(具有提高的体内持久性的生理活性多肽缀合物)和韩国专利登记号10-0725315(使用免疫球蛋白片段的蛋白复合物及其制备方法)中公开了通过将免疫球蛋白Fc区、非肽基聚合物和生理活性多肽结合生成的缀合物。

通过上述方法，可以将促胰岛素分泌肽作为用于制备长效促胰岛素分泌肽缀合物的生理活性多肽应用(韩国专利登记号10-2008-0001479)。为了制造包含长效促胰岛素分泌肽缀合物的药物，至关重要的是在维持体内功效的同时防止生理化学变化诸如热诱导的变性、聚集、吸附或在储存和递送过程期间由光、热或添加剂中的杂质引起的水解。特别地，与促胰岛素分泌肽本身相比，长效促胰岛素分泌肽缀合物具有较大的体积和分子量，因此其难以稳定化。

通常，蛋白质和肽的半衰期短，并且当暴露于不适宜的温度、水-空气界面、高压、物理或机械应力、有机溶剂和微生物污染时可能经历变性，诸如单体的聚集、聚集引起的沉淀和吸附到容器的表面。变性的蛋白质和肽丧失了它们的固有生理化学性质和生理活性。由于在大多数情况下蛋白变性是不可逆的，因此变性的蛋白质和肽不能恢复它们固有的性质。此外，有可能的是，蛋白质是不稳定的并容易受外部因素诸如温度、湿度、氧、紫外线影响，因此它们经历物理或化学变化，包括聚集、聚合或氧化，由此丧失活性。

此外，吸附的蛋白质和肽当变性时易于聚集，并且当聚集的蛋白质和肽被引入至体内时，它们可能引起抗体形成。因此必须施用足够稳定的蛋白质和肽。就此而言，已经开发了多种方法来防止蛋白质和肽在溶液中的变性(John Geigert,J.Parenteral Sci.Tech.,43,No5,220-224,1989,David Wong,Pharm.Tech.October,34-48,1997,Wei Wang.,Int.J.Pharm.,185,129-188,1999,Willem Norde,Adv.Colloid Interface Sci.,25,267-340,1986,Michelle等人,Int.J.Pharm.120,179-188,1995)。

为了制备一些蛋白质和肽药物，已经使用冻干工艺来解决稳定性问题。然而，此工艺的不便在于冻干产品不得不在使用前再次溶解在溶剂中以用于注射，并且其需要大规模投资，诸如由于在制造过程中涉及冻干工艺，因此使用大量的冻干剂。可选地，也已经使用采用喷雾干燥剂的制粉方法。然而，此方法由于低的产物收率而具有低的经济价值，并且由于蛋白质暴露于高温而可能对产物稳定性带来负面影响。

作为解决这些局限性的可选方式，其他研究试图向溶液中的蛋白质和肽添加稳定剂以防止长期储存期间蛋白药物的生理化学变化，同时维持其体内功效。一种蛋白质，人血清白蛋白，已经被广泛用作稳定剂用于各种蛋白质药物，并且其功效已经被证实(Edward Tarelli等人,Biologicals(1998)26,331-346)。

人血清白蛋白的纯化涉及生物学污染物诸如支原体、朊病毒、细菌和病毒的灭活，或一种或多种生物学污染物或病原体的筛选或检验，但即使具有这些过程，那些污染物可能仍然不能被完全去除或灭活。因此，当施用人血清白蛋白时，患者可能暴露于这些生物学污染物或病原体。例如，尽管筛选过程涉及检查供体血样中的某些病毒，但检验过程不总是可靠的，并且可能不能检验出小量存在的某些病毒。

由于它们的化学差异，在储存期间不同的蛋白质可能在不同的条件下以不同的速率逐渐灭活。即，对于不同的蛋白质，稳定剂对储存期的延长是不同的。为此，用来提高蛋白质的储存稳定性的稳定剂的合适比率、浓度和类型取决于靶蛋白的生理化学性质而变化。此外，当不同的稳定剂一起使用时，由于竞争相互作用和副作用，它们可能诱发与那些所需的效应不同的不良反应。而且，在储存期间，储存的蛋白质的性质或其浓度可能发生变化，由此导致不同的效应。

因此，花费了大量的努力和谨慎的措施来稳定化溶液中的蛋白质。特别地，具有提高的体内持久性和稳定性的长效促胰岛素分泌肽缀合物具有与免疫球蛋白Fc区结合的促胰岛素分泌肽的形式，并且因此其与通常的促胰岛素分泌肽相比具有显著不同的分子量和体积。因此，需要特殊的组合物来稳定化蛋白质。而且，促胰岛素分泌肽和免疫球蛋白Fc区在生理化学上是不同的肽或蛋白质，因此它们必须被同时稳定化。然而，如上所述，由于其生理化学差异，不同的肽或蛋白质在储存期间在不同的条件下可能以不同的速率逐渐灭活。而且，当适合于每一种肽或蛋白质的稳定剂一起使用时，由于竞争相互作用和副作用，它们可能诱发与所需效应不同的不良反应。因此，对长效促胰岛素分泌肽缀合物，很难找到一种可以同时稳定化促胰岛素分泌肽和免疫球蛋白Fc区两者的稳定剂组合物。

