本发明属于靶向纳米材料技术领域，特别涉及一种靶向修饰的二硫化钼纳米载药复合物及其制备方法。
背景技术：
恶性肿瘤严重威胁人类健康和生命，近年来肿瘤的发病率和死亡率不断增加，肿瘤治疗已经成为当前医学研究领域所面临的一个重大挑战。目前，肿瘤的治疗手段主要以手术切除、放射性治疗以及化学药物治疗为主，某些肿瘤也利用基因、生物治疗等方法作为辅助治疗。化疗药物作为一种全身治疗的手段，可以有效的对抗肿瘤细胞的侵袭和转移，因此化疗在肿瘤的综合治疗中占主导地位。但是传统的化疗药物依然存在一定的局限性，例如水溶性差、缓解期短、排泄缓慢、明显的毒副作用和交叉耐药等缺点。因此这类化学药物的治疗效果仍有待改进。
纳米技术的出现为抗肿瘤药物设计提供了新思路。纳米技术融合多学科交叉协作，在肿瘤成像、肿瘤诊断和肿瘤靶向治疗等方面展现出了广阔的应用前景。纳米载药系统由于其易于表面靶向修饰、循环和滞留时间长、易渗透进入细胞、可实现缓释和控制释放等优势，可以克服现有小分子药物制剂所存在的生物选择性差、利用率低、稳定性差、药物作用时间短、不良反应严重等缺陷。
二硫化钼纳米材料由于成本低，生物相容性好，光学吸收广，具有光热治疗，和负载药物的能力，因而拥有在生物医药中应用的巨大潜力。二硫化钼纳米片已被报道为癌症联合光热化疗多功能药物载体利用它们的近红外光吸收和薄层结构来高效加载基因和药物分子。目前基于二硫化钼的控释体系的研究对药物靶向输送和刺激响应控释相结合的研究中，加强靶向输送和刺激响应控释相结合，更好地将药物输送至靶向部位，实现刺激响应控释，提高治疗效果、减小毒副作用的相关研究逐步引起学者们广泛的关注。
通过修饰二硫化钼，达到增加载药复合物稳定性的作用。通过近红外光的照射，使得载药复合物通过内吞途径进入细胞后，因为光热效应引起的局部加热使内体膜不稳定，从而促进药物及其载体从核内体中逃逸。达到大多数抗癌药物应迅速释放到细胞溶质中的效果。从而大大提高药物的疗效。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种靶向修饰的二硫化钼纳米载药复合物及其制备方法，本发明的纳米载药复合物以聚乙烯亚胺连接叶酸-牛血清蛋白为靶向基团，以聚乙二醇修饰的二硫化钼，具有光和ph响应性。本发明的方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景；本发明得到的纳米颗粒具有较好的水分散性，及生物相容性，具有应用于肿瘤靶向及协同治疗的前景。
本发明的一种靶向修饰的二硫化钼纳米载药复合物，包括二硫化钼mos2纳米片、修饰单元硫辛酸修饰的聚乙二醇la-peg、靶向单元α-硫辛酸修饰的聚乙烯亚胺连接叶酸-牛血清蛋白fa-bsa-pei-la以及阿霉素dox。
所述mos2纳米片的厚度为1.6～3.0nm，bsa的分子量为66.43kda，pei的分子量为1.8kda。
本发明的一种靶向修饰的二硫化钼纳米载药复合物的制备方法，包括：
(1)将钼酸钠和硫代乙酰胺分散于水中超声，搅拌至溶解，然后反应，离心，得到二硫化钼mos2纳米片；其中钼酸钠和硫代乙酰胺的质量比为1:0.5～3；
(2)将α-la活化后加入至pei水溶液中，搅拌过夜，经透析、冷冻干燥，得到la-pei；加入到步骤(1)得到的mos2分散液中，超声，得到mos2-la-pei；其中pei和α-la的摩尔比为1:1～3，la-pei和mos2的质量比为25～40:2～3；
(3)将α-la溶解在二氯甲烷中，加入甲氧基聚乙二醇胺搅拌至溶液澄清，再加入二环己基碳二亚胺和三乙醇胺再次搅拌，旋蒸，过滤，冷冻干燥，得到la-peg；然后加入至步骤(2)得到的mos2-la-pei水溶液中超声，继续搅拌，得到pei-la-mos2-la-peg；其中α-la、甲氧基聚乙二醇胺、二环己基碳二亚胺、三乙醇胺的用量比为40～50mg:250～350mg:10～15mg:6～9μl，la-peg和mos2-la-pei的质量比为10～15:1～2；
(4)将步骤(3)得到的pei-la-mos2-la-peg与fa-bsa溶液混合，活化后，离心，透析，得到fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg；其中pei-la-mos2-la-peg和fa-bsa的质量比为6～3:1；
