本发明属于乳品加工技术领域，具体涉及一种乳极性脂质的提取方法及其应用。
背景技术：
乳脂肪球膜是乳中包裹在脂肪球体外部的一层膜，由中性脂质、极性脂质、膜蛋白等成分构成，其中乳极性脂质含量约占总乳脂肪含量的1％，主要分为包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和神经鞘磷脂。相较于市场上常见的蛋黄卵磷脂或大豆磷脂，因含有神经鞘磷脂，乳极性脂质具有更多的功能特性，如减少心血管疾病、降低胃肠道感染、降低胆固醇吸收、免疫调节，促进婴儿大脑发育等作用，同时由于特殊的两性分子结构，也含有起泡性、乳化性、改善质构等作用，具有一定的工业应用价值。
国外报导的乳极性脂质可从酪乳(buttermilk)和奶油乳清(butterserum)中分离得到。酪乳和奶油乳清是奶油制作过程中不同阶段的副产物，含有乳脂肪球膜碎片，但通常被认为是低值产品，工业上干燥后常被用作动物饲料。
目前，提取乳极性脂质的难点在于如何把极性脂质与其它成份如蛋白、乳糖、矿物质和甘油三酯分开。已报导的乳极性脂质提取方式大致可分为物理提取和化学提取，物理提取法是利用超临界萃取技术或膜技术进行分离提取；化学提取法是通过氯仿、甲醇、乙醚、乙醇等有机溶剂进行提取。
gassijy等从奶油乳清中经过脱脂、热处理、酸沉淀酪蛋白、再通过超滤和透析除去矿物质、乳糖、乳酸等得到乳极性脂质，但该工艺分离方法复杂、成本高，且由于不能完全分离蛋白(酪蛋白、乳清蛋白和脂肪球膜蛋白)、甘油三酯和一些盐类等，分离的乳极性脂质纯度不高。
watanabes等用十倍体积的乙醇提取奶油乳清一夜，再将乙醇提取物溶解于氯仿甲醇水混合液中，置于分液漏斗中震荡后过夜，再收集下层有机相旋转蒸发去除氯仿甲醇后，用硅胶柱层析除去非极性脂质，得到极性脂质，此方法提取耗时较长，且步骤复杂。
技术实现要素：
针对现有问题的不足，本发明的目的是提供一种乳极性脂质的提取方法及其应用，具有提取效率高，速度快，工艺流程简单，易于推广应用的特点。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种乳极性脂质的提取方法，包括如下步骤：
(1)去除酪蛋白：将酪乳粉用蒸馏水溶解，搅拌均匀，将溶液ph调整为4.5-4.9，离心分离，取上清液备用；
(2)氯仿-甲醇提取复合脂质：将步骤(1)中提取的上清液中加入氯仿-甲醇溶液，搅拌后离心；分层后，吸取下层有机相，上层水相加入氯仿-甲醇溶液按上述步骤再次提取有机相，重复两次或两次以上，收集有机相旋转蒸发除去氯仿-甲醇，得到粘稠液体后氮吹至固态，即为复合脂质；
(3)丙酮沉淀乳极性脂质：在步骤(2)所得复合脂质中加入丙酮后搅拌；收集过滤后沉淀，得到乳极性脂质。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(1)中，所述酪乳粉质量与蒸馏水的体积比为1:7-10。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(1)中，离心时间为15-30min,转速4000-8000r/min。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(2)中，所述氯仿与甲醇的体积比为2:1。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(2)中氯仿-甲醇混合液体积与上清液体积比为1:4-6。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(2)中，搅拌速率为400-600r/min；离心时间为15-30min，转速6000-8000r/min。
上述乳极性脂质在制备乳极性脂质体中的应用，将酪乳粉中提取的乳极性脂质和胆固醇按摩尔比1:0.5-3混合，通过薄膜分散法制得。