近年来，已经开发了可以反复为患者方便使用的蛋白质和肽的制剂。然而，多次使用制剂必须含有防腐剂以防止反复给药后和丢弃前的微生物污染。含有防腐剂的多次使用制剂与单次使用制剂相比有少许优点。例如，对于单次使用制剂，根据剂量的差异会废弃大量的药物。但通过使用多次使用制剂，可以减少废弃的产品的量。此外，多次使用制剂可以使用数次，而不用担心某段时期内的微生物生长，并且由于其可以在单个容器中提供，可以使包装最小化，从而得到经济益处。

然而，防腐剂的使用可能影响蛋白质稳定性。使用防腐剂中最众所周知的问题是沉淀问题。蛋白质的沉淀可能降低药物的疗效，并且当施用于身体时其可能引起无法预期的免疫应答。因此，选择维持防止微生物污染的能力同时不影响蛋白质稳定性的防腐剂的类型和合适的浓度是十分重要的。

技术实现要素：

技术问题

为了努力提供可以长期储存长效促胰岛素分泌肽缀合物而没有病毒污染的危险的稳定的长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂，本发明发现通过使用包括缓冲剂、糖醇、非离子表面活性剂和等渗剂或另外地包含甲硫氨酸的稳定剂可以提供增加长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性的制剂，并且当在该制剂中进一步包含防腐剂时该制剂可以多次使用，由此获得了成本有效和稳定的液体制剂。

解决问题的技术方案

本发明的一个目的是提供长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂,其包括药学有效量的长效促胰岛素分泌肽缀合物和不含白蛋白的稳定剂，其中生理活性肽即促胰岛素分泌肽连接至免疫球蛋白Fc区；其中所述稳定剂包括缓冲剂、糖醇、非离子表面活性剂和等渗剂。

本发明的另一个目的是提供用于多次给药的长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂，其除了促胰岛素分泌肽缀合物和不含白蛋白的稳定剂以外进一步包括防腐剂。

本发明的另一个目的是提供一种制备长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂的方法。

本发明的有益效果

由于本发明的长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂包括缓冲剂、等渗剂、糖醇和非离子表面活性剂，或另外地包含甲硫氨酸，但不含人血清白蛋白和其他对身体潜在有害的因子，因此不存在病毒污染的危险。而且，其可以为长效促胰岛素分泌肽缀合物提供优异的储存稳定性，所述长效促胰岛素分泌肽缀合物包含促胰岛素分泌肽和免疫球蛋白Fc区，由此与野生型蛋白质相比具有更高的分子量和提高的体内生理活性持续时间。本发明的这种液体制剂可以利用简单的制剂提供优异的储存稳定性并且与其他稳定剂和冻干剂相比更成本有效地提供肽药物。如果向制剂中加入防腐剂，则该制剂可以多次使用。而且，与常规的促胰岛素分泌肽制剂相比，本发明的制剂可以在体内较长期地保持蛋白质活性，并因此可以用作有效的药物制剂。

附图简述

图1是显示在pH 5.2下在最终选择的液体制剂(液体制剂#1)、通过向市售的促胰岛素分泌肽药物艾塞那肽即毒蜥外泌肽-4(Byetta)的液体制剂的稳定剂组合物中应用长效促胰岛素分泌肽缀合物而制备的液体制剂(液体制剂#2)、通过向免疫球蛋白融合蛋白药物依那西普(etanercept)(TNFR-Fc融合蛋白，ENBREL)的液体制剂的稳定剂组合物中应用长效促胰岛素分泌肽缀合物而制备的液体制剂(液体制剂#3)、和对照组(液体制剂#4)中肽稳定性的RP-HPLC分析的图，上述制剂均在25±2℃储存8周。

图2是在pH 5.2下在缺少甲硫氨酸的最终选择的液体制剂(液体制剂#1)和在pH 5.2下包含甲硫氨酸的液体制剂(液体制剂#2)中氧化的长效促胰岛素分泌肽缀合物的比例的RP-HPLC分析的图，上述制剂在25±2℃和在40±2℃储存4周。

图3显示了根据表18利用肉眼监测48小时在40℃在长效促胰岛素分泌肽缀合物的组合物中出现沉淀的结果。不出现沉淀的持续时间指示在储存肽后不发生蛋白质沉淀的时间。

图4显示了根据表19利用肉眼监测7天在40℃在长效促胰岛素分泌肽缀合物的组合物中出现沉淀的结果。不出现沉淀的持续时间指示在储存肽后不发生蛋白质沉淀的时间。

本发明最佳实施方式

作为一个方面，本发明提供了一种长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂，其包括药学有效量的长效促胰岛素分泌肽缀合物和不含白蛋白的稳定剂，其中促胰岛素分泌肽连接至免疫球蛋白Fc区；其中所述稳定剂包括缓冲剂、糖醇、非离子表面活性剂和等渗剂。

