本发明关于香蕉皮萃取物的应用，包括使用该萃取物于治疗、预防或调节与tph1基因、ddc基因及/或aanat基因相关的疾病或生理机能，尤其是使用该萃取物于提升褪黑激素(melatonin)表现，从而治疗失眠及/或改善睡眠困扰。
背景技术：
褪黑激素是由大脑松果体所分泌的荷尔蒙，具有调节生理时钟的功能。在日间，褪黑激素的分泌会受到光照的抑制，故人体能够保持清醒。在夜间，褪黑激素的分泌量则会上升，使人体可以进入睡眠状态。长期的夜班、轮班、精神紧张或使用电子产品的生活状态，会导致夜间的褪黑激素分泌量不足，使睡眠品质下降，甚至造成失眠等睡眠困扰的状况、以及日间疲惫感、日夜颠倒、免疫力下降等问题，对日常生活产生严重影响。
目前临床上常用于治疗睡眠困扰的药物有镇静安眠药物(例如：苯二氮平类药物(benzodiazepine)及巴比妥类药物(barbiturate))、及抗忧郁药物(例如：可洛米普明(clomipramine)及伊米帕明(imipramine))，但前述药物的使用极易产生成瘾性，且可能出现例如嗜睡、恶心、头痛、呕吐、胃肠不适、记忆力障碍、反弹性失眠(reboundinsomnia)、精神恍惚、运动失调、呼吸抑制、及╱或梦游等副作用。目前市面上也有贩售取自牛只松果体或化学合成的褪黑激素，但这些商品因狂牛症盛行、及安全剂量不确定性等问题，在许多国家仍属于须严格管控的药品、甚至属于禁药。因此，持续开发可有效治疗失眠及/或改善睡眠困扰、且不易产生成瘾性及副作用的药物或方法乃有其必需性及迫切性。
研究已知，褪黑激素的表现受到tph1、ddc及aanat等基因的调节。其中，tph1基因、ddc基因及aanat基因的表现量提升有助于提升褪黑激素表现、促进褪黑激素分泌。因此，若能提升tph1基因、ddc基因及/或aanat基因的表现，即可有效治疗失眠及/或改善睡眠困扰。本申请发明人研究发现，香蕉皮萃取物具有提升tph1、ddc及aanat等基因的表现的效果，故可用于治疗失眠及/或改善睡眠困扰，且可用于治疗、预防或调节与前述基因相关的疾病或生理机能。
技术实现要素：
本发明的一目的，在于提供一种提升tph1基因表现、提升ddc基因表现、及/或提升aanat基因表现的方法，其包含对一有需要的个体投予一组合物，其中该组合物含有有效量的香蕉皮萃取物。该方法用于提升褪黑激素表现、促进褪黑激素分泌、治疗失眠、治疗神经代谢紊乱相关疾病、预防神经代谢紊乱相关疾病、改善睡眠困扰、调节食欲、调节睡眠、调节情绪、调节血管收缩、调节止血功能、及调节免疫反应的至少一者。较佳地，该方法用于治疗失眠及/或改善睡眠困扰。
本发明的另一目的，在于提供一种使用香蕉皮萃取物于制造一组合物的用途，其中该组合物用于以下的至少一者：提升tph1基因表现、提升ddc基因表现、及提升aanat基因表现。其中，该组合物为一医药组合物或食品组合物。较佳地，该组合物用于提升褪黑激素表现及/或促进褪黑激素分泌。
本发明的又一目的，在于提供一种提升tph1基因表现、提升ddc基因表现、及/或提升aanat基因表现的组合物，其中，该组合物为一医药组合物或食品组合物且包含一有效量的香蕉皮萃取物。较佳地，该组合物用于提升褪黑激素表现及/或促进褪黑激素分泌。
上述根据本发明所提供的医药组合物，可用于以下的至少一者：治疗失眠、治疗神经代谢紊乱相关疾病、及预防神经代谢紊乱相关疾病。较佳地，该医药组合物用于治疗失眠。该医药组合物呈一选自以下群组的剂型：口服及经皮投予。
上述根据本发明所提供的食品组合物，用于以下的至少一者：改善睡眠困扰、调节食欲、调节睡眠、调节情绪、调节血管收缩、调节止血功能、及调节免疫反应。较佳地，该食品组合物用于改善睡眠困扰。该食品组合物为一健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充食品或特殊营养食品，较佳为一乳制品、肉类加工品、面包类、面食品、饼干、口含锭、胶囊、果汁类、茶类、运动饮料、或营养饮料。
本发明的详细技术内容及部分具体实施例，将描述于以下内容中，以供本领域技术人员据以明了本发明的特征。
附图说明
图1所示为相较于控制组，萃取物组的人类神经母细胞瘤细胞tph1基因、ddc基因及aanat基因的表现量，其中，“控制组”于不含香蕉皮萃取物的培养液中培养6小时，“萃取物组”则于含有香蕉皮萃取物的培养液中培养6小时；
