本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种包裹药理活性物质的白蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术：
白蛋白是一种生物内源性蛋白，具有的可生物降解、无毒、无抗原性等诸多特点，被认为是一个理想的药物载体，白蛋白载药体系是现今药学研究中一个极具生命力的研究方向。结合形式的白蛋白给药体系是一个非常理想的载药模式，将药物分子包裹在白蛋白纳米颗粒中，可以明显提高非水溶性药物在水溶液中(即体内血液循环系统中)的稳定性与溶解度。同时，利用肿瘤组织的透过性增强及滞留效应(epreffect)，可以使得白蛋白纳米载药体系达到靶向给药的目的。此外，白蛋白具有改善难溶性药物的溶解性和血液循环周期，提高药物的有效性。
近年来，关于白蛋白纳米颗粒制备的方法有不少，主要分为以下二大类：(1)在反溶剂或乳剂作用下的物理变性吸附制备：如2012年，高会乐等(cn102626393b)将白蛋白和难溶性替尼类药物结合，以磷脂进行分散和稳定，获得可溶性注射用白蛋白纳米制剂；2012年，高缘等(cn201415999a)将戊二醛固化的白蛋白纳米粒吸附灯盏花素；2013年，张晓宏等(cn103169968b)通过白蛋白物理吸附疏水性二氢卟吩光敏剂获得纳米光敏剂；2013年，闫学海等(cn103520734b)通过带正电荷的大分子和白蛋白分子静电吸附及还原剂作用下构建了白蛋白纳米粒子；2013年，邓意辉等(cn1919339b)用50～99.9％(w/w)的白蛋白及其他辅料在高压均质仪里制备了葫芦素的白蛋白固体制剂；2013年，张文芳等(cn103908430a)采用表面稳定剂和白蛋白混合，高压均化法制备了可以稳定存放12小时以上的紫杉醇纳米粒；2016年，张强等(cn105816885a)采用亲和素和白蛋白之间的静电相互作用构建了亲和素白蛋白纳米粒子，可以靶向经生物素偶联抗体富集的肿瘤；2017年，陈立江等(cn107126564a)通过类似abraxane工艺的高速高压均质法制备得白蛋白结合型索拉菲尼；2016年，钟延强等(cn105796502a)通过类似方法制备了蓝萼甲素白蛋白纳米粒；2016年，姜虎林等(cn105879045)通过药物和载体白蛋白间的静电吸附和配位作用，以及反溶剂作用下将载体自身氨基酸残基的交联实现了抗肿瘤药物阿霉素和造影剂mno2胶体纳米粒的共载白蛋白纳米粒；2016年，黄永焯等(cn107157950a)将白蛋白溶解于脲，通过硼氢化钠得到变性蛋白后，加入反溶剂沉淀得到白蛋白纳米颗粒；(2)蛋白化学二硫键或其他化学键交联作用制备：2013年，陈道桢等(cn103768024b)采用反溶剂和戊二醛交联方法制备了人参皂苷rh2的白蛋白复合纳米粒；2013年，王文坦等(cn103212083b)通过打开分子内二硫键，从用醇类等反溶剂沉淀白蛋白，利用巯基-二硫键交换反应得到了分子间二硫键的白蛋白纳米颗粒，可让其在稀释条件下稳定及还原环境中具有氧化还原响应。2014年，蔡林涛等(cn104189916b、cn104162164b)通过将白蛋白二硫键还原后，在反溶剂作用下得到分子之间含巯基和/或二硫键的多聚体白蛋白纳米球；2015年，李芳等(cn104490847a)通过加入香草醛类似物在加热条件将白蛋白分子内游离巯基形成分子内二硫键，蛋白上的氨基和香草醛的醛基形成席夫碱等化学键，得到水溶液中稳定的纳米颗粒；2015年，姜虎林等(cn105288647a)通过将白蛋白修饰点击反应功能化，在金属离子和药物的配位作用下，诱导自组装构建了功能化的白蛋白纳米制剂；2016年，黄海等(cn106540270a)通过二硫键的还原-氧化反应获得了紫杉醇和全反式维甲酸共载纳米颗粒。虽然研究白蛋白纳米颗粒制备的发明不少，但是只有邓意辉等(cn1919339b)用50～99.9％(w/w)的白蛋白及其他辅料在高压均质仪里制备了葫芦素固体制剂及陈道桢等(cn103768024b)提到了戊二醛交联的人参皂苷rh2的白蛋白复合纳米粒口服应用，但并无相关口服给药稳定性佐证和活体靶向案例。