另外，本发明提供了一种用于多次给药的长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂，其除了促胰岛素分泌肽缀合物和不含白蛋白的稳定剂以外还包含防腐剂。

如在本文中使用，“长效促胰岛素分泌肽缀合物”是指其中包括衍生物、变体、前体和片段的生理活性促胰岛素分泌肽和免疫球蛋白Fc区相连的缀合物，并且其可以进一步指与野生型促胰岛素分泌肽相比具有增加的体内生理活性持续时间的缀合物。

如在本文中使用，术语“长效”是指与野生型相比生理活性持续时间的提高。术语“缀合物”是指其中促胰岛素分泌肽和免疫球蛋白Fc区相结合的形式。

在本发明中使用的促胰岛素分泌肽具有分泌胰岛素的功能并且其刺激胰腺β-细胞中胰岛素的合成和表达。促胰岛素分泌肽的类型包括前体、激动剂、衍生物、片段和变体。优选地，促胰岛素分泌肽可以是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4和咪唑并乙酰基(CA)毒蜥外泌肽-4，并且更优选地，咪唑并乙酰基(CA)毒蜥外泌肽-4。可以使用任意的促胰岛素分泌肽，天然的或重组的，并且优选地其是通过使用大肠杆菌(E.coli)作为宿主细胞产生的重组促胰岛素分泌肽。只要其生物学活性不显著地受影响，在本发明中可以使用通过置换、缺失或插入氨基酸生成的其任意的衍生物。

促胰岛素分泌肽的序列可以从已知的数据库诸如NCBI的GenBank获得，并且其可以与野生型蛋白具有70％或更多、优选80％或更多、更优选90％或更多和甚至更优选95％或更多以及最优选98％或更多的序列同源性，只要其证明具有促胰岛素分泌肽的活性。

此外，本发明中可用的免疫球蛋白Fc可以是人免疫球蛋白Fc或其密切相关的类似物或来源于动物诸如牛、羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠的免疫球蛋白Fc。另外，免疫球蛋白Fc区可以来源于IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、或其组合或杂合体。优选地，免疫球蛋白Fc来源于人血液中最丰富的IgG或IgM，最优选地，其来源于已知能提高配体结合蛋白质的半衰期的IgG。而且，免疫球蛋白Fc区可以是具有相同起源的结构域的单链免疫球蛋白的二聚体或多聚体。免疫球蛋白Fc可以通过用某些蛋白酶处理天然IgG，或使用基因重组技术通过转化的细胞来产生。优选地，免疫球蛋白Fc是在大肠杆菌中产生的重组人免疫球蛋白Fc。

同时，IgG可以分成IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型，并且在本发明中可以使用其组合或杂合体。优选IgG2和IgG4亚型，并且最优选IgG4的Fc区，其很少具有效应器功能诸如补体依赖性细胞毒性(CDC)。即，作为本发明的药物载体最优选的免疫球蛋白Fc区是人IgG4来源的非糖基化Fc区。人源Fc区比非人源Fc区更优选，后者可能充当人身体中的抗原并且导致不合乎需要的免疫应答，诸如产生新的抗体。

在本发明中使用的长效促胰岛素分泌肽缀合物通过将合成的促胰岛素分泌肽与免疫球蛋白Fc区结合来制备。用于将两者结合的方法可以是经由非肽基聚合物交联促胰岛素分泌肽和免疫球蛋白Fc区或通过基因重组产生其中促胰岛素分泌肽和免疫球蛋白Fc区相连的融合蛋白。

用于交联的非肽基聚合物可以选自：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物可降解聚合物诸如PLA(聚(乳酸))和PLGA(聚(乳酸-乙醇酸)、脂质聚合物、几丁质、透明质酸或其组合。优选地，可以使用聚乙二醇但不限于其。在本领域中公知的它们的衍生物和可以使用本领域中已知的方法容易制备的衍生物也在本发明的范围内。

为了制备在本发明中使用的长效促胰岛素分泌肽缀合物，可以参照韩国专利登记号10-0725315、韩国专利公开号10-2009-0008151和韩国专利登记号10-1058290。本领域技术人员可以通过参考这些文献来制备本发明的长效促胰岛素分泌肽缀合物。

本发明的长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂包含治疗有效量的长效促胰岛素分泌肽缀合物。通常，治疗有效量的促胰岛素分泌肽，尤其是毒蜥外泌肽-4(Byetta)，是指笔式注射器中250mcg。在本发明中使用的长效促胰岛素分泌肽缀合物的浓度范围为0.1mg/ml至200mg/ml，优选0.5mg/ml至150mg/ml。促胰岛素分泌肽可以优选是长效CA毒蜥外泌肽-4缀合物。本发明的长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂可以稳定地保存缀合物而没有沉淀，不仅当促胰岛素分泌肽缀合物以低浓度存在时，而且当其以高浓度存在时。因此，本发明的制剂可以稳定地将高浓度的促胰岛素分泌肽提供至体内。

