本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及乳腺丝抑蛋白的新用途。
背景技术：
乳腺丝抑蛋白(mammaryserineproteaseinhibitor,maspin)
人类maspin由serpinb5基因编码。该基因位于18q21.3，表达产物具有375个氨基酸。maspin与serpin超家族的ser蛋白激酶抑制物有重要同源性，与卵清蛋白也有31％的同源性。maspin在前列腺、乳腺等上皮细胞中广泛表达，是上皮细胞的看家基因和标志物分子。但它在恶性肿瘤细胞及浸润性肿瘤中表达降低，转移灶中不表达。maspin广泛分布在细胞内、外基质中，与不同的分子结合而发挥相对应的生物学活性[8]。我们的研究显示：maspin是目前唯一被发现的内在的组蛋白去乙酰化酶hdac1的抑制因子，并参与肿瘤的抑制和诱导肿瘤细胞的再分化；同时它可结合热休克蛋白hsp90和谷胱甘肽s转移酶，发挥各种不同的生物学功能。其在细胞内的胞质和细胞核中的表达具有不同的临床意义。作为肿瘤抑制因子，maspin的抗肿瘤活性已被广泛证实。根据肿瘤种类的不同或同一肿瘤的不同发展阶段，其表现也不尽相同。主要表现有抑制肿瘤细胞生长、浸润和转移，增强药物诱导的肿瘤细胞凋亡，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性；帮助体细胞抵抗缺氧诱导的应急反应所引起的损伤以维护机体自稳和平衡；等。一般认为肿瘤细胞表达胞核maspin较之在细胞质中表达具有较好的预后判断作用。但maspin抗肿瘤活性的具体机制不明确。
雄激素受体(androgenreceptor,ar)：表达及活性与前列腺肿瘤的发展雄激素受体是由位于xq11.2-12的ar基因编码，表达约918氨基酸(910aa—920aa)大核受体蛋白，分子量约为98.5kd，属于一种配体(如体内主要为睾酮testosterone,双氢睾酮dihydrotestosterone，dht)结合诱导型转录因子。ar经结合配体后从细胞质转移到胞核发挥转录因子作用，调控目标基因(如psa，nkx3.1)表达。ar表达于前列腺上皮和基质细胞，其信号通路广泛参与调节正常和肿瘤细胞的生长和分化。研究发现，ar基因的异常表达与激活仍然是前列腺肿瘤发生与发展的主要原因。因此内分泌疗法包括去势治疗(如androgendeprivationtherapy，adt)和抑制a/ar信号通路活性(雄激素拮抗剂，雄激素受体拮抗剂)仍然是治疗肿瘤复发和转移的系统性方法。研究显示，正常的ar的表达与转录活性受表观遗传调节，特别是组蛋白乙酰化修饰作用的调节。同样的乙酰化组蛋白在抑制依赖ar的肿瘤生长和预防肿瘤进一步恶化中起重要作用。值得关注的是：化疗药物docetaxel(多西他赛)处理的22rv1cap细胞也表现出了抑制ar的活性。
专利申请号为200410068196，雄激素依赖/非依赖性前列腺癌中高表达的人蛋白在前列腺肿瘤诊断、治疗预后中的新用途，该发明公开了十六种在雄激素非依赖性前列腺肿瘤组织中高表达的人蛋白及其编码序列在雄激素依赖性前列腺肿瘤组织预后、监测,诊断、治疗雄激素非依赖性前列腺肿瘤组织方面的新用途。该发明还公开了七种在雄激素依赖性前列腺肿瘤组织中高表达的人蛋白及其编码序列在雄激素依赖性前列腺肿瘤组织预后、监测,诊断、治疗雄激素非依赖性前列腺肿瘤组织方面的新用途，但是该发明并没有公开maspin应用于调控ar表达，也没有将maspin蛋白应用于前列腺肿瘤及相关疾病的预防或者治疗中。
贺美兰、张建业等在山东大学学报(医学版)发表的“雄激素及其受体对maspin启动子的抑制作用”的研究，通过分别构建表达maspin启动子和表达人ar(har)的载体，然后共同转染pc-3m细胞，利用荧光素酶报告基因方法发现har抑制maspin表达，得出结论为maspin基因启动子区域可能含有与雄激素受体结合的负性调控元件。但该报道没有发现maspin结合到ar启动子区，也没有发现maspin抑制ar的转录和表达。
白庆、刘晟等人在中国现代医生发表了maspin基因与肿瘤关系的研究，通过对maspin基因在肿瘤方面的研究现状及其与相关基因关系的综述,为恶性肿瘤的诊断和治疗提供一种新的有效的途径。maspin基因对肿瘤细胞的抑制作用表现在:(1)诱导细胞凋亡；(2)抑制肿瘤新生血管的生成；(3)抑制肿瘤细胞的侵袭与转移。但是该发明并没有确定maspin蛋白是否能结合到ar启动子区域(核酸序列)，从而调节ar的转录和表达。
技术实现要素：
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供乳腺丝抑蛋白(maspin)的新用途。
