本发明属于中药制备领域，具体涉及一种抗口腔溃疡黄柏炮制品提取物的制备方法。
背景技术：
黄柏为常用中药材，具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮的功效，习称川黄柏，为芸香科植物黄皮树phellodendronchinenseschneid.的干燥树皮，始载于《神农本草经》，原名“檗木”，列为上品。历代黄柏炮制品有生品、盐制品、蜜制品、人乳汁炒品、煅制品和酒制品等。目前，药典中沿袭的黄柏炮制品制备工艺采用为盐炙和制炭。元·《汤液》记载“蜜炒此一味为细末，治口疮如神”，元·《宝鉴》中记载“蜜炒为细末，治口疮瘫痪必用药也”，清·《辨义》中记载“用蜜汤炒，取其恋隔而不骤下，治五心烦热，目痛口疮诸症”。依据这些古文记载可见，蜜炙黄柏对于口疮的治疗应颇有成效，专利cn103784847“一种治疗口腔溃疡的外用散剂”中使用蜜炙黄柏，其蜜炙方法见《雷公炮炙论》，该方法具有如下缺点,在《雷公炮炙论》中，提及的炮制方法并没有具体的参数设定，所提到的炒制方法为“文武火炙”的方法，在我们的前期实验中，发现黄柏中的有效成分小檗碱在高温下有热不稳定性，故在炮制过程中火力不能太高，更不能在炮制过程中选用武火，否则小檗碱成分回大量破坏进而药效降低，故原有的记载方式需要更新改进。而《黄柏蜜炙与临床应用考释》文献提到了“黄柏蜜炙方法工艺，历代本草文献种炮炙专著均有记载，只是现《中药炮制学》和《中国药典》未收载，有关报道甚少。黄柏蜜炙工艺按本草文献记载：每斤黄柏丝用炼蜜三两(150克)，用少量水兑匀同黄柏丝拌匀、润透、用文火炒炙至适度”。该工艺具有如下缺点，首先并没有涉及到关于黄柏炮制过程中所用的温度，而在我们的研究过程中发现，炮制温度因素会对黄柏蜜炙的质量产生显著性影响，所以制定黄柏蜜炙时的炮制温度是十分有必要的，此外本专利还具体限定了蜜制品的极性部分，可以更加专一有效的治疗口腔溃疡的症状，而原有的文献并有相关记载。
因此，研制一种经济方便，操作简单的抗口腔溃疡的黄柏炮制品提取物的制备方法成为目前亟待解决的新课题。
技术实现要素：
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本发明的目的在于提供一种黄柏抗口腔溃疡的炮制方法，本制备方法明确了蜜黄柏的炮制工艺和抗口腔溃疡的药效作用，为研发新药提供基础。本方法获得的蜜黄柏炮制品提取物，具有良好的治疗口疮作用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种抗口腔溃疡的黄柏炮制品提取物的制备方法，包括下述步骤：
步骤1：将净黄柏饮片加蜂蜜水（质量比蜂蜜：水=0.5-2:1，优选蜂蜜：水=1:1）拌匀，闷润至蜂蜜水被吸尽，蜜水完全渗入到饮片组织内部，在120℃~130℃下炒制2~6min，优选炒制时间为4分钟。晾凉，去除杂质，所述每100kg黄柏饮片用10~30kg蜂蜜，优选每100kg黄柏饮片用30kg蜂蜜。
步骤2：取上述黄柏蜜炙品，加5~15倍量70%的乙醇溶剂提取，回流提取两次，每次1小时，将两次提取液合并，减压回收乙醇至无醇味，得醇浸膏。浸膏以适量水分散，用乙酸乙酯萃取，剩余水层再用乙酸乙酯萃取，回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取物，后用水转溶，浓度调整至0.11g/ml，即得。
所述抗口腔溃疡的黄柏炮制品提取物用于治疗口腔溃疡的药物中的应用。制得的抗口腔溃疡的黄柏炮制品提取物，能够改善受损口腔成纤维细胞no、sod和mda水平含量，可修复口腔细胞氧化损伤。
与现有技术相比，本发明的有益效果。
目前的技术在部分黄柏蜜炙过程中没有确切的参数，容易导致炮制过程不到预期的效果，同时本技术为了突出相关的治疗作用，对不同极性的蜜黄柏进行了抗口腔溃疡的作用考察，发现在蜜黄柏中乙酸乙酯层的作用最为突出，这样对于病症选取了更为有效的施治方案。
本专利通过建立小鼠口腔成纤维细胞氧化损伤模型，从细胞水平考察蜜炙黄柏对口腔细胞氧化应激反应的影响，来验证蜜炙黄柏的治疗作用，从而为临床用药提供一定的实验依据。我们课题组在进行黄柏蜜制前后药效学对比研究时，首次发现了黄柏蜜炙尤其为乙酸乙酯层极性部位，对口腔细胞氧化应激反应显著增强。本技术的发明，可以使提高黄柏炮制品的药用价值作用，寻找到了蜜黄柏的药用功效，可进一步开发为抗口腔溃疡药物。
本发明提供的蜜黄柏炮制品的制备方法和用途，所制备的蜜黄柏炮制品在现有的研究报道中并无记载，该制备方法具有效率高、工艺稳定、操作简便、成本低廉的特点，且该蜜黄柏具有很好的抗口腔溃疡的作用，相对于黄柏生品具有更强的治疗效果。
附图说明
图1为黄柏对照品和供试品高效液相色谱图。
其中，1为盐酸黄柏碱，2为小檗红碱，3为盐酸小檗碱。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细说明本发明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述的实例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1。