由于白蛋白分子具有非常好的水溶性，如何使白蛋白纳米颗粒在水中有着良好的稳定性，在稀释条件下不解离是目前制备技术的难点。传统的戊二醛等交联剂常被用来稳定获得纳米颗粒，但戊二醛会非选择性结合蛋白表明的氨基位点，在生物体内会释放出醛类残基，对生物机体具有显著毒副作用。利用巯基乙醇为还原剂打开白蛋白分子的二硫键(cn102048695a)，使其利用疏水作用结合成为纳米颗粒，但该颗粒在10％乙醇水溶液中即全部溶解，说明该颗粒仅靠疏水相互作用稳定，而并非二硫键结合稳定(biomacromolecules,2012；13:23-8.)。americanbioscience公司开发了一种基于二硫键形成的nab技术(nanoparticelalbumin-boundtechnology)，以白蛋白为基质和稳定剂，在不加入任何乳化剂和交联剂的情况下得到白蛋白纳米粒(us6753006b1)。但近年来在对abraxane产品稀释实验(naturenanotech.,2012；7:383-8.)表明，abraxane稀释到缓冲溶液或者牛血清白蛋白溶液中后，会立刻分解成10nm左右的大小颗粒，这表明该产品也并非由于二硫键交联而得。
基于上述研究背景和临床上80％以上的药物是口服给药，及口服给药系统的方便性和顺应性，发明具有口服临床价值的蛋白纳米制剂，发挥其解决难溶性药物的溶解性、提高生物利用度及继续保持白蛋白的肿瘤组织靶向性等优势特征，已成为此类纳米药物重点关注解决的科学问题。目前，尚未见相关基于白蛋白的口服给药靶向系统研究报道。
技术实现要素：
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种包裹药理活性物质的白蛋白纳米颗粒的制备方法；该方法操作简单，将白蛋白在还原剂作用下将其内部空间结构打开，形成含巯基群活性基团的蛋白后，加入硒化合物和目标药物，借助分子内和或分子间巯基-硒硫键交换反应和巯基-二硫键交换反应和负载在蛋白空腔内外部的单质硒，获得包裹目标药物的白蛋白复合纳米颗粒的方法；该纳米颗粒尺寸均一，分散性好，保存时间长及在胃酸、肠液和血浆中具有良好稳定性，将大大改善脂溶性药物的溶解性、分散性、稳定性和生物利用度。
本发明的再一目的在于提供一种上述制备方法得到的包裹药理活性物质的白蛋白纳米颗粒。
本发明的又一目的在于提供上述包裹药理活性物质的白蛋白纳米颗粒的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种包裹药理活性物质的白蛋白纳米颗粒的制备方法，该制备方法是将白蛋白在谷胱甘肽作用下将其内部空间结构打开，形成含巯基群活性基团的蛋白后，加入硒化合物和药理活性物质，借助分子内和或分子间巯基-硒硫键交换反应和巯基-二硫键交换反应和负载在蛋白空腔内外部的单质硒，获得包裹药理活性物质的白蛋白纳米颗粒。
所述白蛋白为人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、驴血清白蛋白、转铁蛋白中的一种以上；更加优选为人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白、转铁蛋白或卵白蛋白；
所述硒化合物为二氧化硒、亚硒酸盐或硒酸盐。
所述药理活性物质为药物或者影像止痛退烧药、麻醉药、平喘药、抗生素、抗抑郁药、抗糖尿病药、抗真菌药、抗高血压药、抗炎药、抗肿瘤药、抗焦虑药、免疫抑制剂、抗偏头疼药、镇静安眠药、抗心绞痛药、抗精神病药、抗躁狂药、抗心律失常药、抗关节炎药、抗痛风药、抗凝药、溶栓药、抗纤溶药、血液流变学试剂、抗血小板药、抗惊厥药、抗帕金森药、抗组胺止痒药、钙调节药、抗菌药、抗病毒药、抗微生物药、抗感染药、支气管扩张药、激素、降糖药、降脂药、蛋白质、核酸、促红细胞生成药、抗溃疡、抗反流药、止吐药、脂溶性维生素，米托坦、更昔洛韦缬氨酸酯、亚硝基脲盐、蒽环类抗生素或玫瑰树碱。
所述药理活性物质更加优选为铂类配合物、替尼类化合物、紫杉醇、阿霉素、双硫仑、血卟啉、姜黄素、喜树碱类、呫吨酮藤黄类、二氢卟吩e6、吲哚菁绿或ir780。
