本发明涉及一种柚皮苷的应用，特别涉及柚皮苷用于制备治疗及延缓椎间盘退变的药物的应用。
背景技术：
下腰痛是骨科常见疾病，好发于40岁到80岁人群。严重下腰痛可使患者失去工作能力，给社会和家庭造成严重负担。40％以上的下腰痛是由椎间盘退变引起。但是目前为止，临床上尚无针对椎间盘退变的治疗药物可用。
椎间盘退变可由多种因素引起，如异常受力、局部营养缺乏以及先天基因异常等，其中氧化应激是椎间盘退变的主要致病机制之一，过度的氧化应激会引起髓核细胞凋亡，造成髓核组织的流失，加速椎间盘退变的进展。
柚皮苷(naringin)又称柚苷、柑桔苷、异橙皮苷，是从西柚皮中分离的一种双氢黄酮类化合物，有苦味，天然存在于芸香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，也是骨碎补、枳实、枳壳、化橘红等中药的主要有效成分之一。柚皮苷在多项药理学研究中展示出了良好的生物活性，例如抗肿瘤、免疫抑制、抗神经退行性疾病等。但是其对椎间盘退变疾病是否具有治疗作用尚不清楚。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种柚皮苷在减少髓核细胞的凋亡及延缓椎间盘退行性中的应用，特别涉及柚皮苷用于制备治疗及延缓椎间盘退变的药物的应用。相比西药较大的副作用，柚皮苷作为一种水果提取物，是一种中药成分，可以更加温和地延缓椎间盘退变，减少药物毒性。
上述柚皮苷的分子结构式为：
进一步的，所述药物还包括药用载体，所述药用载体选自微乳和纳米脂质体。
进一步的，所述药物的剂型为片剂、乳剂或胶囊。
进一步的，所述药物的柚皮苷用量为80mg/kg体重。
本发明所采用的有效成分柚皮苷作为一种具有良好的生物活性的植物提取物，具有用药剂量低，抗氧化效果明显的特点。相比西药，柚皮苷作为一种中药，其抗炎作用比较缓和，可以为椎间盘退变疾病的综合治疗提供一种替代治疗药物。
附图说明
图1是柚皮苷促进髓核细胞活性并且抑制氧化诱导髓核细胞的凋亡图，其中：(a)用不同浓度柚皮苷处理髓核细胞24小时，用细胞毒性检测试剂盒检测结果；(b)用不同浓度的tbhp处理髓核细胞4小时的cck-8结果；(c)用不同浓度的柚皮素预处理的髓核细胞4h，然后tbhp(50mm)处理髓核细胞的cck-8结果；(d)柚皮苷的化学结构；(e)westernblot检测髓核细胞中cleaved-caspase3，bax和bcl-2的蛋白表达；(f)bcl-2，bax和cleaved-caspase3的免疫印迹的定量图，图中的数据代表平均值±s.d。各组之间的显著差异表示为***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。
图2是柚皮苷激活ampk并且上调髓核细胞自噬图，其中：(a)通过蛋白质印迹在髓核细胞中评估p-ampk/ampk，lc3，beclin-1和p62的蛋白质表达图；(b-c)p-ampk/ampk，lc3，beclin-1和p62免疫印迹的定量图；图中的数据代表平均值±s.d。组间的显着差异表示为***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，ns>0.05
图3是柚皮苷诱导的自噬现象可被ampk抑制剂抑制图，其中：(a)p-ampk，ampk，beclin-1，bcl-2蛋白的表达，p62和lc3-ii/i通过以上处理的髓核蛋白质印迹评估图；(b)p-ampk/ampk，lc3，beclin-1和p62的免疫印迹的定量图；(c)lc3和核的免疫荧光染色在上述处理的髓核细胞中用dapi标记图。(原始放大倍数×400，比例尺：20μm)。(d)随机选择三幅图像用于定量lc3的免疫荧光，图中的数据表示平均值±s.d。各组之间的显着差异表示为***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05