1、仪器和材料。
1.1仪器：waterse2695-2998高效液相色谱仪（美国waters公司），mettlerae240型十万分之一分析天平（瑞士mettler），kq-250db型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），fa1004b电子天平（上海精密科学仪器有限公司），烘箱（ws70b-型），双人单面超净工作台（上海智成科学仪器有限公司），co2培养箱（日本三洋mco-15ac）,酶标仪（美国赛默飞世尔科技有限公司），tgl-16c型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），倒置显微镜（宁波永新nib-100），立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯科学仪器有限公司），-80℃超低温冰箱（青岛海尔医疗设备股份有限公司），紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），微量移液器（赛默飞世尔（上海）仪器有限公司），电子天平（上海瑶新电子科技有限公司），涡旋混合器（上海青浦沪西仪器厂）。
1.2试药：黄柏药材购于四川省药材公司；乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。盐酸小檗碱对照品购自中国药品生物制品检定所（批号0713-9906）。盐酸黄柏碱对照品购自成都曼思特生物技术有限公司，供含量测定使用，纯度均大于98%。槐树蜂蜜（安徽省宿松县刘氏蜂产品有限责任公司）。dmem高糖培养基（thermo公司），新生胎牛血清（thermo公司），双抗（青霉素和链霉素，gibco公司），非必须氨基酸（gibco公司），胰酶（reanta公司），pbs（solarbio公司），75%医用消毒酒精，cck8试剂盒（南京建成生物科技有限公司），bca蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所），超氧化物歧化酶（sod）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），一氧化氮（no）试剂盒（南京建成生物工程研究所），细胞丙二醛（mda）试剂盒（南京建成生物工程研究所），水为纯净水，其余试剂为分析纯。
2、本实施例提供一种蜜黄柏炮制品的制备方法，包括以下步骤：
按每100kg黄柏饮片用30kg蜂蜜，将净黄柏饮片加蜜水（蜜：水=1:1）拌匀，闷润至蜜水被吸尽，至蜜水完全渗入到饮片组织内部，在120℃-130℃下炒制4min。晾凉，去除杂质。取上述黄柏蜜炙品，加10倍量70%的乙醇溶剂提取，回流提取两次，每次1小时，将两次提取液合并，减压回收乙醇至无醇味，得醇浸膏，浸膏以适量水分散，用乙酸乙酯萃取，剩余水层再用乙酸乙酯萃取，回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取物，后用水转溶，浓度调整至0.11g/ml，即得。
3、所述炮制的蜜黄柏的制备工艺。
以盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的含量为评价指标，选择加蜜量、炒制温度及炒制时间为考察因素，采用正交设计l9(34)，优选黄柏蜜炙的最佳炮制工艺。
正交实验，如下：
指标测定方法：采用高效液相色谱法。色谱条件：色谱柱，ecosil-c18（250mm*4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50:50，每100ml加十二烷基磺酸钠0.1g）；检测波长为284nm；流速:1ml/min；柱温为25℃。色谱图见图1。
溶液制备对照品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品4.82mg，盐酸黄柏碱对照品4.58mg,小檗红碱3.14mg分别置于50ml的容量瓶中，加色谱甲醇稀释至刻度，摇匀，即得0.0964mg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液，0.0916mg/ml的盐酸黄柏碱对照品溶液及0.0628mg/ml的盐酸小檗红碱对照品溶液。供试品溶液的制备：取本品粉末（过三号筛）约0.1g，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相80ml，超声处理（功率250w，频率40khz）40min，放冷。用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
综合评分=0.6×(xi/xmax)+0.2×(yi/ymax)+0.2×(zi/zmax)
上式x为盐酸小檗碱含量，y为盐酸黄柏碱含量，z为小檗红碱含量,并对黄柏蜜炙品的综合评分的两个指标的参数分别设为60%，20%和20%，下同。