maspin和ar表达在正常的上皮组织中，在维持上皮组织和细胞生理平衡中起重要的作用。一旦这种平衡被破坏，就可能引起组织、细胞的恶性转化并最终成为肿瘤。研究发现maspin在前列腺肿瘤中通常不表达或者表达降低，而ar的表达及活性普遍升高；反之，maspin在pc3肿瘤细胞中高表达，但该细胞不表达ar分子；同时恶性程度较低的lncap细胞既表达maspin，也表达ar，且二者表达水平与生物学活性均处于可控水平。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供乳腺丝抑蛋白(maspin)在调控雄激素受体表达中的应用(用于调控ar表达)，调控用于非治疗目的。
优选的是，调控方法包括肿瘤分子乳腺丝抑蛋白(maspin)结合到雄激素受体(ar)基因转录启动子区域，负向调节ar基因转录，抑制ar的表达。
上述任一方案优选的是，调控方法包括体外转染并表达maspin基因后抑制ar的表达。
上述任一方案优选的是，调控方法包括利用sirna抑制maspin表达后能促进ar的表达。
上述任一方案优选的是，调控方法包括采用药物升高或诱导maspin表达后，下调或抑制ar表达。药物包括抑制剂类药、表观遗传调控药物、hdac抑制剂类药物、抑制dna甲基化药物。
上述任一方案优选的是，调控方法包括利用抑制剂类药物升高maspin表达后下调ar表达。
优选的是，抑制剂类药物为蛋白水解酶抑制剂类药物。
上述任一方案优选的是，调控方法包括采用表观遗传调控药物升高maspin表达后，抑制ar的表达。
优选的是，表观遗传调控药物包括entinostat。
上述任一方案优选的是，调控方法包括利用hdac抑制剂类药物诱导maspin表达后，抑制ar的表达。
优选的是，hdac抑制剂类药物包括entinostat。
上述任一方案优选的是，调控方法包括利用抑制dna甲基化药物诱导maspin表达后下调ar表达。
本发明还提供乳腺丝抑蛋白maspin在制备治疗或预防肿瘤疾病的药物中的应用。
优选的是，所述肿瘤是由于ar的转录和/或表达过量引起的。
上述任一方案优选的是，所述肿瘤包括前列腺肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、鼻咽癌等肿瘤。
本发明还提供编码乳腺丝抑蛋白的基因。
本发明还提供含有编码乳腺丝抑蛋白的基因的工程菌或转基因细胞系。
上述任一方案优选的是，所述ar的转录和/或表达能够通过maspin蛋白结合到ar启动子区域调节。
本发明还提供乳腺丝抑蛋白maspin在抑制雄激素受体ar基因转录，负向调节ar的表达的药物中的应用。
本发明还提供乳腺丝抑蛋白maspin在制备协同和/或促进雄激素受体ar拮抗剂类药物中的应用。
本发明还提供乳腺丝抑蛋白在制备促进雄激素受体的表达的药物中的应用。
优选的是，所述乳腺丝抑蛋白maspin能够通过外源物抑制表达后实现促进雄激素受体的表达。
上述任一方案优选的是，所述外源物包括sirna。
本发明还提供乳腺丝抑蛋白maspin在制备用于下调ar表达的蛋白水解酶抑制剂类药物中的应用。
本发明还提供乳腺丝抑蛋白maspin在制备化疗药物中的应用。
本发明还提供乳腺丝抑蛋白maspin在制备促进药物的抗肿瘤作用中的应用。
优选的是，所述药物为表观遗传调控药物。
上述任一方案优选的是，通过抑制剂类药物诱导maspin表达后，提高药物的抗肿瘤作用。
上述任一方案优选的是，所述抑制剂类药物为hdac抑制剂类药物，包括entinostat。
上述任一方案优选的是，通过抑制dna甲基化药物诱导maspin表达后下调ar表达实现药物的抗肿瘤作用。
上述任一方案优选的是，肿瘤细胞通过转基因表达maspin，提高药物的抗肿瘤作用。
本发明还提供乳腺丝抑蛋白maspin在制备提高肿瘤病人的药物敏感性方面的药物的应用。
本发明还提供乳腺丝抑蛋白maspin在制备促进肿瘤细胞的凋亡和/或细胞dna损伤药物中的应用。
本发明的有益效果是：本发明首次提供乳腺丝抑蛋白(maspin)的用途：抗肿瘤分子乳腺丝抑蛋白(maspin)能结合到雄激素受体(ar)基因转录启动子区域，负向调节ar基因转录，抑制ar的表达。由于ar的高表达及其介导的细胞信号通路的异常激活是前列腺肿瘤的发生、发展以及治疗预后不佳的主要原因。同时，可利用或基于此发明(利用maspin抑制ar表达的生物学功能)，将maspin作为抗ar药物的协同分子，设计出抗肿瘤路径和开发基于该发明的预防性和治疗性药物；提高基于提高maspin表达的临床应用路径，协同和促进ar拮抗剂类药物的临床治疗药效。
附图说明
图1为本申请乳腺丝抑蛋白的用途一优选实施方式实施例一的结果图；
