本发明涉及植物成分萃取
技术领域：
，具体涉及一种黄连生物碱的萃取方法。
背景技术：
：黄连是一种常用的中草药，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，其主要药物活性成分为黄连生物碱，包括小檗碱、巴马汀、药根碱和黄连碱等，其中小檗碱含量最高。经研究发现黄连根中的生物碱具有抗炎抗菌、降血糖、降血压、抗溃疡、抗肿瘤、神经调节等作用。传统黄连生物碱的提取方法多采用有机溶剂萃取，再通过重结晶等手段使之纯化，其提取步骤繁多，需要使用大量有机溶剂，易带来溶剂残留及环境污染等问题。现有技术中，采用双水相体系、磁性纳米粒子、纸基固相微萃取等新技术来提取黄连生物碱，但是双水相体系中采用聚乙二醇为溶剂，而聚乙二醇形成的溶液体系粘度大，易乳化，分相时间长；磁性纳米粒子制作复杂，耗时长，成本高；纸基固相微萃取操作复杂，耗时长。因此有必要提供一种新型的黄连生物碱的萃取方法，以解决上述技术问题。技术实现要素：本发明的主要目的是提供一种黄连生物碱的萃取方法，以解决现有黄连生物碱的提取方法操作复杂、提取时间长、提取率低的技术问题。为实现上述目的，本发明提出的黄连生物碱的萃取方法，包括以下步骤：步骤一、将黄连研磨成粉，加入盐酸溶液中，进行粗提取，过滤并收集滤液，将滤液冷冻干燥后得到黄连粗提物；步骤二、将乙腈和水以2～12:3的体积比混合制成乙腈水溶液，再加入所述步骤一制备的黄连粗提物，涡旋振荡，得到混合液；步骤三、在所述步骤二制备的混合液中加入硫酸铵，涡旋振荡混匀后，离心静置后分层，取上相干燥后，得到所述黄连生物碱。优选地，所述步骤一具体包括：将黄连研磨成粉，加入盐酸溶液中，采用回流提取后，过滤，收集滤液和滤渣，将滤渣重复加入盐酸溶液中采用回流提取，过滤并收集滤液，滤渣重复回流提取至少一次，将多次得到的滤液混合，冷冻干燥后得到黄连粗提物。优选地，在所述步骤一中，黄连与盐酸溶液的质量浓度为3～5kg/m3，盐酸溶液的浓度为0.8～1.2mol/l。优选地，在所述步骤一中，回流提取的加热温度为60～100℃，时间为0.5～1h。优选地，所述步骤二中，涡旋震荡的时间大于或等于1min。优选地，所述硫酸铵的质量为0.5～2.0g。优选地，在所述步骤二中，乙腈和水以(2～4)：2的体积比混合制成乙腈水溶液。优选地，在所述步骤二中，黄连粗提物与乙腈水溶液的质量浓度为0.15～0.2kg/m3。本发明中的黄连生物碱的萃取方法为液液萃取方法，具体通过将在硫酸铵加入乙腈水混合溶液中，以使得乙腈水混合溶液分层，利用分层后的乙腈相极性与黄连生物碱的萃取极性范围相似，从而能有效萃取黄连生物碱。与传统的液液萃取相比，本发明操作简单，乙腈毒性小，针对黄连中小檗碱、黄连碱、巴马汀和药根碱四种原小檗碱类生物碱的分离萃取率高达98％以上。附图说明图1为本发明黄连生物碱的萃取方法一实施例的流程示意图；图2为本发明黄连生物碱的萃取方法一实施例制备的乙腈相和水相的液相色谱图；图3为本发明黄连生物碱的萃取方法一实施例对黄连生物碱标准溶液进行萃取制备的乙腈相的液相色谱图；图4为采用不同有机溶剂的萃取率的折线图；图5为采用不同诱导剂的萃取率的柱状图；图6为采用不同体积比的乙腈和水制成的乙腈水混合溶液的萃取率的折线图；图7为采用不同质量的硫酸铵的萃取率的折线图；图8为采用不同萃取时间的萃取率的折线图。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。除非另有特别说明，本发明中陈述的黄连生物碱特指药根碱(jatrorrhizine或jateorhizine)、黄连碱(coptisine)、巴马汀(或巴马亭，palmatine)和小檗碱(berberine)。