由方差分析结果可以得出，蜜炙黄柏的影响因素为a（炒制温度）>b（加蜜量）>c（炒制时间），且三种因素炒制时间和加蜜量对黄柏蜜炙生物碱的含量有显著性影响。结合直观分析表并考虑生产实际，确定其炮制的最佳工艺为a2b3c1，即饮片加入蜜（每100kg饮片用蜜30kg，蜜：水=1:1）润透，锅底温度为120~130℃，炒制4min。
4.为进一步验证本发明的有益效果，提供以下“蜜黄柏抗口腔溃疡”的试验案例。
4.1测定方法。
对数生长期的l929细胞经消化、刮取、吹打后，调整细胞密度至1×107个/ml，并接种于96孔培养板上，每孔体积100μl。置37℃，5%co2培养箱孵育24h后，弃上清液。分为3组，即空白对照组：加入空白培养液200μl；模型对照组：加入2μg/ml的h202100μl，并以空白培养液稀释至终体积为200μl；给药组：加入不同黄柏生制品萃取溶液的加药培养液100μl和2μg/ml的h202100μl（h202终浓度为1μg/ml）终体积为200μl，每个浓度设3个复孔。37℃，5%co2培养箱中培养24h后，按照bca蛋白浓度测定试剂盒说明书操作，用酶标仪法测定蛋白标准品的标准曲线，根据标准曲线计算样品蛋白浓度。按照no试剂盒说明书操作，采用硝酸还原酶法，利用紫外分光光度计测定细胞中no的含量。按照超氧化物歧化酶(sod)和细胞丙二醛(mda)的测定试剂盒说明书操作，用酶标仪测定各孔吸光度值，再利用测出的样品蛋白浓度计算出细胞中sod和mda含量。
采用统计软件spss17.0进行统计学处理，数据用x̅±s表示，采用单因素方差分析进行组间比较，p<0.05为有差异，具有统计学意义。
4.2测定结果
4.2.1黄柏蜜炙前后对氧化损伤l929细胞no含量的影响
与空白组相比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组相比，#p<0.05，##p<0.01；同剂量蜜炙品与生品相比：ap<0.05，aap<0.01。
4.2.2黄柏蜜炙前后对氧化损伤l929细胞sod含量的影响：
与空白组相比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组相比，#p<0.05，##p<0.01；同剂量蜜炙品与生品相比：ap<0.05，aap<0.01。
4.2.3黄柏蜜炙前后对氧化损伤l929细胞mda含量的影响：
与空白组相比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组相比，#p<0.05，##p<0.01；同剂量蜜炙品与生品相比：ap<0.05，aap<0.01。
从实验结果可知，与模型组相比，黄柏蜜炙品能显著升高氧化损伤l929细胞的sod活性和no含量(p<0.05或p<0.01)，降低mda的含量(p<0.05或p<0.01)，表明蜜炙黄柏有一定的治疗口腔溃疡的作用，而在这些不同的极性部位中，乙酸乙酯层的极性部位对口腔溃疡的治疗作用最好。故在本工艺制备过程采用乙酸乙酯剂型部位进行萃取，并对口腔溃疡症状进行治疗。
实施例2
黄柏饮片100g，加蜜水水拌匀（蜜：水=1:1），闷润至蜜水被吸尽，在120℃～130℃下炒制4分钟，晾凉，去除杂质，得蜜黄柏。取蜜炙后的黄柏，加10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，得醇浸膏。浸膏以适量水分散，用乙酸乙酯萃取，剩余水层再用石油醚萃取，回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取物，后用水转溶，浓度调整至0.11g/ml，即得。
实施例3
黄柏饮片100g，加蜜水拌匀（蜜：水=2:1），闷润至蜜水被吸尽，在中火下炒制6分钟，得蜜黄柏。取蜜炙后的黄柏，加15倍量70%乙醇回流提取2次，每次1h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，得醇浸膏。浸膏以适量水分散，用乙酸乙酯萃取，剩余水层再用乙酸乙酯萃取，回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取物，后用水转溶，浓度调整至0.11g/ml，即得。
实施例4
黄柏饮片100g，加蜜水水拌匀（蜜：水=0.5:1），闷润至蜜水被吸尽，在武火下炒制2分钟，得蜜黄柏。取蜜炙后的黄柏，加5倍量70%乙醇回流提取2次，每次1h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，得醇浸膏。浸膏以适量水分散，用正丁醇萃取，剩余水层再用乙酸乙酯正丁醇萃取，回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取物，后用水转溶，浓度调整至0.11g/ml，即得。
实施例5典型病例
病例1：张某，男，29岁，患口腔溃疡3天，上唇部可见溃疡两个，讲话时偶尔疼痛。经使用本发明实施例2的提取物涂抹后疼痛明显减轻，2天后治愈。
病例2：陈某，女，24岁，患口腔溃疡4天，舌下部可见豆粒大小的溃疡3个，吃饭时感到疼痛，经使用本发明实施例3的提取物涂抹5天后疼痛减轻，7天后治愈。