图2为本申请乳腺丝抑蛋白的用途另一优选实施方式实施例二的一结果图；
图3为本申请乳腺丝抑蛋白的用途另一优选实施方式实施例二的另一结果图；
图4为本申请乳腺丝抑蛋白的用途另一优选实施方式实施例三的一结果图；
图5为本申请乳腺丝抑蛋白的用途另一优选实施方式实施例四的一结果图；其中图5a结果来源于22rv1细胞；图5b结果来源于22rv1-m7细胞以及对照克隆细胞22rv1-neo细胞；
图6为本申请乳腺丝抑蛋白的用途另一优选实施方式实施例五的一westernblot检测结果图；
图7为本申请乳腺丝抑蛋白的用途另一优选实施方式实施例六的westernblot检测结果图，其中图7a结果来源于利用药物hdac抑制剂entinostat和ar拮抗剂enzalutamide处理lncap，westernblot检测结果；其中图7b结果来源于利用药物hdac抑制剂entinostat和ar拮抗剂enzalutamide处理22rv1肿瘤细胞，westernblot检测结果；
图8为本申请乳腺丝抑蛋白的用途另一优选实施方式实施例七的westernblot检测结果图，其中图8a结果来源于利用甲基化抑制剂药物aza处理实施例六的lncap细胞48小时候，westernblot检测结果；图8b结果来源于利用甲基化抑制剂药物aza处理实施例六的22rv1细胞48小时后，westernblot检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
maspin抑制雄激素受体ar的转录和表达
实施例一
前列腺肿瘤上皮细胞22rv1体外转染并表达maspin基因后抑制ar的表达：由于22rv1肿瘤细胞不表达maspin，但表达ar。因此我们利用通用的基因转染技术(参考文献：zouz.etal,science1994,biliranhjr,shengs,cancerresearch,2001)，首先将外源性的maspin基因(genebank:u04313.1)通过限制性酶切位点ecorⅰ和xhoⅰ和t4dnaligase连接插入pcdna3.1质粒中表达，经转染dh5α感受态细胞并培养扩增后纯化质粒dna，并利用商用的脂质体转染试剂导入22rv1肿瘤细胞，经克隆筛选得到了表达maspin的细胞克隆。经westernblot检测后发现：对应于转染空质粒dna的对照组neo克隆细胞，转染并表达maspin的克隆细胞m7和m11表现出低表达ar的现象，如图1所示。该结果显示基因转染maspin能下调ar基因表达。
实施例二
rna干扰技术(sirna)抑制maspin表达后能促进ar的表达(lncap，pc3-ar28)：rna干扰(rnainterference，rnai)技术是利用短片断双链rna分子(譬如sirna，smallinterferingrnas)以序列同源互补的mrna为靶目标，降解特定的mrna，来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。由于前列腺肿瘤lncap细胞株和pc3-ar28细胞既表达maspin，也表达ar分子。利用我们已经发表的sirna干扰技术(lixetal,cancerresearch,2006)，我们设计了针对maspin的三对sirnasirna序列：序列一为，gcggcucuacguagacaaatt和uuugucuacguagagccgctt，序列二为，ggucagaucaacaacucaatt和uugaguuguugaucugacctt。序列三为，gccacguucuguaugggaatt和uucccauacagaacguggctt。经商用的lipofectamin试剂介导转染，导入上述lncap和pc3-ar28细胞中并瞬时表达。经westernblot检测后发现，经maspin干扰sirna处理降低maspin的克隆细胞表现出高表达ar的现象，图2为使用lncap的结果、图3是使用pc3-ar28的结果。该结果进一步证明，maspin负向调节ar的表达。
实施例三
利用染色质免疫沉淀结合pcr(chip-pcr)技术研究maspin分子结合ar基因的启动子序列：我们设计特异性扩增ar基因表达启动子区域的引物，利用抗maspin抗体和lncap进行chip-pcr试验，结果发现；在抗maspin抗体进行免疫沉淀的染色质中发现有ar基因启动子区域序列的扩增产物，如图4所示。该结果进一步证明，maspin蛋白通过结合在ar转录启动子区域。这是maspin蛋白负向调节ar基因转录，抑制ar的表达的分子间相互作用证据。
实施例四