图2所示为于第0天(即，饮用香蕉皮萃取物前)及第7天(即，连续7天饮用香蕉皮萃取物后)时，第i至iii组受试者的睡眠困扰分数，其中第i组为“有明显睡眠困扰者”，第ii组为“潜在睡眠困扰者”，第iii组为“无睡眠困扰者”)；
图3所示为相较于第0天，于第7天时，上述第i至iii组受试者唾液中的褪黑激素含量；以及
图4所示为相较于第0天，于第7天时，上述第i至iii组受试者的周边血单核球细胞中的tph1基因及aanat基因的表现量。
具体实施方式
以下将描述根据本发明的部分具体实施例；但在不背离本发明精神下，本发明还可以多种不同形式的实施例来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所具体陈述的或权利要求书所限定的。
除非文中有另外说明，于本说明书中(尤其是在权利要求书中)所使用的“一”、“该”及类似用语应理解为包含单数及复数形式；所谓的“治疗”，不应被解释为治疗一个体直至完全恢复，而应包括将一个体的疾病进展或症状维持在一实质上静态的程度、增加一个体的恢复速率、改善一具体病况的严重性、或提高一患者的生命品质；所谓的“预防”是指抑制或防止一具体病况的发作、或维持敏感个体的良好健康状态或建立该个体对疾病的耐受性；所谓的“调节”是指正向调控(包括诱导、刺激、及增强)或负向调控(包括抑制、及减弱)以使个体朝向所述生理机能的正常状态；所谓的“个体”是指哺乳动物，该哺乳动物可以为人类或非人动物。
香蕉，为多年生草本植物，其原产地为亚洲的热带、亚热带，在中国台湾则主要生长于高雄、台南、屏东及台东等地区。一般而言，香蕉的食用部位为果肉，香蕉皮则大多直接丢弃。因此，若可对香蕉皮加以应用，将可提升香蕉的经济价值。
已知tph1基因主要参与在血清素的合成中，而血清素与食欲、睡眠、情绪、血管收缩、止血功能及免疫反应等生理机能相关。故tph1基因表现低下会影响前述与血清素相关的生理机能，此可参见例如：peterzill等人发表于2007的文献，analysisoftryptophanhydroxylaseiandiimrnaexpressioninthehumanbrain:apost-mortemstudy，该文献的全文并于此处以供参考。因此，若可提升tph1基因的表现，则可调节前述与血清素相关的生理机能。
已知ddc基因参与在褪黑激素的合成中，此基因缺失也会造成神经代谢紊乱，此可参见例如：riccardomontioli等人发表于2014年的文献，acomprehensivepictureofthemutationsassociatedwitharomaticaminoaciddecarboxylasedeficiency:frommolecularmechanismstotherapyimplications，该文献的全文并于此处以供参考。因此，若可提升ddc基因的表现，则可治疗神经代谢紊乱疾病、预防神经代谢紊乱疾病及/或调节与褪黑激素合成相关的生理机能。
已知aanat基因在褪黑激素的合成中扮演重要角色，此可参见例如：jimoborjigin等人发表于1995年的文献，diurnalvariationinmrnaencodingserotoninn-acetyltransferaseinpinealgland.，该文献的全文并于此处以供参考。因此，若可提升aanat基因的表现，则可调节与褪黑激素合成相关的生理机能。
本申请发明人研究发现，香蕉皮萃取物具有调控tph1、ddc及aanat等基因表现的效果。因此，本发明涉及使用香蕉皮萃取物以提升tph1基因表现、提升ddc基因表现、及/或提升aanat基因表现的应用，此包括：提供一包含香蕉皮萃取物的组合物、使用香蕉皮萃取物于制备一组合物的用途、以及对一有需要的个体投予一含有有效量香蕉皮萃取物的组合物的方法，其中该组合物可提升tph1基因表现、提升ddc基因表现、及/或提升aanat基因表现。
根据本发明所采用的香蕉皮萃取物，可通过包含如下步骤的操作而提供：(a)以一萃取溶剂萃取香蕉皮，以提供一粗萃液；(b)对该粗萃液进行离心处理，取上清液进行过滤，以提供一滤液；(c)对该滤液进行减压浓缩，获得一浓缩萃取液；以及(d)对该浓缩萃取液进行干燥，获得一干燥物。
