一种用于敏感肌肤的组合物及其制备方法与流程

本发明属于美容化妆领域，主要涉及用于敏感肌肤的组合物。

背景技术：

敏感性皮肤，亦称敏感性皮肤综合征，是一种皮肤高度敏感的状态，具体是指肌肤感受力强，抵抗力弱，易受刺激而引起某种程度不适的脆弱皮肤状态。与过敏性皮肤不同的是该反应性不是由对过敏原的存在而作出的免疫反应引起。

引起皮肤敏感的因素很多，最直接和最常见的是劣质化妆品对皮肤的累计伤害而形成的结果。除此之外，食物、空气中的某种物质，使用的器材等多种因素

都可能引起皮肤产生过敏现象。常见的触发因素有：化妆品、化学药品、紫外线、食物、花粉、螨、农药、化肥、灰尘、动物皮毛、洗涤剂、染发剂、金属饰品、抗生素等。

敏感性皮肤作为一种问题性皮肤，任何肤质中都可能有敏感性肌肤。敏感性皮肤的基本特征之一是个体与触发元素接触的数分钟内出现的不适症状，不适症状主要涉及触物感痛(dysestheticsensations )，触物感痛是指在皮肤处感觉到或多或少的疼痛感觉， 例如刺痛、麻刺感、发痒或瘙痒、烧灼感、热烫感、不适感、绷紧感等。这些自觉症状多数在缺乏可视化学性征状如变红和脱皮下存在。目前已知，这些皮肤刺激和不耐受性反应尤其与通过表皮和真皮的神经末梢所释放的神经肽有关。

然而目前并没有令人完全满意的治疗或预防敏感肌肤的方法。尤其是日常皮肤护理中，护理产品中所带有的乙醇、香精、防腐剂等反而增加了对敏感肌肤的刺激，而且日常护肤品的长期使用，对皮肤的累计伤害更是雪上加霜。

CN104958425A提供了治疗光敏感性皮肤病的药物组合物，其采用了多种中药组分，但是该药物需要内服和湿敷配合使用，使用不方便，且内服的安全性难以评估。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于敏感肌肤的组合物，对皮肤无刺激，并能有效改善皮肤的敏感状态。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种用于敏感肌肤的组合物，包括皮肤干细胞培养上清液、芦荟提取物、蒲公英提取物、丝素蛋白、乳链菌肽、乳铁蛋白、磷酸腺苷、谷氨酰胺；所述皮肤干细胞培养基中添加神经干细胞裂解物。该组合物被命名为肌液。

优选的，各组分用量配比为：皮肤干细胞培养上清液800-1500份、芦荟提取物3-8份、蒲公英提取物1-5份、丝素蛋白0.5-5份、乳链菌肽0.05-0.5份、乳铁蛋白0.5-1份、磷酸腺苷0.005-0.05份，谷氨酰胺0.2-0.5份，以质量份数计。

所述神经干细胞裂解物是指神经干细胞破坏或溶解后细胞及细胞内物质的释放后所获得的混合物。包括胞质部分、细胞壁部分和代谢产物等。优选的，所述细胞裂解采用冻融法；具体地，将神经干细胞置于液氮中冷却，35-40℃融解，重复3次以上；膜过滤收集过膜物，即得。所述膜采用300-500nm孔径滤膜。

皮肤干细胞培养上清液是对皮肤干细胞培养3天以上收集得到的上清液。在培养24-48h后，在培养基中添加上述神经干细胞裂解物。兼顾生产效率和营养，以3-5天为佳。采用的培养基是：基础培养基为DMEM/F12、25-30μg/L VEGF、30-40μg/L EGF、5-10μg/L的NGF、5～50mg/L的人血清蛋白、20-30μg/L维生素E、柠檬酸铁1-3mmol/L、谷氨酰胺1-2mmol/L、庆大霉素 10-100g/L、腐胺0.8-2.0mg/L。该培养基培养24-48h后将神经干细胞裂解物加入培养基，用量为培养基的0.5-2wt%。

本发明还提供了一种护肤品，其含有上述能够用于敏感肌肤的组合物及常规化妆品级助剂，其中不含酒精、香精或防腐剂。

本发明还提供了上述用于敏感肌肤的组合物在制备敏感肌肤用护肤品中的应用。

本发明所述组合可以与其他皮肤活性成分一起用于各种产品制剂，例如，爽肤水、洁面乳、乳剂如乳液、面霜、面膜、凝胶等。

本发明所述组合物可以被用作保留型或洗去型组合物。例如，保留型组合物可以是被局部地施用至皮肤并在皮肤上保留一段时间( 比如5-30min或1-24h）；洗去型组合物可以是施用至皮肤然后在一段时间如小于5min内从皮肤去除或洗去的产品。洗去型组合物可以是皮肤清洁剂、洗发水、护发素或皂。保留型组合物的实例子可以是皮肤保湿剂、防晒剂、面膜、晚霜或日霜。