作为本申请的优选技术方案，所述乳极性脂质和胆固醇的按摩尔比1:2混合，制备乳极性脂质体。
作为本申请的优选技术方案，将乳极性脂质溶于氯仿，加入胆固醇，混合后加入反应器中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，加入纯水后水化，将水化后的脂质体悬浮液进行超声制得均匀的乳极性脂质体。
作为本申请的优选技术方案，水化温度为37℃，时间1h；超声时间5s，超声间隙7s，80次，超声功率400w。
酪乳粉首先经过等电点沉淀去除乳酪蛋白，再通过氯仿-甲醇溶液提取得到乳混合脂质，实验中采用氯仿-甲醇多次抽提，提高提取率，在提取时通过搅拌，提高提取效率；因中性脂质溶于丙酮，极性脂质不溶于丙酮，因而在后续处理时加入丙酮使极性脂质分离开来，得到乳极性脂质。
利用得到的乳极性脂质与胆固醇进行比例混合，通过薄膜分散法即可得到乳极性脂质体。脂质体具有独特的亲和性和靶向性、可降低药物毒性、提高药物稳定性。由于乳极性脂质中大量神经鞘磷脂的存在，乳脂质体在一定条件范围内比大豆脂质体更加稳定，抗氧化能力更强。
有益效果
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
(1)采用酪乳粉为原料提取乳极性脂质，酪乳粉中甘油三酯含量较少，易于乳极性脂质的提取；
(2)酸沉酪蛋白、氯仿-甲醇提取复合脂质、丙酮沉淀极性脂质的工艺更简单，成本低，效果好；
(3)国内对于乳极性脂质的研究很少，国内市场也没有商业化的乳极性脂质，本专利提供了一种快速、高效的乳极性脂质提取方法，工艺流程简单，易于推广应用；
(4)本发明采用酪乳粉提取乳极性脂质，拓宽了脂质体制备原料的来源，提高了脂质体的稳定性和抗氧化能力；
附图说明
图1是磷脂含量测定的标准曲线图；
图2是实施例1提取的乳极性脂质的薄层层析图；
图3是实施例1制备的乳极性脂质体透射电镜图；
图4是实施例1制备的乳极性脂质体粒径分布图；
图5是实施例1制备的乳极性脂质体电位分布图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
实施例1
(1)沉淀酪蛋白：取酪乳粉30g，用300ml蒸馏水溶解，搅拌均匀，40℃水浴10分钟。通过乳酸将溶液ph调整为4.5-4.9，然后8000r/min转速离心30min，取上清液于烧杯中；
(2)有机溶剂提取：在上清液的烧杯中加入60ml氯仿-甲醇混合液(2﹕1v/v)，超声波搅拌器搅拌5分钟后，置于离心管中，然后8000r/min转速离心30min，用胶头滴管吸取最下层有机相，摒弃中间层的蛋白质沉淀，将上层水相倒入烧杯中，继续加入60ml氯仿-甲醇混合液提取脂质，搅拌离心后收集下层有机相，如此重复三次。混合三次有机相，在真空度-0.9mpa条件下，水浴35℃旋转蒸发，蒸发至粘稠液体时，倒出至烧杯中，氮吹至氯仿全部挥发，得到混合极性脂质；
(3)丙酮沉淀极性脂质：在混合脂质中加入10ml丙酮，充分搅拌。将贴壁沉淀刮下，所有沉淀过滤，收集滤纸上的沉淀，得到极性脂质。称取1mg极性脂质样品溶于1ml氯仿中制成样品溶液，可用于后续检测。
(4)极性脂质含量的测定
大豆磷脂标准溶液的配制：精密称取大豆磷脂5mg，至25ml容量瓶中，加氯仿使溶解并加至刻度，摇匀，制成0.2mg/ml的大豆磷脂标准溶液，4℃保存，备用。
显色剂的配制：准确称取2.705g三氯化铁和3.04g硫氰酸铵至100ml容量瓶中，加双蒸水使溶解并加至刻度，摇匀，制成显色剂溶液，室温保存。
大豆磷脂标准曲线的绘制：精密称取0.2mg/ml的大豆磷脂标准溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2ml于具塞离心管中，加氯仿至4ml，加硫氰酸铵溶液4ml，漩涡混匀1min，2000r/min离心10min，取下层。以氯仿为空白，在分光光度计485nm处测定吸光值a，以a对浓度c(mg/ml)进行线性回归，得标准曲线方程。图1为磷脂含量测定标准曲线。