(5)将fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg分散在缓冲溶液中，加入dox，室温下避光搅拌，透析，冷冻干燥，得到靶向修饰的二硫化钼纳米载药复合物fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(dox)；其中fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg与dox的质量比为1～6:1～2。
所述步骤(1)中超声的时间为5～15min；反应的工艺参数为：反应温度为180～260℃，反应时间为22～26h。
所述步骤(2)中pei水溶液的ph为7.0～7.5。
所述步骤(2)中α-la活化的工艺条件为：将α-la溶解在乙腈中，加入edc和nhs，搅拌均匀，其中α-la、edc和nhs的质量比为80～85:180～200:100～115。
所述步骤(2)中透析的工艺条件为：采用mw＝1000的透析袋进行透析。
所述步骤(2)中超声的时间为20～90min。
所述步骤(3)中搅拌均为磁力搅拌，其中搅拌时间为22～26h，再次搅拌的时间为2～3h，继续搅拌时间为10～12h。
所述步骤(3)中旋蒸的时间为4～7min。
所述步骤(3)中过滤的工艺条件为：将旋蒸后的产物溶解在水中进行过滤并调节ph至8.0。
所述步骤(3)中超声的时间为25～30min。
所述步骤(4)中活化的工艺条件为：加入等摩尔比的edc和nhs，搅拌12～24h，其中pei-la-mos2-la-peg、edc和nhs的质量比为10～15:3:2。
所述步骤(4)中离心的转速为5000～6000rpm。
所述步骤(4)中透析的工艺条件为：采用mw＝8000～14000的透析袋进行透析。
所述步骤(5)中避光搅拌的时间为12～24h。
所述步骤(5)中的缓冲溶液为ph值为7-7.5的磷酸缓冲溶液或ph值为5-6的醋酸缓冲溶液。
有益效果
(1)本发明的fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(dox)载药复合材料药物装载量高，能够长效缓释，且具有ph及近红外光双响应输送能力，在较低ph值环境下释放率高，适合肿瘤组织的微环境；且在较低功率的激光照射下产生过高热，具有肿瘤长效缓释的潜力。
(2)本发明的方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景。
(3)本发明得到的纳米颗粒具有较好的水分散性，及生物相容性，具有应用于肿瘤靶向及协同治疗的前景。
(4)本发明的fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(dox)载药复合材料中的fa-bsa基团可以实现其对乳腺癌细胞的主动靶向作用。
附图说明
图1为实施例1中mos2纳米片的tem图，其中a，b为不同分辨率下的tem图。
图2a为实施例2中fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(a)、fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(dox)(b)、纯药dox(c)的紫外图谱。
图2b为实施例2中pei-la-mos2(a)与fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(b)红外图谱。
图3为实施例3中pei-la-mos2(a)和fa-bsa(b)的h1nmr图谱。
图4为实施例3中各部分产物(mos2纳米片、pei-la-mos2、fa-bsa、fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg)的zeta电位变化。
图5为实施例3中fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg的水动力学直径变化。
图6为实施例4中fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(dox)在不同ph环境下及有无激光照射条件下的药物释放曲线。