如在本文中使用，术语“稳定剂”是指允许稳定地保存长效促胰岛素分泌肽缀合物的物质。术语“稳定化”是指其中在某个时期期间和在特定的储存条件下活性成分的丧失小于某个量、典型地小于10％的状态。当在5±3℃储存2年，在25±2℃储存6个月，或在40±2℃储存1-2周后其中长效促胰岛素分泌肽缀合物的残留纯度为90％或以上且更优选92-95％时，制剂被认为是稳定的制剂。对于如长效促胰岛素分泌肽缀合物的蛋白质，其储存稳定性对于提供准确的剂量以及对于抑制针对长效促胰岛素分泌肽缀合物的抗原物质的潜在形成是重要的。在储存期间，长效促胰岛素分泌肽缀合物的10％损失对于大量给药是可接受的，除非其导致组合物中聚集体或片段的形成，引起抗原化合物的形成。

本发明的稳定剂优选地包含缓冲剂、糖醇、等渗剂诸如氯化钠、和非离子表面活性剂，且更优选地另外包含甲硫氨酸，用于稳定长效促胰岛素分泌肽缀合物。

缓冲剂用于维持溶液的pH以防止液体制剂中急剧的pH变化，以稳定长效促胰岛素分泌肽缀合物。缓冲剂可以包括碱性盐(磷酸钠或磷酸钾或其氢盐或二氢盐)、柠檬酸钠/柠檬酸、乙酸钠/乙酸、组氨酸/盐酸组氨酸、本领域中已知的任何其他药学上可接受的pH缓冲剂、及其组合。这样的缓冲剂的优选实例包括柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和组氨酸缓冲剂。缓冲剂的浓度优选为5mM至100mM，更优选10mM至50mM。缓冲剂的pH优选为4.0至7.0，更优选5.0至7.0，甚至更优选5.2至7.0和甚至更加优选5.2至6.0。

糖醇的作用是增加长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性。在本发明中使用的糖醇的浓度优选为基于溶液的总体积1至20％(w/v)，更优选基于溶液的总体积3至10％(w/v)。糖醇可以是选自下列中的一种或多种：甘露醇、山梨醇和蔗糖，但不限于这些。

等渗剂的作用是当将溶液中的长效促胰岛素分泌肽缀合物施用至体内时维持适宜的渗透压，并且还稳定溶液中的长效促胰岛素分泌肽缀合物。将制剂的渗透压调节至与血液等渗。这些等渗的液体制剂的渗透压通常为约300mOsm/kg。等渗剂的代表性实例包括糖醇、水溶性无机盐和氨基酸，并且优选的实例是水溶性无机盐，即，氯化钠。作为等渗剂的氯化钠的浓度优选为0至150mM,并且其可以根据制剂中包含的组分的类型和量来调整，使得包含所有混合物的液体制剂成为等渗的。

非离子表面活性剂降低蛋白质溶液的表面张力以防止蛋白质吸附或聚集到疏水表面上。在本发明中可用的非离子表面活性剂的实例包括聚山梨醇酯、泊洛沙姆(poloxamer)及其组合，优选聚山梨醇酯。在聚山梨醇酯的非离子表面活性剂中有聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80。最优选的非离子表面活性剂是聚山梨醇酯20。

在液体制剂中不适宜使用高浓度的非离子表面活性剂，这是由于下列的事实：当测量蛋白质浓度并通过分析法诸如UV-光谱法或等电聚焦测定蛋白质稳定性时高浓度的非离子表面活性剂引起干扰效应，从而导致难以准确地检查蛋白质稳定性。因此，本发明的液体制剂优选包含不超过0.2％(w/v)、更优选0.001％至0.05％(w/v)的低浓度的非离子表面活性剂。

根据本发明的一个实施例，证明当在缓冲剂、糖醇和非离子表面活性剂的存在下加入氯化钠作为等渗剂时，低浓度的长效促胰岛素分泌肽缀合物的储存稳定性显著增加。这表明使用氯化钠作为等渗剂，同时使用缓冲剂、糖醇和非离子表面活性剂引起协同效应，由此允许长效促胰岛素分泌肽缀合物具有高稳定性。然而，对于高浓度的长效促胰岛素分泌肽缀合物，当不包括氯化钠时，防止了沉淀的出现并且提高了蛋白质的溶解度。这些结果表明当使用氯化钠作为等渗剂时，可以根据长效促胰岛素分泌肽缀合物的浓度调整其含量。

另外，证实低浓度的长效促胰岛素分泌肽缀合物在pH 5.2下在缓冲剂中最稳定，而高浓度的长效促胰岛素分泌肽缀合物在pH 5.4或5.6下在缓冲剂中最稳定。因此，确定缓冲剂的pH可以根据缀合物的浓度适当地调整。

包含在本发明的稳定剂中的甲硫氨酸抑制杂质的形成，由此进一步稳定靶蛋白，所述杂质可由于溶液中蛋白质的氧化产生。甲硫氨酸的浓度为基于溶液的总体积0.005至0.1％(w/v)，优选0.01至0.1％(w/v)。