图4是3-ma抑制柚皮素诱导的髓核细胞自噬图，将髓核细胞不处理(dmem10％fbs)或单独用tbhp(50μm)处理或用柚皮苷(100μm)和tbhp处理，或用tbhp和柚苷(100μm)与3-ma(10mm)处理髓核细胞。其中，(a)westernblot检测cleaved-caspase3，bax和bcl-2的蛋白表达；(b)lc3，beclin-1和p62的免疫印迹的定量；(c)lc3和核的免疫荧光染色，细胞核用dapi标记。(原始放大倍数×400，比例尺：20μm)。(d)随机选择三幅图像用于定量lc3的免疫荧光。图中的数据表示平均值±s.d。组间的显着差异表示为***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，ns>0.05
图5是抑制自噬能抑制柚皮苷在髓核细胞中的抗凋亡作用图。将髓核细胞不处理(dmem10％fbs)或单独用tbhp(50μm)处理或用柚皮苷(100μm)和tbhp处理，或用tbhp和柚苷(100μm)与3-ma(10mm)处理髓核细胞。其中(a)通过蛋白质印迹在如上处理的髓核细胞中评估切割的胱天蛋白酶3，bax和bcl-2的蛋白质表达；(b-d)切割的半胱天冬酶3，bax和bcl-2的免疫印迹的定量；(e)在上述处理的髓核细胞中进行tunel分析(原始放大倍数×200，比例尺：50μm)。(f)随机选择三个图像，并量化具有绿色荧光的细胞的数量。图中的数据表示平均值±s.d。各组之间的显着差异表示为***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05
图6是柚皮素通过自噬调节胶原ii，聚集蛋白聚糖和mmp13的表达图。将髓核细胞不处理(dmem10％fbs)或单独用tbhp(50μm)处理或用柚皮苷(100μm)和tbhp处理，或用tbhp和柚苷(100μm)与3-ma(10mm)处理髓核细胞。其中(a)通过q-pcr测定各组胶原蛋白ii，聚集蛋白聚糖和mmp13的mrna表达；(b-d)胶原蛋白ii和mmp13蛋白质和细胞核的免疫荧光染色；(c-e)随机选取3幅图像进行胶原蛋白ii和mmp13免疫荧光的定量。图中的数据代表平均值±s.d。组间的显着差异表示为***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，ns>0.05。
图7是柚皮苷改善大鼠损伤诱导的椎间盘退化图，其中：(a)在手术后4周和12周时用针穿刺的盘的大鼠尾部的磁共振t2加权像；(b)4周和12周时不同实验组的椎间盘代表性so染色和he染色；(c)分别于术后第4周和第12周进行pfirrmannmri评分，(原始放大倍数×40，比例尺：100μm)。随机选择3个切片进行定量，并显示代表性的例子；(d)在手术后4周和12周，在三组(每组6只)中评估组织学等级。显示的值是平均值±sd，每组6只大鼠。各组之间的显着差异表示为***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。
具体实施方式
1、实验步骤：
(1)造模方法：取大鼠2％戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉，碘伏消毒，取大鼠尾椎用27g穿刺针刺入，穿刺全层纤维环，留置60s后拔出，即获得大鼠尾椎椎间盘退变模型。术后，20mg/ml柚皮苷(生理盐水稀释)腹腔注射80mg/kg/d。
(2)原代培养：十只大鼠(雌雄各5只，100-150g)戊巴比妥钠过量处死。在无菌条件下，l1-l6的椎间盘和纤维环被拆除后，用解剖显微镜收集髓核。在37℃下，用0.1％胶原酶2mg/ml和透明质酸酶2u/ml处理4小时。消化后的髓核组织在含有15％fbs和1％双抗的dmem/f12培养基中，在37℃和5％co2的环境下孵育，并且24小时后更换一次培养基。最后用0.25％胰蛋白酶-edta来获得原代细胞。因为原代细胞外形直到第三代外形才开始变化，所以本次实验选用第二代细胞，培养细胞在37℃和5％co2的环境下，并且每两天换一次培养液。
(3)细胞毒性检测(cck8法)：将8×104个/cm2浓度的二代细胞播种在96孔板中，在不同浓度的柚皮苷(0,25,50,100,150,200μm)中孵育24小时。细胞用pbs冲洗后，在含有10μlcck-8的100μldmem/f12培养液中培养2小时。最后各孔吸光度由酶标仪测得。所有实验重复三次。