请参阅图1，为本发明黄连生物碱的萃取方法一实施例的流程示意图。本发明提出一种黄连生物碱的萃取方法，包括以下步骤：步骤s1、将黄连研磨成粉，加入盐酸溶液中，进行粗提取，过滤并收集滤液，将滤液冷冻干燥后得到黄连粗提物；具体地，将黄连研磨成粉，加入浓度为0.8～1.2mol/l盐酸溶液中，黄连与盐酸溶液的质量浓度为3～5g/l，采用60～100℃加热回流提取0.5～1h后，过滤并收集滤液，得到滤液和滤渣，将滤渣再次加入浓度为0.8～1.2mol/l盐酸溶液中，黄连与盐酸溶液的质量浓度为3～5kg/m3，采用60～100℃加热回流提取0.5～1h后，过滤并收集滤液，将两次获得的滤液混合，冷冻干燥后得到黄连粗提物。需要说明的是，本领域技术人员可根据实际需要对滤渣进行多次回流提取，以增加黄连粗提取中含有的黄连生物碱。本领域技术人员可以理解的是，粗提取具体可以采用索氏提取法、多功能提取罐等方法进行回流提取，也可以采用超声波提取、蒸煮法等其他提取方法，在本发明中，具体如何进行粗提取不做限定。由于药根碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱均为季铵碱，不易溶于水，加入盐酸溶液中，与盐酸发生酸碱反应，从而溶于溶液中，可以有效地去除黄连中的固体杂质，并将黄连生物碱溶于盐酸溶液中。步骤s2、将乙腈和水以2～12:3的体积比混合制成乙腈水溶液，再加入所述步骤s1制备的黄连粗提物，涡旋振荡，得到混合液；具体地，将乙腈和水以2～12:3的体积比混合制成乙腈水溶液，再加入所述步骤s1制备的黄连粗提物，涡旋振荡1min以上，得到混合液，混合液中黄连粗提物与乙腈水溶液的质量浓度为0.18kg/m3。步骤s1中制备的黄连粗提物中含有的黄连生物碱能有效的溶于乙腈水溶液中。步骤s3、在所述步骤s2制备的混合液中加入硫酸铵，涡旋振荡混匀后，离心静置后分层，取上相干燥后，得到所述黄连生物碱。具体地，在所述步骤s2中制备的混合液中加入0.5～2.0g硫酸铵，涡旋振荡，5000rpm离心3min，静置后分层，上相为乙腈相，下相为水相，黄连生物碱溶于乙腈相中，取上相干燥后，得到所述黄连生物碱。氢键的强度可影响溶液极性的大小，而溶液极性的大小用甜菜碱30的摩尔电子跃迁能表示，et(30)＝hcna/λmax＝28,591/λmax其中，h为普朗克常数，c为光速，na为阿伏伽德罗常数，λmax为甜菜碱30的电荷转移吸收带的最大吸收波长。et越大，溶液极性越大，氢键强度越大。有机溶剂和水混合后形成均相混溶体系，λmax(紫外可见光谱)增大，et减小，溶液极性减小。加入盐溶解于均相混溶体系中，盐电离出的阴阳离子诱导相分离，有机相λmax减小，et增大，极性增大。因此，相分离后溶液中的氢键强度产生不同变化，分相后各相溶液的极性也发生不同变化。在本实施例中，通过硫酸铵对乙腈水溶液中的溶液极性的诱导改变，产生的盐析效应会降低亲水性化合物在水溶液中的溶解度，增大在有机相中的比例，又利用乙腈相的极性与黄连生物碱的萃取极性范围相似，从而能有效萃取黄连生物碱。在本发明中，利用乙腈与水在室温下可以以任意比例互溶，相比其他应用在传统液液萃取中的有机溶剂，乙腈具有低毒性，更加环保和安全；采用乙腈作萃取剂，萃取后杂质成分少，萃取更加纯净；通过在乙腈水溶液中添加硫酸铵萃取黄连生物碱，操作方法简单，萃取时间短，萃取效率高，经检测通过本发明提供的黄连生物碱的萃取方法萃取的黄连生物碱的萃取率高达98％以上。