上述的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：
a、将白蛋白溶液，与谷胱甘肽溶液混合，进行反应，得到空间结构展开的白蛋白均质溶液；
b、向步骤a得到的白蛋白均质溶液中加入药理活性物质的有机溶液和硒化合物的溶液，充分搅拌，得到白蛋白纳米颗粒的粗溶液；
c、将步骤b得到的粗溶液进行透析，得到包裹药理活性物质的白蛋白纳米颗粒，该白蛋白纳米颗粒中包载的药理活性物质占纳米颗粒总质量的0.1％～90％。
步骤a所述白蛋白溶液浓度为0.1-200mg/ml范围内；
所述谷胱甘肽溶液是指谷胱甘肽的磷酸盐缓冲液，ph值为5.0-9.0，其浓度为0.01～60mm，优选为0.01-40mm；所述反应的温度为10-60℃，反应的时间为10-300min；所述空间结构展开的蛋白均质溶液中白蛋白的终浓度为0.01～100mg/ml。
步骤b所述硒化合物的溶液的浓度为0.001～30mm，优选为0.001～10mm；所述向步骤a得到的白蛋白均质溶液中加入硒化合物的溶液，获得蛋白溶液中白蛋白的终浓度为0.001～90mg/ml；所述充分搅拌是在0-40℃下搅拌0.1～24h；
步骤c所述透析是将粗溶液放入透析袋，并于0-20℃低温pbs溶液中透析除去多余的谷胱甘肽、药理活性物质和硒化合物及其副产物；透析分子截留不低于1000。
一种由上述的制备方法制备得到的包裹药理活性物质的白蛋白纳米颗粒，所述包裹药理活性物质的白蛋白纳米颗粒中的硒元素与白蛋白的摩尔分子比为(0.1～10)：1，粒径分布范围为10～1000nm，优选地，硒元素与白蛋白的摩尔分子比为(1～10)：1；粒径分布范围为20～100nm；
所述包裹药理活性物质的白蛋白纳米颗粒在0～10℃下的水溶液中以均一分散形式保存长达12个月，在10～40℃下的水溶液中以均一分散形式保存长达4个月。
所述包裹药理活性物质的白蛋白纳米颗粒在ph值1-3的胃蛋白酶溶液、ph值6.8的肠胰酶溶液，或替代血浆中以均一形式稳定存在。
上述的包裹药理活性物质的白蛋白纳米颗粒在制备注射或非注射途径治疗药物中的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
本发明采用具有完全生物相容、良好溶解性和长半衰期的白蛋白为载体，在还原剂酶切作用下将其内部空间结构打开，形成含巯基群活性基团的蛋白后，加入硒化合物和目标药物，借助分子内和或分子间巯基-硒硫键交换反应和巯基-二硫键交换反应和负载在蛋白空腔内外部的单质硒，获得包裹目标药物的白蛋白复合纳米颗粒。该方法操作简单，尺寸均一，分散性好，常温保存时间长及在胃酸、肠液和血浆中具有良好稳定性的新型白蛋白结合型纳米制剂，大大改善脂溶性药物的溶解性、分散性、稳定性和生物利用度。同时，该白蛋白纳米制剂很好地保持了白蛋白的溶解性和肿瘤靶向富集特性；基于硒硫和二硫键的氧化还原响应特性，该白蛋白颗粒具有细胞内还原型谷胱甘肽的微环境响应，这对抗炎、修复再生、免疫及抗癌等重大疾病的防治具有非常重要的科学意义。此外，该白蛋白颗粒具有口服靶向活体肿瘤的特性，具有提高疏水性抗癌药物的口服给药抗癌活性及降低毒副作用。
附图说明
图1为包裹药理活性物质的白蛋白纳米颗粒的dls图；
图2为包裹药理活性物质的白蛋白纳米颗粒的tem图；
图3为白蛋白纳米载染料给药系统的口服体内靶向性比较图。
具体实施方法
以下通过实施案例对本发明做进一步的阐述，但本发明不限于此。实验者可根据实际需要选择性在白蛋白表明单独修饰靶向分子叶酸等及同时标记荧光监测分子fitc，cy5等，从而可以获得类似的包裹药理活性物质的白蛋白纳米颗粒。
本发明使用的载体为优选的人血清白蛋白hsa，示范为基本的hsa在谷胱甘肽作用下，将其内部空间结构打开，形成含巯基群活性基团的蛋白后，加入硒化合物和目标药物，借助分子内和或分子间巯基-硒硫键交换反应和巯基-二硫键交换反应和负载在蛋白空腔内外部的单质硒，获得包裹目标药物的白蛋白复合纳米颗粒。
实施例1白蛋白纳米颗粒的制备(hsanp)：