于步骤(a)中，该萃取溶剂为一极性溶剂且可视需要含有一酸，其中，该极性溶剂可以为水、醇(例如c1-c4醇)、或其组合，该酸可以为醋酸、柠檬酸、盐酸、或其组合。可通过将一酸与一极性溶剂以酸：极性溶剂＝0.1-5：100的体积比例混合，以提供该萃取溶剂。举例言之，可以柠檬酸：水＝0.5-1：100的体积比用量以提供萃取溶剂。此外，萃取溶剂的用量并无特殊限制，只要可以使原料均匀分散即可。举例言之，可于步骤(a)采用萃取溶剂：香蕉皮＝1-20：1的体积比用量。于本发明一具体实施例中，以柠檬酸：水＝1：100的体积比用量以提供萃取溶剂，并以萃取溶剂：香蕉皮＝6：1的体积比用量进行步骤(a)的萃取。
于步骤(a)中，可视所采用的萃取溶剂来选用合宜的萃取时间。以采用柠檬酸：水＝1：100作为萃取溶剂，且萃取溶剂：香蕉皮的体积比为约6：1为例，通常萃取历时至少0.5小时，较佳至少1.5小时，更佳至少2小时。此外，可视需要于进行步骤(a)之前或之时，辅以例如加温、冷却、搅拌、超音波等其它操作，以提高萃取效果。举例言之，于本发明一具体实施例中，于进行步骤(a)之前进行搅拌操作，并于85℃下进行步骤(a)，历时0.5小时。
于步骤(c)中，可视需要调整减压浓缩时的温度。举例言之，可于45至70℃进行步骤(c)的减压浓缩。于本发明一具体实施例中，于55±5℃进行步骤(c)的减压浓缩。根据本发明所采用的香蕉皮萃取物，可以是步骤(c)所提供的浓缩萃取液，也可以是步骤(d)所提供的干燥物，其中，步骤(d)可通过冷冻干燥、喷雾干燥等方式进行。为尽可能达到最大的萃取效益，视需要地，可于进行步骤(b)之前，以相同或不同的萃取溶剂对香蕉皮进行重复萃取，并合并该多次萃取所得的萃取液以提供进行步骤(b)的粗萃物；也可重复进行步骤(b)、步骤(c)、以及前述视需要的其它操作的循环。
根据本发明所提供的组合物为一医药组合物或一食品组合物。其中，根据本发明所提供的医药组合物可用于以下的至少一者：治疗失眠、治疗神经代谢紊乱相关疾病、及预防神经代谢紊乱疾病；较佳地，用于治疗失眠。根据本发明所提供的食品组合物用于以下的至少一者：改善睡眠困扰、调节食欲、调节睡眠、调节情绪、调节血管收缩、调节止血功能、及调节免疫反应；较佳地，用于改善睡眠困扰。
根据本发明所提供的医药组合物可呈任何合宜的形式，并无特殊限制，视所欲的用途而呈对应的合宜剂型。举例言之，但不以此为限，该医药组合物可以口服或非经口服(例如：经皮)的投药方式施用至有需要的个体上。其中，视使用形式及用途而定，可选用合宜的载剂以提供该医药组合物，其中，该载剂包括赋形剂、稀释剂、辅助剂、安定剂、吸收延迟剂、崩散剂、增溶剂、乳化剂、抗氧化剂、粘合剂、结合剂、增粘剂、分散剂、悬浮化剂、润滑剂、吸湿剂等。
以适于口服的剂型为例，于根据本发明所提供的医药组合物中可含有任何不会不利影响活性成分(即，香蕉皮萃取物)的所欲效益的医药上可接受的载剂，例如：水、食盐水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其类似物、纤维素、淀粉、糖膨润土(sugarbentonite)、及前述的组合。可利用任何合宜的方法，将该医药组合物以适于口服投药的剂型提供，例如：锭剂(例如糖衣锭)、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、流浸膏剂、溶液剂、糖浆剂、悬液剂、酊剂等。
以适于经皮投予的剂型为例，根据本发明所提供的医药组合物可呈供直接外用的贴布、乳液、乳霜、凝胶(例如水凝胶)、膏状物(例如分散膏、软膏)、喷雾剂、或溶液(例如悬浮液)等形式，但不以此为限。
根据本发明所提供的医药组合物可以一日一次、一日多次、或数日一次等不同投药频率施用，视投予个体的需求、年龄、体重、及健康况状而异。于根据本发明所提供的医药组合物中，可视实际应用需求，调整香蕉皮萃取物于组合物中的含量比例。此外，该医药组合物可视需要另含一或多种其他活性成分(例如安眠药物、抗忧郁药物、及褪黑激素等)，或者与含该一或多种其他活性成分的药物并用，以进一步加强该医药组合物的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度，只要该其他活性成分对本发明活性成分(即，香蕉皮萃取物)的效益没有不利的影响即可。
