本发明属于中草药的提取技术领域，具体地，涉及一种超临界co2萃取柴胡疏肝散中有效成分的方法。
背景技术：
柴胡疏肝散，中医方剂名，出自《景岳全书》，原方用于治疗“胁肋疼痛、寒热往来”，其临床疗效显著，应用范围较广，是疏肝解郁的良方，由陈皮、柴胡、川芎、香附、枳壳、芍药、甘草组成。具有疏肝理气，活血止痛之功效。主治肝气郁滞证。胁肋疼痛，胸闷善太息，情志抑郁易怒，或嗳气，脘腹胀满，脉弦。临床常用于治疗慢性肝炎、慢性胃炎、肋间神经痛等属肝郁气滞者。
目前，从中药中提取挥发性/半挥发性生物活性成分的方法有很多，包括水蒸气提取法，有机溶剂萃取，醇提取，超声提取，微波辅助萃取等等。然而，上述方法存在着明显的缺陷，如常大量使用易燃的有机溶剂、工艺步骤繁杂、耗费时间长、易造成热敏性成分的降解和挥发成分的损失以及有机溶剂残留问题。从中药中提取挥发油的传统方法为水蒸汽蒸馏法、有机溶剂萃取法和压榨法，其中以水蒸汽蒸馏法最为常用。传统的提取方法不仅收率很低，而且由于芳香性成分的大量损失及某些成分的分解变化使最终产品质量较差。中药挥发油沸点较低，摩尔质量不大，极性小，在超临界co2流体中具有良好的溶解性能，因此是一类适于用超临界co2流体提取的成分。
由co2的压力-密度等温线（对比压力与对比密度的关系线）可知，在稍高于临界点温度的区域内，压力稍有变化，就会引起流体密度的很大变化，且超临界流体的密度接近流体的密度。所以，超临界流体对液体、固体的溶解度与流体溶解度比较接近。超临界流体与待分离组分的化学性质越接近，溶解度越大。在高密度条进下（低温、高压）去萃取溶质组分，然后稍微提高温度或降低压力使萃取剂与溶质分离。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种超临界co2流体萃取柴胡疏肝散中有效成分的方法，本发明通过采用该工艺方法，能最大程度的提取柴胡疏肝散中的有效成分。
本发明的超临界co2萃取柴胡疏肝散中有效成分的方法中，柴胡疏肝散的组成为：陈皮30g，柴胡22.5g，川芎22.5g，香附22.5g，枳壳22.5g，芍药22.5g，甘草7.5g，共计150g每份。
本发明的超临界co2萃取柴胡疏肝散中有效成分的萃取工艺如下：
（1）备料：将原料组分于40℃鼓风干燥机干燥5小时，粉碎过20,40,60,80目筛，取筛下物，按比例要求混合颗粒。
（2）萃取：采用超临界萃取设备装置，将150g混合的干草药装入1l高压萃取釜中，并用液体co2萃取精油。萃取温度为：40-60℃，萃取压力为：150-350bar，物料粒径为（取平均粒径）：0.15-0.6mm。萃取时间为2小时。分离器i的温度为40℃，压力为8mpa；分离器ii的温度为35℃，压力为4mpa．萃取物进入分离器减压分离后，从气态co2中完全分离。收集分离器流出的精油，即为所需提取物。
本发明还提供了上述超临界co2萃取柴胡疏肝散中有效成分的方法所得有效成分的抗炎制药用途。
本发明还提供一种采用测定特定细胞因子分析药物抗炎性效果的方法。具体步骤为：通过巨噬细胞抗炎模型实验确定具有抗炎作用的活性成分，其中所述巨噬细胞抗炎模型实验包括：
（1）将目标中药组分针对巨噬细胞分别进行细胞毒评估，确定无显著细胞毒的目标中药成分的浓度。
（2）将目标巨噬细胞分组培养，每组的培养液中加入一种已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药成分以及指定炎症诱导剂，培养结束后，确定各培养液上清液中的il-6和tnf-α的含量，并根据其含量确定目标中药成分对巨噬细胞的il-6和tnf-α的抑制率。