本发明所述芦荟提取物、蒲公英提取物是指水提、醇提、榨汁等方式得到的提取物。

有益效果

1.本发明能解决肌肤敏感问题，其可修复受损的角质层、神经纤维和血管壁的内皮细胞，具有抗氧化作用，加速循环代谢，清除堆积的毒素。各种有效成分彼此协同，可以增强受损皮肤的免疫力，改善皮肤的敏感性。

2.本发明安全、无刺激、无毒副作用，长期使用不会造成皮肤累计伤害。

3. 本发明不添加防腐剂、乳化剂、醇醚类、抗氧化剂、稳定剂、色素、香精等有毒害物质即可具有优异的修复敏感肌肤效果。

附图说明

图1 细胞增殖实验结果

图2 抗氧化实验结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只能用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。本发明所述肌液符合《化妆品安全技术规范》。

实施例1

一. 配制肌液

1. 神经干细胞裂解物的制备

将人神经干细胞置于液氮中冷却30min，37℃细胞培养箱中融解，重复3次；250nm孔径膜过滤收集过膜物，即得。放入37℃保温备用。

2. 皮肤干细胞培养上清液的制备：

配置培养基：基础培养基为DMEM/F12、25μg/LVEGF、35μg/LEGF、8μg/L的NGF、20mg/L的人血清蛋白、25μg/L维生素E、柠檬酸铁2mmol/L、谷氨酰胺2mmol/L、庆大霉素 50g/L、腐胺 1.6mg/L。将人皮肤干细胞在该培养基中，37℃培养24h后，在培养基中加入1wt%步骤（1）制得的神经干细胞裂解物，再培养24h，然后收集细胞液，离心，取上清，500nm孔径滤膜过滤，即得。

3. 肌液的制备

芦荟提取物是将芦荟茎去皮后的凝胶用水清洗后，进行破碎榨汁，去渣后即得。蒲公英提取物是将蒲公英粉碎后，以1g：10ml加水混合，95℃水提20min，取滤液。

将5份芦荟提取物、3份蒲公英提取物、1份丝素蛋白、0.25份乳链菌肽、0.6份乳铁蛋白、0.01份磷酸腺苷、谷氨酰胺0.3份加入步骤（1）所得皮肤干细胞培养上清液（1200份）中充分混合；在50℃保温2小时，置于4℃冷冻箱内保存。

如无特别说明，本发明所述份数均以质量份数计。

实施例2

一种用于敏感肌肤的肌液，其制备方法包括以下步骤:

1. 神经干细胞裂解物的制备

将人神经干细胞置于液氮中冷却30min，37℃细胞培养箱中融解，重复5次；250nm孔径膜过滤收集过膜物，即得。放入37℃保温备用。

2. 皮肤干细胞培养上清液的制备：

配置培养基：基础培养基为DMEM/F12、30μg/L VEGF、40μg/L EGF、10μg/L的NGF、45mg/L的人血清蛋白、30μg/L维生素E、柠檬酸铁3mmol/L、谷氨酰胺2mmol/L、庆大霉素 80g/L、腐胺 2.0mg/L。将人皮肤干细胞在该培养基中，37℃培养15h后，在培养基中加入1.5wt%步骤（1）制得的神经干细胞裂解物，再培养60h，然后收集细胞液，离心，取上清，500nm孔径滤膜过滤，即得。

3. 肌液的制备

将8份芦荟提取物、5份蒲公英提取物、5份丝素蛋白、0.5份乳链菌肽、01份乳铁蛋白、0.05份磷酸腺苷、谷氨酰胺0.5份加入步骤（1）所得皮肤干细胞培养上清液（1500份）中充分混合；在50℃保温2小时，置于4℃冷冻箱内保存。

实施例3

一种用于敏感肌肤的肌液，其制备方法包括以下步骤:

1. 神经干细胞裂解物的制备

将人神经干细胞置于液氮中冷却30min，37℃细胞培养箱中融解，重复3次；250nm孔径膜过滤收集过膜物，即得。放入37℃保温备用。

2. 皮肤干细胞培养上清液的制备：

配置培养基：基础培养基为DMEM/F12、25μg/LVEGF、30μg/LEGF、5μg/L的NGF、10mg/L的人血清蛋白、20μg/L维生素E、柠檬酸铁1mmol/L、谷氨酰胺1mmol/L、庆大霉素 30g/L、腐胺 1.0mg/L。将人皮肤干细胞在该培养基中，37℃培养30h后，在培养基中加入0.6wt%步骤（1）制得的神经干细胞裂解物，再培养80h，然后收集细胞液，离心，取上清，500nm孔径滤膜过滤，即得。