视需要地，可于根据本发明所提供的医药组合物或食品组合物中另含有合宜用量的添加剂，例如可提高该医药组合物或食品组合物于服用时的口适感及视觉感受的调味剂、调色剂、着色剂等，以及可改善该医药组合物或食品组合物的稳定性及储存性的缓冲剂、保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等。
根据本发明所提供的食品组合物可以是健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充食品或特殊营养食品，且可制成例如乳制品、肉类加工品、面包类、面食品、饼干、口含锭、胶囊、果汁类、茶类、运动饮料、营养饮料等产品，但不以此为限。较佳地，根据本发明所提供的食品组合物以健康食品的形式提供。
根据本发明所提供的健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充食品及特殊营养食品可以一日一次、一日多次、或数日一次等不同频率食用，视投予个体的年龄、体重、及健康状况而异。也可针对特定族群的需要，调整根据本发明所提供的健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充食品及特殊营养食品中香蕉皮萃取物的含量，例如，调整至每日应服用的量。
针对根据本发明所提供的健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充食品及/或特殊营养食品，可于其外包装上标示建议使用量、特定族群(例如失眠症患者、忧郁症患者、孕妇等)的使用标准及条件、或与其他食品或医药共同服用的建议事项等，以利使用者在无医师、药师或相关执事人员指导下自行服用而无安全疑虑。于根据本发明所提供的食品组合物中，有关该香蕉皮萃取物的实施例以及相关的应用，均如上述的说明。
本发明也提供一种用于提升tph1基因表现、提升ddc基因表现、及/或提升aanat基因表现的方法，其包含对一有需要的个体投予一组合物，其中该组合物含有有效量的香蕉皮萃取物。有关该组合物的投予形态、投予途径、投予形式、施用频率、以及相关的应用，均如上述的说明。
现以下列实施例进一步例示说明本发明。其中这些实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的保护范围。本发明保护范围以权利要求书所界定为准。
实施例
于以下实施例中，所使用的物料来源如下：
1.香蕉：产地中国台湾。
2.人类神经母细胞瘤细胞(humanneuroblastomacell；sh-sy5y)：购自atcc，产品编号crl-2266。
3.dmem培养基：购自gibco，产品编号12100-038。
4.胎牛血清：购自gibco，产品编号10438-062。
5.青霉素/链霉素：购自gibco，产品编号15140-122。
6.rna萃取套组(rnaextractionkit)：购自geneaid。
7.反转录酶(
8.kapasybrfastqpcr套组：购自kapabiosystems公司。
9.steponeplus仪器：购自abi公司。
10.褪黑激素检测试剂(melatonindirectsalivaelisa,96t)：购自ibl公司，产品编号re54041。
11.ficoll-paqueplus分离液：购自gehealthcare公司。
实施例1：香蕉皮萃取物的制备
将香蕉的果皮与果肉分离，并对香蕉皮进行以下操作处理，以提供香蕉皮萃取物：
1.将香蕉皮与萃取溶剂混合(香蕉皮与萃取溶剂的体积比为1：6；其中该萃取溶剂以柠檬酸：水＝1：100的体积比用量提供)，并于85℃下进行萃取，历时0.5小时，以提供一粗萃液；
2.取步骤1的粗萃取物，以5000rpm.的转速对其进行离心，历时10分钟，取上清液后，以400网目的滤网进行过滤，以提供一滤液；
3.于55±5℃下，对步骤2的滤液进行减压浓缩，以提供一浓缩萃取液；
4.对步骤3的浓缩萃取液进行冷冻干燥，以提供一干燥物(即，以下实施例所使用的香蕉皮萃取物)。
实施例2：细胞实验
将人类神经母细胞瘤细胞接种于6-孔盘(每孔2x105个细胞)中，培养24小时后，将细胞分为控制组及萃取物组(各组皆三重复)，并分别以如下培养基进行培养，历时6小时：
1.控制组：含有10％的胎牛血清、及1％青霉素/链霉素的dmem培养基；