（3）应用具有抗炎效果的celebrex代替步骤（2）中的目标中药成分，重复执行步骤（2）部分的操作，确定目标中药成分具有抗炎活性。
相较于现有技术，本发明提供的超临界co2萃取柴胡疏肝散精油的最优工艺具有以下有益效果：
1、以柴胡疏肝散为原料，本发明提供的萃取工艺条件下能够得到最高的精油提取率；
2、萃取得到的柴胡疏肝散精油具有一定的优点，其抗炎药效较好，提取率较高，环保。
本发明方法工艺简单，操作方便，提取率远远高于传统水煮和有机溶剂萃取，且整个工艺对人体无毒，适合药物有效成分的提取。本发明方法所制得的复方精油具有较好的抗炎活性。
附图说明
图1为超临界co2流体萃取柴胡疏肝散中精油的工艺流程图。
图2为精油萃取率预测值和实验值对比图。
图3为柴胡疏肝散提取精油细胞活性。
图4为celebrex阳性对照组细胞活性。
图5为柴胡疏肝散提取精油细胞il-6含量。
图6为celebrex阳性对照组细胞il-6含量。
图7为柴胡疏肝散提取精油细胞tnf-α含量。
图8为celebrex阳性对照组细胞tnf-α含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1超临界co2萃取柴胡疏肝散中有效成分的工艺优化
采用响应面方法分析三个因素（提取温度，提取压力和粒度）对ey的影响，其他变量为固定值，如提取时间为120分钟，二氧化碳流量为43.67l/h，css粉末重量为150g。为了减少实验次数和降低成本，本实验采用小面中心组合设计（sfccd）进行实验方案的设计。如表1所示，实验根据sfccd推荐的15组操作参数进行，包括四个阶乘点，六个轴向点和5个中心点。实验结果采用方差分析方法（aov）对三个自变量和ey的相互影响进行分析，运用f-值检验法和p-值分析每项系数对响应值的统计显著性，并采用非线性拟合的方法，建立二次多项回归拟合方程，用此统计模型来预测最高产率。
超临界co2萃取装置ha121-50-01，如图1所示，由华安超临界流体萃取有限公司（南通，中国）提供。提取装置主要由一个1升的萃取釜和两个分离器组成。在发明中，将150g混合的干草药混合物装入1l高压萃取釜中，并用液体co2萃取精油。二氧化碳气体在带有冷凝器的压缩泵进行液化，并且通过泵将输出压力增加到所需的压力后进入萃取釜。随后，萃取物和液态co2进入到分离器i中，解析温度为40℃，压力为8mpa，通过压力调节co2的密度和精油的溶解度使萃取物和co2进行分离。在分离器ii中进一步解析，温度为35℃，压力为4mpa，调节压力低于超临界流体的压力使液态co2变成气态，液体油从气态co2中完全分离。分离器ii流出气体流入净化器进行循环使用。分离器i和分离器ii中每隔六十分钟取一次样，最终产率由多次取样的累积量进行计算。称重后的精油储存于-20℃进行进一步分析。各组实验萃取釜中的温度、压力、物料粒径以及精油萃取率如表1所示：
表1各组实验萃取釜中的温度、压力、物料粒径以及精油萃取率
分析各变量之间的相互影响是超临界流体萃取研究中的重要一步。初步研究是基于压力（p），温度（t）和粒度（ps）三个独立变量而开展的。由aov获得的f值和p值用来判断各系数的显著性，其中，f值越大，p值越小，ey与相应项的相关性越显著。从统计分析结果可以推断出压力（p），温度（t）和粒径（ps）对ey均有着显著影响（p<0.05）。其中压力对ey有着正线性影响，温度和粒径对ey有负线性影响。通过最小二乘法计算模型的截距，线性，二次和交叉项的回归系数，建立二次多项式拟合方程。该方程的复相关系数“r2”，校正的复相关系数“adjustedr2”和预测的复相关系数“predictedr2”如表2所示。adjustedr2的值0.9958很接近于predictedr2的值0.9084，说明该方程完全符合拟合要求。此外，图2中的散点图，对实验ey与预测的ey进行比较，也表明该模型与实验数据相符合。相关系数r2为0.9985说明该二次多项式方程完全满足拟合要求。