蛋白水解酶抑制剂类药物升高maspin表达后能下调ar表达：利用蛋白水解酶抑制剂mg132联合甲基化抑制剂药物aza处理22rv1细胞，22rv1-m7细胞以及对照克隆细胞22rv1-neo细胞48小时后westernblot检测后发现：aza确能诱导maspin表达的同时，降低ar的表达，而mg132处理后并未能挽救这种ar的降低表达。图5a(上图)结果来源于22rv1细胞，图5b(下图)结果来源于22rv1-m7细胞以及对照克隆细胞22rv1-neo细胞。
实施例五
转基因表达maspin促进化疗药物恩杂鲁胺(enzalutamide)和表观遗传调控药物entinostat的抗肿瘤作用:前面已经说明的22rv1肿瘤细胞不表达maspin，但表达ar。我们利用前述同样的基因转染技术(实施列一已经说明)将外源性的maspin基因导入22rv1肿瘤细胞，经克隆赛选得到了表达maspin的m7和m11细胞克隆以及对照组neo细胞克隆。该系列细胞在体外经药物enzalutamide和entinostate处理48小时后，westernblot检测细胞凋亡(apoptosis)的标志物分子parp的特异性裂解片段(89kd)和细胞dna损伤标志物分子p-h2ax的表达水平，以此评估药物对肿瘤细胞的损伤作用和有效性，结果如图6所示。结果发现：1)表观遗传调控药物entinostat有升高maspin表达的作用，而ar拮抗剂恩杂鲁胺(enzalutamide)不影响maspin的表达；2)不仅ar的水平在表达maspin的m7和m11细胞降低，同时m7和m11表现出对药物的高度敏感性，表现在parp的特异性降解片段(分子量89kd片段)和细胞dna损伤标志物p-h2ax水平升高。该结果证明，可对肿瘤细胞通过转基因表达maspin，促使临床肿瘤病人产生对药物的敏感性，提高药物的治疗效果。
实施例六
利用hdac抑制剂类药物(如entinostat)诱导maspin表达后，提高药物ar拮抗剂恩杂鲁胺(enzalutamide)的抗肿瘤作用：利用药物hdac抑制剂entinostat和ar拮抗剂enzalutamide处理lncap，22rv1肿瘤细胞，westernblot检测后发现hdac抑制剂entinostat能显著诱导两种肿瘤细胞表达maspin，但同时使ar表达降低，且二者负向表达水平表现出一定的剂量-效应关系，如图7a和7b所示。该结果表明，药物诱导的maspin表达也能负向调控ar的表达。同时，westernblot检测细胞凋亡(apoptosis)的标志物分子parp分子的特异性裂解片段(89kd)和细胞dna损伤标志物分子p-h2ax的表达水平，以此评估药物对肿瘤细胞的损伤作用和有效性。结果发现，maspin表达高而ar表达低的细胞出现89kd的parp片段和/或升高表达p-h2ax。该结果证明，经诱导升高maspin表达能促进肿瘤细胞的凋亡，提高恩杂鲁胺药物的治疗作用。该结果进一步证明临床上课通过设计诱导maspin表达的路径，提高相应药物的治疗效果。
实施例七
利用抑制dna甲基化药物诱导maspin表达后下调ar表达的抗肿瘤作用：利用甲基化抑制剂药物aza处理上述实施例六的lncap细胞和22rv1细胞48小时后，westernblot检测后发现maspin表达升高，而ar表达则降低，且二者负向表达水平表现出一定的剂量-效应关系，如图8a和8b所示。该结果进一步提示：药物诱导的maspin表达也能负向调控ar的表达。同时，westernblot检测细胞凋亡(apoptosis)的标志物分子parp分子的特异性裂解片段(89kd)和细胞dna损伤标志物分子p-h2ax的表达水平，以此评估药物aza对肿瘤细胞的损伤作用和有效性。结果发现，maspin表达高而ar表达低的细胞出现89kd的parp片段和/或升高表达p-h2ax。该结果证明，经aza诱导的升高maspin表达能促进肿瘤细胞的凋亡细胞dna损伤。该结果进一步证明临床上课通过设计诱导maspin表达的路径，提高相应药物的治疗效果。
本发明发现抗肿瘤分子乳腺丝抑蛋白(maspin)能通过抑制雄激素受体(ar)基因转录，负向调节ar的表达，从而降低ar的表达水平和活性。由于ar的高表达及其介导的细胞信号通路的异常激活是前列腺肿瘤的发生、发展以及治疗预后不佳的主要原因，因此可利用该发明(利用maspin抑制ar表达的生物学功能)设计出的抗肿瘤路径和开发基于该发明的预防性和治疗性药物。
任何利用该发明(利用maspin抑制ar表达的生物学功能)设计出的抗肿瘤路径、以及研究开发基于该发明的预防性和治疗性药物均受该发明保护。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。