优选本发明的稳定剂不包含白蛋白。由于可用作蛋白质的稳定剂的人血清白蛋白从人血清中制备，因此总是存在这样的可能性：其可能被人来源的致病性病毒污染。明胶或牛血清白蛋白在一些患者中可能引起疾病或可能易于诱发变态反应。不含有异种蛋白诸如人或动物来源的血清白蛋白或纯化的明胶，本发明的稳定剂没有导致病毒污染的可能性。

另外，本发明的稳定剂可以进一步包含糖、多元醇或氨基酸。可以进一步添加以增加长效促胰岛素分泌肽缀合物的储存稳定性的糖的优选实例包括单糖诸如甘露糖、葡萄糖、海藻糖和木糖，和多糖诸如乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖和葡聚糖。多元醇的优选实例包括丙二醇、低分子量聚乙二醇、甘油、低分子量聚丙二醇及其组合。

本发明的液体制剂除了上述的缀合物、缓冲剂、等渗剂、糖醇和非离子表面活性剂，或另外地甲硫氨酸以外可以进一步包含防腐剂，以用于防止多次使用制剂中的微生物污染。

如在本文中使用，“防腐剂”是指加入至药物制剂中以充当抗微生物剂的化合物。防腐剂的实例包括苯索铵(benzethonium)、氯己定(chlorohexidine)、苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、苯扎氯铵、硝酸苯汞、乙基汞硫代水杨酸钠和苯甲酸，但不限于这些。可以单独地使用单一类型的防腐剂，或可以使用两种或多种类型的防腐剂的随机组合。优选地本发明的液体制剂可以包含间甲酚、苯酚和苯甲醇中的一种或多种作为防腐剂。

本发明的液体制剂可以包含0.001％至1％(w/v)的防腐剂，且优选0.001％至0.5％(w/v)的防腐剂，且更优选0.001至0.25％(w/v)的防腐剂。

在本发明的一个实施例中，添加0.22％(w/v)间甲酚作为本发明的液体制剂中的防腐剂，并且评价甲酚对促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性的作用。结果，证实缀合物在添加了防腐剂的制剂中仍然稳定，没有沉淀。因此，除了稳定剂以外包含防腐剂的本发明促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂可以用于多次给药。

本发明的液体制剂除了上述的缓冲剂、等渗剂、糖醇和非离子表面活性剂或另外地甲硫氨酸和防腐剂以外，可以进一步选择性地包含本领域中已知的其他物质和材料，只要本发明的效果不受影响。

为长效促胰岛素分泌肽缀合物提供稳定性的根据本发明的不含白蛋白的长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂没有病毒污染的风险，同时利用简单的制剂提供优异的储存稳定性，并且因此本发明的制剂与其他稳定剂或自由干燥的制剂相比可以更成本有效地提供。

而且，由于本发明的液体制剂包含长效促胰岛素分泌肽缀合物(其与野生型相比具有增加的生理活性持续时间)，因此其通过与常规促胰岛素分泌肽制剂相比在体内较长期地保留蛋白质活性而可以用作有效的药物制剂。而且，本发明的液体制剂为保存高浓度以及低浓度的长效促胰岛素分泌肽缀合物提供了优异的稳定性。

作为另一个方面，本发明提供了制备本发明的液体制剂的方法。

可以通过产生长效促胰岛素分泌肽缀合物，并将产生的长效促胰岛素分泌肽缀合物与包含缓冲剂、糖醇、非离子表面活性剂和等渗剂的稳定剂混合来制备长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定的液体制剂。而且，对于多次使用，可以通过除了稳定剂以外进一步混合防腐剂来产生稳定的长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂。

发明的方式

下面，将参照实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明的目的，并且本发明不意在受这些实施例限制。

实施例1:在存在或缺少等渗剂诸如盐的条件下评价长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性

在存在或缺少作为等渗剂的氯化钠的存在下在包含缓冲剂、糖醇和非离子表面活性剂作为稳定剂的制剂中和在包含缓冲剂、糖醇、非离子表面活性剂和甲硫氨酸作为稳定剂的制剂中，评价长效促胰岛素分泌肽缀合物(15.41μg/mL CA毒蜥外泌肽-4，Nominal Conc.)的稳定性。为此目的，将长效促胰岛素分泌肽缀合物在下面表1的组合物中在25℃和40℃保存0至4周，然后通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)和尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)分析缀合物的稳定性。柠檬酸盐缓冲剂用作缓冲剂，甘露醇用作糖醇，且聚山梨醇酯20用作非离子表面活性剂。在表2和3中，RP-HPLC(％)和SE-HPLC(％)表示“面积％/起始面积％”，显示与初始纯度相比长效促胰岛素分泌肽缀合物的残留纯度。表2显示了在25℃储存后长效促胰岛素分泌肽缀合物的残留纯度，表3显示了在40℃储存后的残留纯度。

[表1]

[表2]

[表3]

基于表2和表3中测试组#1和#2之间以及#3和#4之间的比较，显然当长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂在25℃和40℃、特别是在40℃保存4周时，并且在作为等渗剂的NaCl、特别是150mM NaCl的存在下，长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性保持显著很高(表2和3)。