3. 肌液的制备

将3份芦荟提取物、1份蒲公英提取物、0.5份丝素蛋白、0.1份乳链菌肽、0.5份乳铁蛋白、0.005份磷酸腺苷、谷氨酰胺0.2份加入步骤（1）所得皮肤干细胞培养上清液（1000份）中充分混合；在50℃保温2小时，混合均匀，置于4℃冷冻箱内保存。

实施例4

一. 肌液对细胞增殖的影响

1. 将人角质形成细胞HaCAT、神经细胞SHSY5Y、人微血管内皮细胞HMEC-1，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验；

2. 将细胞接种于96孔板，每种细胞分为以下几组，每组设6个平行孔：

（1）100ul，DMEM/F12（含2%FBS）：空白对照组；

（2）100ul，DMEM/F12（含10%FBS）；细胞；标准对照组

（3）100ul，DMEM/F12（含2%FBS+1.0μl肌液）；细胞；

（4）100ul，DMEM/F12（含2%FBS+2.0μl肌液）；细胞；

（5）100ul，DMEM/F12（含2%FBS+4.0μl肌液）；细胞；

（6）100ul，DMEM/F12（含2%FBS+8.0μl肌液）；细胞；

（7）100ul，DMEM/F12（含2%FBS+16.0μl肌液）；细胞；

（8）100ul，DMEM/F12（含2%FBS+20.0μl肌液）；细胞。

3.MTT检测细胞增殖情况，酶标仪测定吸光值，如图1所示。

实验结果显示不同剂量肌液对人角质形成细胞、神经细胞、人微血管内皮细胞均有增殖作用。与对照组相比，1.0-20uL/mL剂量的肌液均有明显的细胞增殖作用，并表现剂量依赖性。

二. 肌液抗氧化效果

将本实施例肌液稀释分组，分组方式如下：

（1）100%实施例1肌液；

（2）1:1稀释（肌液：水）

（3）1:2稀释（肌液：水）

（4）1:4稀释（肌液：水）

使用总抗氧化检测试剂盒（FRAP法）（Sigma）检测各组肌液的抗氧化水平，按照说明书操作。Trolox是水溶性维生素E，其具有较强的抗氧化性能，PBS

+FRAP工作液（300mmol/L醋酸盐缓冲液（pH3.6），10mmol/L T）作为对照。图2是以Trolox组为基值（设定为1），各分组的抗氧化性能。可以看到，本发明所述肌液具有明显的抗氧化性能。

三. 长效实验

（1）动物和饲养环境：白化豚鼠，普通级，共30 只。体重250-280g，动物于普通级动物房内饲养，动物房的温度为20-24℃，湿度为45-55％ RH。饮水为自来水。

（2）试验方法：试验前约24h，将动物背部脊柱两侧毛剪掉，去毛范围左、右各约3cmx 3cm。取肌液0.5ml 涂在一侧皮肤上，另一侧涂抹清水作为对照，两侧在涂抹后以两层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激性胶布封闭固定6小时，然后用温水清洗以除去残留受试物。每天1 次，连续12个月。

（3）按照《化妆品安全技术规范》规定的皮肤反应来测试红斑和水肿情况。每天记录一次，并未发现任何红斑和焦痂形成，无任何水肿形成。

每个月进行血液检查、尿检、临床化学检查，未发现实验组和对照组有差异。

12个月后进行肉眼剖检和组织病理检查，为发现实验组和对照组有差异。

本发明长期使用安全可靠，能持续改善皮肤敏感问题。

四. 敏感性肌肤改善测试

1. 受试人群：

敏感肌肤人群测试：（1）通过向志愿者鼻子侧面涂抹10%乳酸溶液后，志愿者自评刺痛感觉，评分标准为0～4分：0 分为无痛，1分为轻微刺痛，2分为轻度刺痛，3分为中度刺痛，4分为刺痛强烈。中度或强烈刺痛感觉的个体认为其具有敏感皮肤，作为受试人群。

筛选到100名敏感肌肤（年龄段：22-35岁，48人；36-55岁，52人）（性别：女：84人；男，16人）；

2. 实验方法：早晚各一次，日常清洁面部后涂抹该肌液，连续使用12周，实验期间未使用其它保湿、抗衰老等护肤品。12周受试结束时，受试者鼻唇沟两侧同时分别涂抹10％乳酸和生理盐水，涂抹后5分钟内受试者自评刺痛程度。

3. 实验结果：乳酸刺激实验所得分数均值从治疗前3.5下降到治疗后1.5以下。受试结束3个月后回访，皮肤敏感改善状况得以维持，未见反复。

受试人群受试前均具有敏感性皮肤的特征性表现，经过12周治疗后，受试者的乳酸刺激分数大幅下降；皮肤敏感状态得以改善，且得以维持。