图7为实施例5中游离dox、载体、载体+dox、载体+nir、载体+dox+nir在不同浓度下对两种细胞(l929和mda)的mtt细胞毒性结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)将3g钼酸钠和6g硫代乙酰胺分散于300ml水中超声10min后，搅拌至溶解，然后220℃下反应24h，离心，收集黑色沉淀，得到mos2纳米片。
(2)将360mgpei溶解在20ml水中，调节ph至7.4，得到pei水溶液；将82.4mgα-la溶解在20ml乙腈中，加入191mgedc和115mgnhs，搅拌均匀，然后加入到上述pei水溶液中，搅拌过夜后放入透析袋(mw＝1000)透析、冷冻干燥，得到la-pei；将30mgla-pei加入到2.5mgmos2的10ml水溶液中，超声30min超声，得到mos2-la-pei。
(3)将45mgα-la溶解在2.4ml二氯甲烷中，加入300mg甲氧基聚乙二醇胺磁力搅拌24h至溶液澄清，再加入12mg二环己基碳二亚胺和7.2μl三乙醇胺再次磁力搅拌2h，旋蒸5min去除有机溶剂，溶解在10ml水中过滤，调节ph至8.0，冷冻干燥，得到la-peg；然后将1.5mgmos2-la-pei溶解在3ml水中并加入15mgla-peg，超声30min，继续磁力搅拌12h，得到pei-la-mos2-la-peg。
(4)将50mgpei-la-mos2-la-peg与20mlfa-bsa溶液混合，加入15mgedc和10mgnhs，搅拌12h，5000rpm离心，放入透析袋(mw＝8000～14000)透析，得到fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg。
(5)将10mgfa-bsa-pei-la-mos2-la-peg分散在缓冲溶液中，加入5mgdox，室温下避光搅拌20h，透析，冷冻干燥，得到靶向修饰的二硫化钼纳米载药复合物fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(dox)。
对本实施例制得的mos2纳米片进行形貌表征，tem结果如图1所示，可以看出单层mos2纳米片的厚度在1.8～2.5nm之间。
实施例2
(1)将6g钼酸钠和12g硫代乙酰胺分散于500ml水中超声12min后，搅拌至溶解，然后220℃下反应26h，离心，收集黑色沉淀，得到mos2纳米片。
(2)将300mgpei溶解在20ml水中，调节ph至7.2，得到pei水溶液；将80mgα-la溶解在18ml乙腈中，加入200mgedc和100mgnhs，搅拌均匀，然后加入到上述pei水溶液中，搅拌过夜后放入透析袋(mw＝1000)透析、冷冻干燥，得到la-pei；将40mgla-pei加入到3mgmos2的15ml水溶液中，超声20min超声，得到mos2-la-pei。
(3)将40mgα-la溶解在3ml二氯甲烷中，加入250mg甲氧基聚乙二醇胺磁力搅拌24h至溶液澄清，再加入10mg二环己基碳二亚胺和6μl三乙醇胺再次磁力搅拌2h，旋蒸4min去除有机溶剂，溶解在12ml水中过滤，调节ph至8.0，冷冻干燥，得到la-peg；然后将2mgmos2-la-pei溶解在4ml水中并加入15mgla-peg，超声30min，继续磁力搅拌12h，得到pei-la-mos2-la-peg。
(4)将30mgpei-la-mos2-la-peg与15mlfa-bsa溶液混合，加入9mgedc和6mgnhs，搅拌24h，5000rpm离心，放入透析袋(mw＝8000～14000)透析，得到fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg。
(5)将10mgfa-bsa-pei-la-mos2-la-peg分散在缓冲溶液中，加入20mgdox，室温下避光搅拌12h，透析，冷冻干燥，得到靶向修饰的二硫化钼纳米载药复合物fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(dox)。
对本实施例制得的产物进行结构确证，其中fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg载药前后的紫外图谱如图2a所示，可见载药复合物的紫外图谱出现了dox的特征峰，可以证明药物负载到产物载体上。