(1)将150mg/ml范围内的白蛋白溶液，与30mm谷胱甘肽溶液(谷胱甘肽的磷酸盐缓冲液，ph值为5.0-9.0)混合，在20℃条件下，经过100min搅拌反应，获得蛋白的终浓度为50mg/ml的空间结构展开的白蛋白均质溶液；
(2)向空间结构展开的白蛋白均质溶液中加入10mm的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中蛋白的终浓度为30mg/ml，4℃搅拌6h，得到白蛋白纳米颗粒的粗溶液；
(3)将白蛋白纳米颗粒的粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃的pbs溶液透析除去多余的谷胱甘肽和硒化合物及其副产物，获得白蛋白纳米颗粒。
将白蛋白纳米颗粒进行50％硝酸50℃消化，经过icp-ms检测未载药的透析液，元素硒与hsa的摩尔分子比为10:1。得到的白蛋白结合型纳米颗粒hsanp纳米尺寸均一，分布均匀，平均粒径约40-80nm。
实施例2白蛋白纳米颗粒的制备(hsanp)：
(1)将100mg/ml范围内的白蛋白溶液，与20mm谷胱甘肽溶液(谷胱甘肽的磷酸盐缓冲液，ph值为5.0-9.0)混合，在30℃条件下，经过20min搅拌反应，获得蛋白的终浓度为50mg/ml的空间结构展开的白蛋白均质溶液；
(2)向空间结构展开的白蛋白均质溶液中加入5mm的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中白蛋白的终浓度为20mg/ml，10℃搅拌8h，得到白蛋白纳米颗粒的粗溶液；
(3)将白蛋白纳米颗粒的粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃的pbs溶液透析除去多余的谷胱甘肽和硒化合物及其副产物，获得白蛋白纳米颗粒。
将白蛋白纳米颗粒进行50％硝酸50℃消化，经过icp-ms检测未载药的透析液，元素硒与hsa的摩尔分子比为5:1。得到的白蛋白结合型纳米颗粒hsanp纳米尺寸均一，分布均匀，平均粒径约50-100nm。
实施例3白蛋白纳米颗粒的制备(hsanp)：
(1)将200mg/ml范围内的白蛋白溶液，与5mm谷胱甘肽溶液(谷胱甘肽的磷酸盐缓冲液，ph值为5.0-9.0)混合，在30℃条件下，经过60min搅拌反应，获得蛋白的终浓度为80mg/ml的空间结构展开的白蛋白均质溶液；
(2)向空间结构展开的白蛋白均质溶液中加入15mm的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中白蛋白的终浓度为60mg/ml，10℃搅拌8h，得到白蛋白纳米颗粒的粗溶液；
(3)将白蛋白纳米颗粒的粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃的pbs溶液透析除去多余的谷胱甘肽和硒化合物及其副产物，获得白蛋白纳米颗粒。
将白蛋白纳米颗粒进行50％硝酸50℃消化，经过icp-ms检测未载药的透析液，元素硒与hsa的摩尔分子比为7:1。得到的白蛋白结合型纳米颗粒hsanp纳米尺寸均一，分布均匀，平均粒径约60-140nm。
实施例4白蛋白纳米颗粒的制备(hsanp)：
(1)将180mg/ml范围内的白蛋白溶液，与8mm谷胱甘肽溶液(谷胱甘肽的磷酸盐缓冲液，ph值为5.0-9.0)混合，在40℃条件下，经过90min搅拌反应，获得蛋白的终浓度为80mg/ml的空间结构展开的白蛋白均质溶液；
(2)向空间结构展开的白蛋白均质溶液中加入15mm的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中白蛋白的终浓度为50mg/ml，6℃搅拌16h，得到白蛋白纳米颗粒的粗溶液；
(3)将白蛋白纳米颗粒的粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃的pbs溶液透析除去多余的谷胱甘肽和硒化合物及其副产物，获得白蛋白纳米颗粒。
将白蛋白纳米颗粒进行50％硝酸50℃消化，经过icp-ms检测未载药的透析液，元素硒与hsa的摩尔分子比为10:1。得到的白蛋白结合型纳米颗粒hsanp纳米尺寸均一，分布均匀，平均粒径约60-130nm。