实施例2:在不同的缓冲剂pH下对长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性的评价

尽管通常的液化蛋白药物的pH范围为5-7，但毒蜥外泌肽-4(Byetta)——一种促胰岛素分泌肽药物——的液体制剂的pH为4.5,其低于通常的pH范围。因此，在本实施例中，对于包含促胰岛素分泌肽和免疫球蛋白Fc蛋白的长效促胰岛素分泌肽缀合物，优选长效咪唑并乙酰基(CA)毒蜥外泌肽-4缀合物，检查缓冲剂的pH对缀合物的稳定性的作用。

柠檬酸盐缓冲剂用作缓冲剂，甘露醇用作糖醇，氯化钠用作等渗剂，且聚山梨醇酯80用作非离子表面活性剂。下表4中显示的组合物用作长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定剂。然后长效促胰岛素分泌肽缀合物的组合物在25±2℃保存4周，并通过尺寸排阻色谱(SE-HPLC)和反相色谱(RP-HPLC)分析其稳定性。表5中的RP-HPLC(％)和SE-HPLC(％)表示"面积％/起始面积％"，显示了与初始纯度相比长效促胰岛素分泌肽缀合物的残留纯度。

[表4]

[表5]

如上所示，当在上述液体制剂中pH为5.2时，长效促胰岛素分泌肽缀合物最稳定(表5)。

实施例3:对取决于非离子表面活性剂的类型和浓度的长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性的评价

使用不同类型和浓度的作为本发明的稳定剂中的非离子表面活性剂的聚山梨醇酯检查长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性。

非离子表面活性剂，即，聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯20，在0.005％和0.01％两个浓度下进行检查。稳定剂的组合物包含缓冲剂、糖醇和等渗剂以及表面活性剂，如在上面实施例中所使用的，用于向长效促胰岛素分泌肽缀合物提供稳定性。在实施例2中显示高稳定性的处于pH 5.2的柠檬酸盐缓冲剂用作缓冲剂，甘露醇用作糖醇，且氯化钠用作等渗剂。

下表6中显示的组合物用作长效促胰岛素分泌肽缀合物(优选地长效CA毒蜥外泌肽-4缀合物)的稳定剂。然后将该组合物在25±2℃保存8周，通过RP-HPLC和SE-HPLC分析其稳定性。表7中的RP-HPLC(％)和SE-HPLC(％)表示与初始纯度相比较的长效促胰岛素分泌肽缀合物的残留纯度。

[表6]

[表7]

如上所示，基于SE-HPLC分析结果，甚至当使用不同类型和浓度的聚山梨醇酯时，长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性几乎相同。然而，基于RP-HPLC分析结果，观察到当使用聚山梨醇酯20时，肽缀合物的稳定性与使用相同浓度的聚山梨醇酯80时相似或更高。而且，与包含0.01％聚山梨醇酯20的液体制剂相比，在包含0.005％聚山梨醇酯20的液体制剂中长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性更高(表7)。

实施例4:最终选择的长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂和包含相同的长效促胰岛素分泌肽缀合物的肽或蛋白质药物的市售液体制剂之间稳定性的比较

在本实施例中，评价通过实施例1-3中的稳定性测试选择的制剂的稳定性。最终选择的长效促胰岛素分泌肽缀合物的制剂包含处于pH 5.2的柠檬酸盐缓冲剂、氯化钠、甘露醇和聚山梨醇酯20。为此，在通过向市售促胰岛素分泌肽药物毒蜥外泌肽-4(Byetta)的液体制剂应用长效促胰岛素分泌肽缀合物产生的液体制剂和向免疫球蛋白融合蛋白药物依那西普(TNFR-Fc融合蛋白,ENBREL)的液体制剂应用长效促胰岛素分泌肽缀合物产生的液体制剂之间比较药物制剂的稳定性。

使用下表8中所示的组成制备下面的制剂：长效促胰岛素分泌肽缀合物，更优选长效CA毒蜥外泌肽-4缀合物的液体制剂(液体制剂#1)；通过向促胰岛素分泌肽药物毒蜥外泌肽-4(Byetta)的液体制剂的稳定剂组合物应用长效促胰岛素分泌肽缀合物制备的液体制剂(液体制剂#2)；和通过向免疫球蛋白融合蛋白药物依那西普(TNFR-Fc融合蛋白,ENBREL)的液体制剂的稳定剂组合物应用长效促胰岛素分泌肽缀合物制备的液体制剂(液体制剂#3)。作为对照组，通过向仅包含PBS的稳定剂组合物应用长效促胰岛素分泌肽缀合物制备液体制剂(液体制剂#4)。随后，将制剂在25±2℃保存8周，并通过RP-HPLC和SE-HPLC分析其稳定性。表9中的RP-HPLC(％)和SE-HPLC(％)显示与初始纯度相比长效促胰岛素分泌肽缀合物的残留纯度。

[表8]

[表9]