pei-la-mos2(a)与fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg载体(b)红外图谱如图2b所示，从图(a)中可以看到，3436cm-1处有特征峰，这是说明具有pei。1638cm-1处有特征峰，这是有酰胺键，说明la与pei通过酰胺键成功连接；图(b)中1461cm-1处的特征峰说明了bsa的存在，而1193cm-1，1115cm-1，1049cm-1处的特征峰则是说明了有peg和fa的存在，可以证明bsa-fa已成功地结合到了pei-la-mos2上。
pei-la-mos2(a)和fa-bsa(b)的h1nmr图谱如图3所示，从图(a)中可以看到在δ＝7.71-7.88ppm处出现了硫辛酸环上的ch2的峰，在δ＝2.99-3.25ppm处出现了pei上的nh2和nh的峰，在δ＝2.37-2.59ppm处出现了硫辛酸羰基的峰，在δ＝2.72ppm处出现了硫辛酸链上ch2的峰，这些结果表明pei-la的成功合成；从图(b)中可以看到在δ＝3.78ppm处出现了bsa上氨基酸的峰，在δ＝3.18ppm处出现了叶酸的烷基的峰，在δ＝3.00ppm处出现了叶酸的氨基的峰，这些结果均表明fa-bsa的成功合成。
综上所述可以证明各级产物成功的合成。
实施例3
(1)将5g钼酸钠和8g硫代乙酰胺分散于400ml水中超声8min后，搅拌至溶解，然后220℃下反应22h，离心，收集黑色沉淀，得到mos2纳米片。
(2)将400mgpei溶解在25ml水中，调节ph至7.4，得到pei水溶液；将85mgα-la溶解在25ml乙腈中，加入180mgedc和105mgnhs，搅拌均匀，然后加入到上述pei水溶液中，搅拌过夜后放入透析袋(mw＝1000)透析、冷冻干燥，得到la-pei；将25mgla-pei加入到2mgmos2的10ml水溶液中，超声25min超声，得到mos2-la-pei。
(3)将50mgα-la溶解在2.8ml二氯甲烷中，加入350mg甲氧基聚乙二醇胺磁力搅拌20h至溶液澄清，再加入15mg二环己基碳二亚胺和9μl三乙醇胺再次磁力搅拌2.5h，旋蒸7min去除有机溶剂，溶解在18ml水中过滤，调节ph至8.0，冷冻干燥，得到la-peg；然后将1mgmos2-la-pei溶解在2ml水中并加入10mgla-peg，超声25min，继续磁力搅拌10h，得到pei-la-mos2-la-peg。
(4)将80mgpei-la-mos2-la-peg与30mlfa-bsa溶液混合，加入21mgedc和14mgnhs，搅拌14h，6000rpm离心，放入透析袋(mw＝8000～14000)透析，得到fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg。
(5)将2mgfa-bsa-pei-la-mos2-la-peg分散在缓冲溶液中，加入4mgdox，室温下避光搅拌15h，透析，冷冻干燥，得到靶向修饰的二硫化钼纳米载药复合物fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(dox)。
对本实施例合成的产物进行理化性能测试，合成各部分产物的zeta电势变化如图4所示，可知带负电的mos2经过修饰成为pei-la-mos2后变为带正电，再接枝带负点的fa-bsa后，依旧带正电，可以辅助说明合成的成功。fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg的水动力学直径变化如图5所示，说明其粒径大小合适于靶向癌症治疗载药载体。通过zeta电位和dls的检测可以证明fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg载药材料已成功合成。
实施例4
对实施例1制得的fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(dox)载药复合材料进行药物释放实验：
(1)配制dox磷酸缓冲溶液及醋酸缓冲溶液，于紫外分光光度计中检测最大吸收值，并拟合两种ph环境下(5.8和7.4)的dox标准曲线，其中dox标准曲线dox浓度为0.005～0.08mg/ml。