2.萃取物组：如控制组的培养基，但另添加15.625微克/毫升由实施例1获得的香蕉皮萃取物。
其后，分别收集上述各组细胞，以rna萃取套组进行rna萃取，再以反转录酶将该rna反转录为cdna。接着，使用abisteponeplus仪器及kapasybrfastqpcr套组对前述的cdna进行qpcr(quantitativepolymerasechainreaction)，以检测各组细胞的褪黑激素相关基因(包括tph1、ddc及aanat)的表现量。以控制组的结果为基准(即，将控制组的基因表现量设定为1倍)，计算萃取物组的基因相对表现量。结果示于图1。
由图1可知，相较于控制组，萃取物组的tph1、ddc及aanat基因表现量皆显著增加，其中aanat基因表现量甚至高达3.33倍。前述结果显示，本发明香蕉皮萃取物确实可以提升tph1、ddc及aanat基因表现量，故可有效提升褪黑激素表现及促进褪黑激素分泌，从而达到治疗失眠及改善睡眠困扰的效果。
实施例3：人体实验
(3-1)样本搜集
招集自愿受试者(排除服用安眠药者、服用降血糖药物者、及孕妇)，将受试者分为“有明显睡眠困扰者(下称“第i组”)”、“潜在睡眠困扰者下称“第ii组”)”、及“无睡眠困扰者(下称“第iii组”)”三组(每组一人)后，对受试者的睡眠状态进行评估。于实验开始前，先请各受试者填写睡眠问卷(即，第0天睡眠问卷，问卷内容如下表1所示)，并搜集各受试者的唾液及血液(即，第0天唾液及血液)，供后续实验使用。接着，请受试者于每天晚餐后饮用含有200毫克由实施例1获得的香蕉皮萃取物的饮品，共7天(即，各受试者饮用该饮品7次)。其后，再次请各受试者填写睡眠问卷(即，第7天睡眠问卷，问卷内容同第0天睡眠问卷)，并搜集各受试者的唾液及血液(即，第7天唾液及血液)，供后续实验使用。
表1：
(3-2)睡眠困扰分数评估
分析3-1的第0天睡眠问卷及第7天睡眠问卷，计算各组受试者的睡眠困扰分数，并以8分作为睡眠困扰基准(即，超过8分代表有睡眠困扰)。结果示于图2。
由图2可知，相较于第0天，于第7天时，“第i组”及“第ii组”的睡眠困扰分数皆明显下降，而“第iii组”的睡眠困扰分数则没有显著变化。前述结果显示，本发明香蕉皮萃取物确实可以有效降低“有明显睡眠困扰者”及“潜在睡眠困扰者”的睡眠困扰现象，且不会对“无睡眠困扰者”产生不利影响。
(3-3)褪黑激素评估
取3-1所提供的各组受试者的第0天及第7天唾液，以褪黑激素检测试剂进行检测，测量唾液中的褪黑激素含量(由褪黑激素的表现量及分泌量所共同影响)。以第0天的结果为基准(即，将第0天的褪黑激素含量设定为1倍)，计算第7天的褪黑激素相对含量。结果示于图3。
由图3可知，相较于第0天，于第7天时，“第i组”、“第ii组”及“第iii组”唾液中的褪黑激素含量皆明显上升。前述结果显示，本发明香蕉皮萃取物确实可以有效提升褪黑激素表现量及促进褪黑激素分泌，从而可达到治疗失眠及改善睡眠困扰的效果。
(3-4)褪黑激素相关基因表现量评估
取3-1所提供的各组受试者的第0天及第7天血液，以ficoll-paqueplus分离液自其中分离出周边血单核球细胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)。接着，以实施例2的分析方式，检测各组受试者的周边血单核球细胞中褪黑激素相关基因(包括tph1及aanat)的表现量。以第0天的结果为基准(即，将第0天的基因表现量设定为1倍)，计算第7天的基因相对表现量。结果示于图4。
由图4可知，相较于第0天，于第7天时，“第i组”及“第ii组”的tph1及aanat基因表现量皆上升。此显示，本发明香蕉皮萃取物确实可以有效提升“有明显睡眠困扰者”及“潜在睡眠困扰者”的tph1及aanat基因表现量，且可有效提升褪黑激素表现及促进褪黑激素分泌，达到治疗失眠及改善睡眠困扰的效果。
上述结果显示，本发明香蕉皮萃取物确实可以提升tph1、ddc及aanat基因表现量，故可用于提升褪黑激素表现及促进褪黑激素分泌，也可用于治疗失眠、改善睡眠困扰、治疗神经代谢紊乱相关疾病、预防神经代谢紊乱相关疾病、调节食欲、调节睡眠、调节情绪、调节血管收缩、调节止血功能、及调节免疫反应的至少一者，尤其是用于治疗失眠及/或改善睡眠困扰。