作为稳定性测试的结果，观察到本发明的长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂显示出比通过向市售的促胰岛素分泌肽药物毒蜥外泌肽-4(Byetta)的液体制剂应用长效促胰岛素分泌肽缀合物制备的液体制剂和通过向免疫球蛋白融合蛋白药物依那西普(TNFR-Fc融合蛋白,ENBREL)的液体制剂应用长效促胰岛素分泌肽缀合物制备的液体制剂更高的稳定性，如图1和表9中所示。

实施例5:对取决于添加甲硫氨酸的长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性的评价

为了确定甲硫氨酸对缀合物的稳定性的作用，通过向包含pH 5.2的柠檬酸盐缓冲剂、氯化钠、甘露醇和聚山梨醇酯20的组合物(其是在上面的实施例中选择的)添加甲硫氨酸以防止氧化来制备液体制剂。将该制剂在25±2℃保存4周并在40±2℃保存4周，然后分析其稳定性。

以下表10中显示的组成制备长效促胰岛素分泌肽缀合物、更优选长效CA毒蜥外泌肽-4缀合物的液体制剂，并分析其稳定性。表11至14中的RP-HPLC(％)和SE-HPLC(％)表示每个时间点处长效促胰岛素分泌肽缀合物和杂质的比例。表11显示通过RP-HPLC(25±2℃)进行的加速稳定性测试的结果，表12显示通过SE-HPLC(25±2℃)进行的加速稳定性测试的结果。表13显示通过RP-HPLC(40±2℃)进行的不稳定性严重度测试的结果，表14显示通过SE-HPLC(40±2℃)进行的不稳定性严重度测试的结果。杂质#3表示长效促胰岛素分泌肽缀合物的氧化形式。然而，由于SE-HPLC通过分子量分离样品，且氧化形式和非氧化形式分子量之间的差异很小，因此难以通过SE-HPLC分离长效促胰岛素分泌肽缀合物的氧化形式。

[表10]

[表11]

[表12]

[表13]

[表14]

作为加速稳定性测试和不稳定性严重度测试的结果并且如图2中所示，观察到在不含甲硫氨酸的液体制剂中氧化的长效促胰岛素分泌肽缀合物(在RP-HPLC分析中的杂质#3)的比例增加，但在包含0.01％甲硫氨酸的液体制剂中不增加(图2)。因此，证实包含甲硫氨酸的液体制剂可以向长效促胰岛素分泌肽缀合物更有效地提供稳定性。

实施例6:对最终选择的长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂的长期储存稳定性的评价

在本实施例中，评价由上述实施例最终选择的液体制剂的长期储存稳定性和加速稳定性。最终选择的液体制剂包含pH 5.2的柠檬酸盐缓冲剂、氯化钠、甘露醇、聚山梨醇酯20和甲硫氨酸。为此，将制剂在5±3℃储存6个月，在25±2℃储存6个月，并分析其稳定性。结果显示在表15和16中，且RP-HPLC(％)、SE-HPLC(％)、蛋白质含量(％)和比活性测试(％)表示与初始纯度相比缀合物的残留纯度。表15显示测试在5±3℃储存制剂后制剂的长期储存稳定性的结果，且表16显示在25±2℃储存制剂后加速稳定性测试的结果

[表15]

[表16]

作为长期储存稳定性测试的结果，在本发明的液体制剂中长效促胰岛素分泌肽缀合物稳定超过6个月。而且，甚至当在加速条件下储存6个月时，RP-HPLC分析结果显示95.4％以上的肽缀合物在制剂中仍然保持完整，由此证实本发明的液体制剂为长效促胰岛素分泌肽缀合物提供了优异的储存稳定性。

实施例7:对取决于蛋白质浓度的长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性的评价

对最终选择的液体制剂(包含pH 5.2的柠檬酸盐缓冲剂、氯化钠、甘露醇、聚山梨醇酯20和用于防止氧化的甲硫氨酸)检查高缀合物浓度的作用。为此，在40℃和表17中显示的各种缀合物浓度下用肉眼监测制剂中的沉淀。监测72小时后，在高浓度(4mg/ml或以上)下在所有的本发明的制剂中均出现了沉淀。而且，当浓度增加时，沉淀的出现也增加。

[表17]

实施例8:对取决于盐和糖醇的浓度以及甲硫氨酸的存在的高浓度长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性的评价

对高浓度的最终选择的长效促胰岛素分泌肽缀合物的液体制剂检查NaCl和作为糖醇的甘露醇的浓度对防止沉淀的作用。以下表18中所示的组成制备制剂并在40℃用肉眼监测沉淀出现持续48小时。在图3中所示的缺少沉淀的持续时间证明了在储存后不发生蛋白质沉淀的时间段。

[表18]

如上述结果所示，基于肉眼的观察，证实NaCl的浓度不显著影响沉淀的出现和高浓度促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性。然而，当作为糖醇的甘露醇的浓度从5％增加至10％时，沉淀可以被显著地抑制(图3)。而且，当不向制剂添加甲硫氨酸时，沉淀也可以被抑制。

实施例9:对取决于盐的存在和在各种pH下的高浓度长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性的评价