(4)免疫荧光：将髓核细胞放入六孔板中，用50μmh2o2处理，或50μmh2o2和100μm柚皮苷混合处理4h后。用pbs洗涤5分钟×3次，再用4％多聚甲醛固定。用pbs洗涤5min×3次后加入0.5％的tritonx-100处理10min。用pbs洗涤5min×3次，再用5％的bsa封闭30min。吸干pbs，滴加collagenii(1:200),mmp-13(1:200)c-caspase3(1:200)和lc3(1:200)，4℃过夜。次日，pbs洗涤5min×3次后，用细胞用绿色荧光二抗(1:400)室温避光孵育1h。用pbs洗涤后，再用dapi染核。再用pbs洗涤5min×3次后，滴加抗荧光淬灭剂，封片。取玻片于荧光显微镜下观察并拍摄。
(5)westernblots：髓核细胞溶液中添加含1毫米pmsf的ripa，放在冰上5分钟，同刮刀刮取，3000转离心机离心10分钟和4度12000转离心机离心30分钟，随后用bca蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。30μg的蛋白质在sdspage电泳，在醋酸纤维膜上转膜，用5％的脱脂牛奶封闭。随后用一抗cleavedcaspase3(1:1000),bax(1:1000),bcl-2(1:1000),beclin-1(1:1000),lc3(1:500)和p62(1:1000)在4℃下孵育过夜。在添加二抗和显色液后，使用imagelab3.0测定蛋白浓度。
(6)tunel法：髓核细胞在六孔板培养12小时，用4％的多聚甲醛固定后，用0.1％的冰triton孵育10分钟。用tunel试剂盒和dapi(染核)后，可在荧光显微镜下观察细胞凋亡的变化。
(7)实时荧光定量pcr：trizol法提取总rna，并测定浓度用primescripttm逆转录试剂盒进行反转录，用sybr(上海生工)试剂盒进行试验，并且统计数据，进行表达差异分析。
ii型胶原蛋白α1(col2α1)基因引物具有：
正义链序列seqidno.1：ctcaagtcgctgaacaacca
反义链序列seqidno.2：gtctccgctcttccactctg
聚集蛋白聚糖(aggrecan)基因引物具有：
正义链序列seqidno.3：aagtgctatgctggctggtt
反义链序列seqidno.4：ggtctggttggggtagaggt
mmp13基因引物具有：
正义链序列seqidno.5：ctgcggttcactttgagga
反义链序列seqidno.6：tcttctatgaggcggggata
(8)组织病理学分析：在椎间盘穿刺处理后第4周和第12周，用10％戊巴比妥钠腹腔注射处死大鼠，将鼠尾椎间盘固定在甲醛、脱钙、脱水、石蜡包埋，组织切片为5微米厚度矢状位切片，分别用番红苏木精复染和曙红苏木精复染。另一边，在盲法下，组织学研究者进行椎间盘细胞和组织的观察，并使用分级评价(1-5为正常椎间盘，6-11为中度退变椎间盘，12-14为重度退变椎间盘)。
(9)mri：在椎间盘穿刺处理后4周和12周，对动物进行mri检查，以反映结构的变化。矢状位t2加权图像，断层厚度2毫米，并用双盲盲法下进行pfirrmann评分。
2、实验结果：
(1)柚皮苷促进髓核细胞活性并且抑制氧化诱导髓核细胞的凋亡。(图1)
所有实验前，我们测定了24小时不同浓度的柚皮苷处理后髓核细胞的细胞活性，发现细胞活性并没有明显下降，我们随后测定了4小时不同浓度的tbhp处理后，髓核细胞的细胞活性，发现随tbhp浓度的上升而细胞活性明显下降(p＜0.001)，且50μm时明显。tbhp过氧化处理情况下加入柚皮苷，通过细胞活性我们发现柚皮苷对髓核细胞的保护作用(p＜0.01)。并且蛋白cleaved-caspase3，bax的上升和bcl-2的下降象征的凋亡，通过westernblots显示柚皮苷的加入降低了cleaved-caspase3，bax，上升了bcl-2的浓度，间接反映了柚皮苷的抗凋亡作用(p＜0.05)。
(2)柚皮苷激活ampk并且上调髓核细胞自噬。(图2)