表2拟合方程相关系数表格
二次多项式模型如下（其中x1为温度，x2为压力，x3为物料粒径）：
最佳运行参数如下：温度为40℃（t），压力为312.7433bar（p）和物料粒径为0.3232mm（ps），精油最大产量为3.2881％（w/w）。
实施例2超临界co2萃取柴胡疏肝散所得有效成分的抗炎效果实验
将冻存细胞自液氮中小心取出，迅速放置于37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，离心弃去上清液，移入含培养液的培养瓶内，置于37℃，5%co2温箱中培养，次日可以换液，弃去漂浮的死亡细胞，此时存活的细胞大部分可贴壁生长并繁殖。
人thp-1细胞株置于rpmi1640培养液中，培养液中加入2%的fbs胎牛血清，1%的青霉素和链霉素，在专用孵箱里生长。适时换液，选细胞长势90%做实验用。细胞计数达6×105/ml，接种于24孔板培养皿中，于含100ng/ml佛波酯（pma）、0.3%bsa的无血清rpmi1640培养液中培养24h诱导分化。通过光镜进行形态学观察，鉴定细胞是否分化为巨噬细胞。
细胞分化成巨噬细胞后开始下一部实验。
实验分组：
①组：正常组（无lps）；
②组：对照组，加lps；
③加药物低浓度组：浓度为2µg/ml；
④加药物中等浓度组：浓度为10µg/ml；
⑤加药物中高浓度组：浓度为20µg/ml；
⑥加药物高浓度组：浓度为40µg/ml；
⑦阳性对照组：分别设置浓度为2,10,20,40µg/ml的celebrex样液。
以上实验组每个样设置3个复孔。置于37℃，5%co2温箱中培养24小时后取上清液保存于-20℃冰箱用于下一步实验。
细胞活性测试：根据cck-8说明书进行反应4小时后测其od值，每组设置3个复孔。
抗炎性能测试：根据humanil-6elisakit和humantnf-αelisakit试剂盒说明书进行测试，每组设置3个复孔。
tnf-α和il-6是主要的促炎细胞因子。首先，通过elisa试剂盒测定细胞上清液中tnf-α和il-6的含量。单用lps作用于细胞导致细胞发生炎症反应，可以导致tnf-α和il-6的含量增加。
图3和图4分别表示柴胡疏肝散超临界萃取精油和阳性对照物celebrex不同浓度下对细胞活力的影响。图5表示柴胡疏肝散超临界萃取精油不同浓度下对细胞中炎症因子il-6的影响。由图5可看出柴胡疏肝散精油可以降低细胞炎症因子的释放，随着精油浓度的增加抑制作用明显增强，炎症因子释放越少。图6表示阳性对照物celebrex不同浓度下对细胞中炎症因子il-6的影响，其作用效果同柴胡疏肝散精油一样，相同浓度下其对炎症因子il-6的抑制作用力比柴胡疏肝散精油强。图7表示柴胡疏肝散超临界萃取精油不同浓度下对细胞中炎症因子tnf-α的影响。图8表示阳性对照物celebrex不同浓度下对细胞中炎症因子tnf-α的影响。由图7和图8不能得出提取精油对炎症因子tnf-α的作用效果。
由此可知，柴胡疏肝散精油的抗炎作用主要是通过抑制炎症因子il-6释放而进行。柴胡疏肝散超临界萃取精油具有很好的抗炎作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。