如实施例8所选择的那样使用10％甘露醇，检查pH对抑制沉淀和促进高浓度长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性的作用。柠檬酸盐缓冲剂用作缓冲剂，聚山梨醇酯20用作非离子表面活性剂。根据实施例8，从制剂中去除甲硫氨酸可以抑制沉淀。然而，为了防止蛋白质的氧化，仍然向制剂添加甲硫氨酸。此外，为了证实NaCl和pH的协同作用，在制剂中加入或不加入150mM NaCl。以下表19中所示的组成制备高浓度长效促胰岛素分泌肽缀合物，并在40℃监测沉淀出现持续7天。储存7天后，通过RP-HPLC和SE-HPLC分析样品。

图4中所示的缺少沉淀的持续时间指示在储存后不发生蛋白质沉淀的时间段。表20的RP-HPLC(％)和表21的SE-HPLC(％)指示了与初始纯度相比长效促胰岛素分泌肽缀合物的残留纯度。

[表19]

[表20]

[表21]

如上所示，在比pH 5.2高的pH 5.4和5.6下对沉淀抑制更好。储存7天后，在所有制剂中观察到沉淀。然而，在pH 5.6下在包含10％甘露醇和150mM NaCl的组合物(组合物编号6)中，生成的杂质的量最小。在pH5.4和5.6下，除了沉淀以外，NaCl的存在对高浓度长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性没有显著影响(表20和21以及图4)。

实施例10:对取决于糖醇的浓度和在各种pH下高浓度长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性的评价

基于上述实施例，检查糖醇的浓度和pH对高浓度长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性的作用。柠檬酸盐缓冲剂用作缓冲剂，聚山梨醇酯20用作非离子表面活性剂。而且，为了防止氧化，向制剂添加甲硫氨酸。另外，基于在实施例9中观察到的结果，在高浓度长效促胰岛素分泌肽缀合物的制剂中不加入NaCl。以下表22中所示的组成配制高浓度长效促胰岛素分泌肽缀合物，并在40℃储存5天，并移动至25℃的温度并另外储存4周。每周通过SE-HPLC、IE-HPLC和RP-HPLC分析蛋白质的稳定性。表23的SE-HPLC(％)、表24的IE-HPLC(％)和表25的RP-HPLC(％)表示长效促胰岛素分泌肽缀合物的残留纯度。

[表22]

[表23]

[表24]

[表25]

如上所示，与pH高时相比，当pH低时，稳定性也下降。在10％甘露醇时，缀合物的稳定性最高，而2％和5％甘露醇不影响高浓度长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性。

实施例11:对取决于糖醇的类型和浓度的高浓度长效促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性的评价

为了开发等渗液体制剂，在与上述实施例相同的条件下检查糖醇的类型和浓度(其最显著地影响制剂的渗透压)对促胰岛素分泌肽缀合物的稳定性的作用。糖醇的类型改变为蔗糖。基于实施例10的制剂编号1，10％甘露醇被替换为5％和7％蔗糖(表26)。将制剂在25℃储存4周，并且每周通过SE-HPLC、IE-HPLC和RP-HPLC分析其稳定性。表27的SE-HPLC(％)、表28的IE-HPLC(％)和表29的RP-HPLC(％)表示长效促胰岛素分泌肽缀合物的残留纯度。

[表26]

[表27]

[表28]

[表29]

如上所示，当使用蔗糖替代甘露醇时，保持了缀合物的稳定性，并且缀合物的稳定性在7％蔗糖中比在5％蔗糖中稍稍增加，但没有显著差异。

实施例12:对取决于缓冲剂的类型、渗透压调整和添加防腐剂的高浓长效促胰岛素分泌肽缀合物度的稳定性的评价

为了开发等渗液体制剂，调整对渗透压具有最大效应的糖醇的浓度，并且对于在上述实施例的条件下提供缀合物稳定性，测试不同类型的缓冲剂。而且，在相同的条件下，添加0.22％间甲酚作为防腐剂，并且还测试其对缀合物稳定性的作用。以下表30中所示的组成配制长效促胰岛素分泌肽缀合物并将其在25℃储存2周。然后，每周通过SE-HPLC、IE-HPLC和RP-HPLC分析样品的稳定性。表31的SE-HPLC(％)、表32的IE-HPLC(％)和表33的RP-HPLC(％)表示长效促胰岛素分泌肽缀合物的残留纯度。

[表30]

[表31]

[表32]

[表33]

如上所示，当使用不同类型的缓冲剂时，每种制剂的肽缀合物是稳定的。而且，间甲酚的添加不影响肽稳定性。

这些结果支持了本发明的液体制剂的组合物可以保持高浓度促胰岛素分泌肽缀合物的高稳定性。

基于上面的描述，对于本领域技术人员将显而易见的是在不偏离本发明的范围和精神的前提下可以做出各种修改和变化。因此，应当理解的是上述实施方案不是限制性的，而是在所有方面均是说明性的。本发明的范围由所附权利要求限定而不是由它们之前的说明书限定，并且因此落在权利要求的边界和界限或这样的边界和界限的等效形式内的所有变化和修改因此意在被权利要求所涵盖。