同时，在tbhp过氧化处理情况下，我们发现自噬相关的经典指标，如lc3和beclin-1随柚皮苷加入而上升，是另一个自噬相关的经典指标p62反而下降，提示自噬流阻断，同时p-ampk/ampk在柚皮苷的作用下上调，实验提示上调自噬可能和柚皮苷抑制氧化诱导髓核细胞的凋亡存在潜在的联系。
(3)柚皮苷诱导的自噬现象可被ampk抑制剂抑制。(图3)
为了发现自噬与ampk之间的关系，我们采用了ampk抑制剂化合物c蛋白。实验(2)已发现，lc3和beclin-1以及p-ampk/ampk随柚皮苷加入而上升，p62随柚皮苷加入反而下降。随着ampk抑制剂化合物c蛋白的加入，我们通过自噬相关的经典指标间接发现自噬现象消失(p＜0.05)，另外，lc3的荧光进一步证实自噬现象的消失。从而证明柚皮苷激活自噬是通过ampk途径诱导的。
(4)柚皮苷通过自噬来抑制氧化诱导髓核细胞的凋亡(图4、5)
为了找出自噬和柚皮苷抑制氧化诱导髓核细胞的凋亡之间的关系，我们使用了经典的诱导自噬抑制剂3-ma。实验证明了在tbhp过氧化处理髓核细胞后，柚皮苷可诱导自噬现象。随后我们使用自噬抑制剂3-ma用于实验，通过westernblot发现lc3-ii/i，beclin-1蛋白比值下降(p＜0.05)p62的增加，间接反映了自噬现象的消失，同时，我们通过lc3的荧光进一步证实自噬现象的消失(p＜0.05)。随后，我们通过westernblot，蛋白cleaved-caspase3，bax的上升和bcl-2的下降表示髓核细胞的凋亡增加(p＜0.05)。从而证明柚皮苷通过自噬来抑制氧化诱导髓核细胞的凋亡。
tunel法检测结果显示，随着tbhp的处理，细胞凋亡发生率明显增加；在增加柚皮苷处理后，能显著逆转这种现象；然而，继续添加3-ma，柚皮苷对细胞凋亡的保护作用被消除。从而证明柚皮苷通过自噬来抑制氧化诱导髓核细胞的凋亡(p＜0.05)。
(5)柚皮苷通过自噬调节细胞外基质的表达(图6)
ii型胶原和蛋白聚糖是髓核基质的成分，与椎间盘退变息息相关。在图3a所示，tbhp诱导凋亡能显著降低蛋白聚糖和ii型胶原mrna的表达，同时上调mmp13mrna的表达。随后，添加柚皮苷可增加蛋白聚糖和ii型胶原mrna的表达，降低mmp13mrna的表达。然而，自噬抑制剂3-ma预处理将抑制柚皮苷的作用(p＜0.05)。同时，免疫荧光也证实上述现象(p＜0.05)。从而证明柚皮苷通过自噬来调节细胞外基质，从而作用于椎间盘退化。
(6)柚皮苷能改善大鼠损伤诱导的椎间盘退化(图7)
我们通过磁共振成像(mri)和pfirrmannmri分级评分来评价大鼠椎间盘的退化情况。穿刺后4和12周的mri图像中，穿刺后4周获得的mr图像在柚皮苷处理组中比在盐水组中显示更强的t2加权信号强度。在12周时也观察到相似的结果(图7a-b)。另外，4周时(p<0.05)和12周时(p<0.05)，柚皮苷处理的治疗组的大鼠pfirrmannmri评分显着低于盐水对照组(p<0.05)。
在高倍镜组织学观察下，正如图7c所示，如图7c所示，苏木精-伊红(he)染色(用于观察髓核组织的一般组织学结构)显示在媒介物(saline生理盐水)治疗的idd组中，髓核的结构在4周时间点几乎消失；而在柚皮苷治疗的idd组中，结构可以保留，椎间盘内仍可见髓核组织清晰，组织完整，完全消失。番红o(safrannino)染色(蛋白聚糖和糖胺聚糖染色)显示柚皮苷处理组不仅结构良好，而且髓核组织胞外基质保存较好；有趣的是，我们还发现柚皮苷处理组的软骨终板比载体组更厚，保持更完整的结构，这说明柚皮苷对终板软骨保护也有益处。对于12周的he染色和safrannino染色，虽然柚皮苷对髓核细胞形态和细胞外基质的保存作用远弱于4周时间，但仍然可以发现柚皮苷与载体组之间的差异柚皮苷可长期(12周)治疗改善idd。
sequencelisting
<110>温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院
<120>一种柚皮苷在制备治疗及延缓椎间盘退行性变药物的应用
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