以下通过具体实施例对本发明提出的黄连生物碱的萃取方法及其制备方法进行具体说明：实施例1将0.1g黄连研磨成粉，加入25ml浓度为1mol/l盐酸溶液中，采用80℃加热回流提取1h后，过滤并收集滤液，得到滤液和滤渣，将滤渣再次加入25ml浓度为1mol/l盐酸溶液中，采用80℃加热回流提取1h后，过滤并收集滤液，将得到的滤液混合，冷冻干燥后得到黄连粗提物。将乙腈和水以6：4的体积比混合制成乙腈水溶液，在55ml的乙腈水溶液中加入10mg黄连粗提物，涡旋振荡1min，得到混合液。在混合液中加入1.0g硫酸铵，涡旋振荡，离心静置后分层，上相为乙腈相，下相为水相，黄连生物碱溶于乙腈相中，取上相干燥后，得到所述黄连生物碱。实施例2将1kg黄连研磨成粉，加入200l浓度为1.2mol/l盐酸溶液中，采用100℃多功能提取罐提取1h后，过滤并收集滤液，得到第一次滤液和滤渣，将滤渣再次加入200l浓度为1.2mol/l盐酸溶液中，采用100℃加热回流提取1h后，过滤并收集得到第二次滤液，将所述第一次滤液和所述第二次滤液混合，冷冻干燥后得到黄连粗提物。将乙腈和水以8：2的体积比混合制成乙腈水溶液，在100l的乙腈水溶液中加入15g黄连粗提物，涡旋振荡2min，得到混合液。在混合液中加入2.2kg硫酸铵，涡旋振荡，离心静置后分层，上相为乙腈相，下相为水相，黄连生物碱溶于乙腈相中，取上相干燥后，得到所述黄连生物碱。实施例3将3g黄连研磨成粉，加入1l浓度为0.8mol/l盐酸溶液中，采用60℃加热回流提取1h后，过滤并收集滤液，得到第一次滤液和滤渣，将滤渣再次加入1l浓度为0.8mol/l盐酸溶液中，采用60℃加热回流提取1h后，过滤并收集得到第二次滤液，将所述第一次滤液和所述第二次滤液混合，冷冻干燥后得到黄连粗提物。将乙腈和水以6：4的体积比混合制成乙腈水溶液，在0.6l的乙腈水溶液中加入300mg黄连粗提物，涡旋振荡1.5min，得到混合液。在混合液中加入1.5g硫酸铵，涡旋振荡，离心静置后分层，上相为乙腈相，下相为水相，黄连生物碱溶于乙腈相中，取上相干燥后，得到所述黄连生物碱。为阐明本发明黄连生物碱的萃取方法萃取率高，将上述实施例1～3中的萃取方法制得的产物进行试验，以证明其萃取率，但该实验不能对本发明的范围构成任何限制。采用以下方法对本实施例中黄连生物碱的萃取方法的萃取率进行验证。通过高效液相色谱(hplc)检测实施例1中经一次回流提取得到的滤液和粗提物，检测得到滤液中四种黄连生物碱的总含量为105.82mg/g。取10mg粗提物溶解于100ml水中，经高效液相色谱检测分析后，检测得到四种黄连生物碱的总含量为508.54mg/g。所以采用多次回流提取能增加得到的粗提物中的黄连生物碱的含量。通过高效液相色谱检测实施例1中的乙腈相和水相。请参阅图2，为本发明黄连生物碱的萃取方法一实施例制备的乙腈相和水相的液相色谱图，其中，曲线a为乙腈相，曲线b为水相。由图2可以看出，4种黄连生物碱均溶于乙腈相中。制备5μg/ml的黄连生物碱标准溶液，以黄连生物碱标准溶液替代本发明中的粗提物，并采用本实施例1～3提供的黄连生物碱的萃取方法进行萃取。请参阅图3，为本发明黄连生物碱的萃取方法一实施例对黄连生物碱标准溶液进行萃取制备的乙腈相的液相色谱图。由图3可以看出，本发明能有效提取黄连中的黄连生物碱，并且杂质少。通过以下公式计算黄连生物碱萃取率：其中：r为相比，vb为下相体积，vt为上相体积，k为分配系数，cb,ct为上相中黄连生物碱的浓度，y为黄连生物碱萃取率。