(2)将5mgfa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(dox)载药复合材料溶于5ml缓冲溶液中，置于两个透析袋中，然后分别将透析袋置于体积为10～15ml的ph5.8醋酸缓冲溶液和ph7.4的磷酸缓冲溶液中振荡48h，于不同时间点取样，补充新鲜缓冲液，得到ph响应药物释放曲线。
(3)将5mgfa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(dox)载药复合材料分别溶于5ml不同ph缓冲溶液(5.8和7.4)中，置于透析袋中，然后分别用808nm，1w/cm2的激光照射5min，随后置于摇床中振荡48h，与不同的时间点取样检测，并补充缓冲液，得到光热响应药物释放曲线。
(4)dox在两种ph环境下及有无激光照射条件下的释放曲线如图6所示，可见不同ph下释放存在显著差异，且光热可显著提高药物的释放，肿瘤组织较正常组织细胞相比其ph要低，该载药材料的释放正好符合这一特性，表明该载药复合材料是一种可以用于肿瘤治疗的ph/光多重刺激响应型药物载体。
实施例5
对实施例1制得的fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg负载不同浓度dox的载药体系进行细胞毒性试验：
在96孔细胞培养板中种入mda和l929细胞，每孔细胞密度大约为10,000个，并补足每孔200μl的培养液，在5％co2，的条件下于培养箱中培养24h。第二天倒掉旧培养基，加入含有不同浓度的dox、fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg和fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(dox)的20μl的pbs溶液，并补足180μl新鲜培养基，使每孔总体积仍为200μl，孵育24h后，每孔加20μl的0.5％的mtt溶液，置37℃恒温箱中静止4h，吸去孔内培养液，并添加200μldmso，置摇床上避光低速振荡15-20min，使用酶联免疫检测仪570nm处各孔的紫外吸收值。
游离dox、载体、载体+dox、载体+nir、载体+dox+nir在不同浓度下对两种细胞的mtt细胞毒性结果如图7所示，可知dox浓度在1-10μg/ml的情况下均对mda和l929细胞产生了较大的毒性。进一步验证复合载药材料对细胞的杀伤作用仅与其中的dox有关，同时对药物载体进行了mtt检测，与载药复合物中dox浓度相同的载体材料均不产生细胞毒性，也验证了载药复合物对细胞的杀伤仅与其中的dox有关。
实施例6
对实施例1制得的fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(dox)载药体系进行靶向性验证试验：
在24孔细胞培养板中放入盖玻片，并种入mda细胞，每孔细胞密度大约为30,000个，并补足每孔1ml的培养液，在5％co2，的条件下于培养箱中培养24h。第二天倒掉旧培养基，加入含5μg/mldox的fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(dox)的100μl的pbs溶液，并补足900μl新鲜培养基，孵育2h。吸去含材料的培养液，并用pbs冲洗，加1ml2.5％的戊二醛固定15min。吸去戊二醛，并用pbs冲洗，加1mlhoescht33342染色15min。吸去hoescht33342，并用pbs冲洗，将盖玻片取出，滴一滴荧光封闭剂，置于载玻片上，进行激光共聚焦显微镜检测。为了对材料靶向性进行检测，选取非靶向细胞l929，操作过程与mda相同。
游离dox、pei-la-mos2-la-peg(dox)、fa-bsa-pei-la-mos2-la-peg(dox)载药复合物对mda及l929细胞的激光共聚焦显微镜结果表明：游离dox对细胞的杀伤性大于无靶向基团的载药复合物，有靶向基团的载药复合物对细胞的杀伤性大于游离dox且dox在细胞核周围的荧光强度远大于其余二者，并可以发现，经过材料孵化后的mda细胞的dox荧光强度比l929细胞高，说明材料对乳腺癌细胞有一定的靶向性。