极性脂质含量的测定：准确称取稀释过两百倍的样品溶液10μl，三份做平行，于具塞离心管中，按大豆磷脂标准曲线方法测定，最后根据标准曲线方程计算样品中极性脂质含量，可测得氯仿甲醇提取有机相中磷脂浓度为37.7mg/ml。
(5)薄层层析
溶液配制：将提取的乳极性脂质样品、磷脂酰胆碱(pc)(标准品，购于sigma公司)、磷脂酰乙醇胺(pe)(标准品，购于sigma公司)、磷脂酰肌醇(pi)(标准品，购于sigma公司)、磷脂酰丝氨酸(ps)(标准品，购于sigma公司)、神经鞘磷脂(sm)(标准品，购于sigma公司)溶解于氯仿，配置成1mg/ml的溶液。
点样：在硅胶板下端1cm左右画上横线，并在横线上均匀画上刻度，两边保持间距，用毛细管吸取一定量样品和标准品在刻度上点样，吹风机吹干。
展开剂配制：用氯仿-甲醇-水-氨水混合液(3:2:0.3:0.1，v/v/v/v)制成展开剂，倒入层析缸中。
将点完样的硅胶板放入层析缸中，40分钟后吹干硅胶板，置于碘缸中显色。
图2为乳极性脂质的薄层层析图，由图中可以看出乳极性脂质成份包括磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酰丝氨酸(ps)和神经鞘磷脂(sm)。
(6)脂质体制备：取样品溶液5ml，按极性脂质与胆固醇的摩尔比1﹕2来称取相应的胆固醇量，混合后加入圆底烧瓶中，55℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，脂质体以薄膜的形式贴于瓶壁。
(7)乳极性脂质体性状观测
采用透射电子显微镜观察乳极性脂质体形态：将水化后的脂质体悬浮液超声均质(超声时间5s，超声间隙7s，80次)，然后在高速冷冻离心机下离心，(10000r/min，30min)，弃去上清液，吸取2ml纯水将贴壁的脂质体吹散，成悬浮液，冷藏待电镜下观察。透射电子显微镜采用负染法，滴两滴制备好的脂质体于专用铜网上，自然晾干，再用2.5％的磷钨酸进行负染，自然挥干，使粒子在铜网上浓缩沉积，用透射电子显微镜观察并照相。图3为100nm下的脂质体的透射电镜图，脂质体为球形结构，形态较为圆整，脂质体分散较为均匀；
纳米粒度zeta电位仪测定粒径及电位：吸取少量乳脂质体悬浮液，稀释，用纳米激光粒度电位分析仪进行粒径及电位的测定，图4为脂质体的粒径分布图，粒径平均在324nm左右，粒度分布较为均匀。另外，图5为脂质体的电位分布图，脂质体zeta电位为-48.3mv，该脂质体为阴离子脂质体。
实施例2
与实施例1的区别在于，步骤(2)用75ml氯仿-甲醇(2：1，v/v)洗下旋转蒸发所得物，置于分液漏斗中，静置过夜。测得氯仿-甲醇提取有机相中极性脂质含量31.9mg/ml。
实施例3
与实施例1的区别在于，步骤(2)用50ml氯仿-甲醇(2：1，v/v)洗下旋转蒸发所得物，置于分液漏斗中，静置过夜。测得氯仿-甲醇提取有机相中极性脂质含量22.9mg/ml。
实施例4
与实施例1的区别在于，步骤(6)取样品溶液5ml，按极性脂质与胆固醇的摩尔比1：1.5来称取相应的胆固醇量，混合后加入圆底烧瓶中，55℃减压旋转蒸发除去有机溶剂。测得乳脂质体粒径为391.4nm，电位为-42.6mv。
实施例5
与实施例1的区别在于，步骤(6)取样品溶液5ml，按极性脂质与胆固醇的摩尔比1：3来称取相应的胆固醇量，混合后加入圆底烧瓶中，55℃减压旋转蒸发除去有机溶剂。测得乳脂质体粒径为434.3nm，电位为-44.1mv。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。