计算出采用实施例1～3提供的黄连生物碱的萃取方法的萃取率，具体请参阅表1：表1采用实施例1～3提供的黄连生物碱的萃取方法对黄连生物碱标准溶液进行萃取的萃取率药根碱黄连碱巴马汀小檗碱实施例198.59％99.35％98.29％99.31％实施例298.57％99.34％98.28％99.29％实施例398.50％99.31％98.27％99.29％由表1可得出，采用本发明提供的黄连生物碱的萃取方法进行萃取的效率高达98％以上。设置3组平行对照实验组，对黄连生物碱标准溶液进行萃取。具体地，采用的萃取方法与实施例1的步骤s1和步骤s3相同，不同之处在于，在步骤s2中分别采用乙腈水混合液、丙酮水混合液和正丙醇水混合液溶解所述步骤s1制备的黄连粗提物，乙腈水混合液中乙腈和水的体积比为1:1，丙酮水混合液中丙酮和水的体积比为1:1，正丙醇混合液中正丙醇和水的体积比为1:1。请参阅图4，为采用不同有机溶剂的萃取率的折线图。由于有机相溶剂的选择对是否能采用盐做诱导剂并诱导成功至关重要，实验中的乙腈、丙酮和正丙醇三种溶剂均可以和水混溶，且应用广泛，但萃取率有显著差异，由图1可以看出采用乙腈水溶液对4种黄连生物碱的萃取效果最佳。设置6组平行对比实验组，对黄连生物碱标准溶液进行萃取。具体地，萃取方法与实施例1的步骤s1和步骤s2相同，不同之处在于，6组平行对比实验组分别采用kcl、(nh4)2co3、nh4hco3、(nh4)2so4、ch3coonh4和nacl的饱和溶液为诱导剂。请参阅图5，为采用不同诱导剂的萃取率的柱状图。不同的诱导剂诱导含有黄连生物碱的乙腈水混合溶液分相后，由于溶液中的氢键作用和静电作用不同，导致溶液极性不同，因而对生物碱的萃取效果不同。由图2可观察到当硫酸铵作诱导剂时，黄连生物碱萃取率最大。设置5组平行对比实验组，对黄连生物碱标准溶液进行萃取。具体地，萃取方法与实施例1的步骤s1和步骤s3相同，不同之处在于，各对比实验组中采用的乙腈和水的体积比分布为2:8；4:6；5:5；6:4；8:2。请参阅图6，为采用不同体积比的乙腈和水制成的乙腈水混合溶液的萃取率的折线图。由图5可看出，乙腈和水体积比为2：8时，分相后有机相体积太小以至于很难从混合液中分离出来。随着体积比的增大，黄连生物碱的萃取率不断增大，在乙腈水体积比为6:4黄连生物碱的萃取率达到最大。考虑到分相后，需要取乙腈相，如果乙腈相体积占比太大，将导致水相不易分离出来，因此优选地，乙腈和水体积比为6:4。设置4组平行对比实验组，对黄连生物碱标准溶液进行萃取。具体地，萃取方法与实施例1的步骤s1和步骤s2相同，不同之处在于，各对比实验组中采用硫酸铵的质量分别为0.5g、1.0g、1.5g和2.0g。请参阅图7，为采用不同质量的硫酸铵的萃取率的折线图。由于加盐后溶液中的离子强度增大，有利于待萃取物从水溶液向有机试剂中的转移。由图5的结果显示，黄连生物碱的萃取率随着硫酸铵质量的增大而不断增大，硫酸铵质量为2.0g，黄连生物碱几乎完全被萃取到乙腈相，考虑到在萃取率相差不大的情况下，节约硫酸铵的用量，减小硫酸铵的浪费，优选硫酸铵的质量为1.0g。设置4组平行对比实验组，对黄连生物碱标准溶液进行萃取。具体地，萃取方法与实施例1的步骤s1和步骤s3相同，不同之处在于，各对比实验组中在步骤s2中涡旋震荡的萃取时间分别为0.5min，1.0min，1.5min和2.0min。请参阅图8，为采用不同萃取时间的萃取率的折线图。结果显示涡旋震荡时间对黄连生物碱萃取率的影响不大，因此为加快萃取效率，优选涡旋震荡时间为1.0min。以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的
技术领域：
均包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12