实施例5转铁蛋白纳米颗粒的制备(tfnp)：
(1)将160mg/ml范围内的转铁蛋白溶液，与20mm谷胱甘肽溶液(谷胱甘肽的磷酸盐缓冲液，ph值为5.0-9.0)混合，在40℃条件下，经过60min搅拌反应，获得蛋白的终浓度为80mg/ml的空间结构展开的转铁蛋白均质溶液；
(2)向空间结构展开的转铁蛋白均质溶液中加入10mm的亚硒酸钠溶液，获得转铁蛋白溶液中转铁蛋白的终浓度为50mg/ml，6℃搅拌16h，得到转铁蛋白纳米颗粒的粗溶液；
(3)将转铁蛋白纳米颗粒的粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃的pbs溶液透析除去多余的谷胱甘肽和硒化合物及其副产物，获得转铁蛋白纳米颗粒。
将转铁蛋白纳米颗粒进行50％硝酸50℃消化，经过icp-ms检测未载药的透析液，元素硒与tf的摩尔分子比为7:1。得到的白蛋白结合型纳米颗粒tfnp纳米尺寸均一，分布均匀，平均粒径约80-140nm。
实施例6包裹索拉非尼的白蛋白纳米颗粒(hsa-sfnp)的制备：
(1)将80mg/ml范围内的白蛋白溶液，与30mm谷胱甘肽溶液(谷胱甘肽的磷酸盐缓冲液，ph值为5.0-9.0)混合，在20℃条件下，经过200min搅拌反应，获得蛋白的终浓度为50mg/ml的空间结构展开的白蛋白均质溶液；
(2)向空间结构展开的白蛋白均质溶液中先后加入含20mm索拉非尼(sorafenib，sf)的乙醇溶液和10mm的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中白蛋白的终浓度为30mg/ml，4℃搅拌12h，得白蛋白索拉非尼结合型纳米颗粒粗溶液；
(3)将白蛋白索拉非尼结合型纳米颗粒粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃的pbs溶液透析除去多余的谷胱甘肽和硒化合物及索拉非尼等其副产物，获得包裹索拉非尼的白蛋白纳米颗粒。
将包裹索拉非尼的白蛋白纳米颗粒进行50％硝酸50℃消化，经过icp-ms检测未载药的透析液，元素硒与hsa的摩尔分子比为8:1。得到的白蛋白索拉非尼结合型纳米颗粒hsanp纳米尺寸均一，分布均匀，平均粒径约70-140nm(见图1)。取透析液进行索拉非尼的游离药物检测，hplc-ms检测获得白蛋白索拉非尼结合型纳米颗粒中索拉非尼含量为8.7％。
实施例7包裹紫杉醇的白蛋白纳米颗粒的制备(hsa-ptxnp)：
(1)将100mg/ml范围内的白蛋白溶液，与28mm谷胱甘肽溶液(谷胱甘肽的磷酸盐缓冲液，ph值为5.0-9.0)混合，在30℃条件下，经过100min搅拌反应，获得蛋白的终浓度为60mg/ml的空间结构展开的白蛋白均质溶液；
(2)向空间结构展开的白蛋白均质溶液中先后加入含10mm紫杉醇的乙醇溶液和5mm的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中白蛋白的终浓度为40mg/ml，4℃搅拌6h，得白蛋白紫杉醇结合型纳米颗粒粗溶液；
(3)将白蛋白紫杉醇结合型纳米颗粒粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃的pbs溶液透析除去多余的谷胱甘肽和硒化合物及紫杉醇等其副产物，获得包裹紫杉醇的白蛋白纳米颗粒。
将包裹紫杉醇的白蛋白纳米颗粒进行50％硝酸50℃消化，经过icp-ms检测未载药的透析液，元素硒与hsa的摩尔分子比为6:1。得到的白蛋白紫杉醇结合型纳米颗粒hsanp纳米尺寸均一，分布均匀，dls水合粒径为100-150nm，高分辨tem观察的平均粒径约30-60nm(见图2)。取透析液进行ptx的游离药物检测，hplc-ms检测获得白蛋白紫杉醇结合型纳米颗粒中ptx含量为6.5％。
实施例8包裹索拉非尼的转铁蛋白纳米颗粒(tf-sfnp)的制备：
(1)将100mg/ml范围内的转铁蛋白溶液，与25mm谷胱甘肽溶液(谷胱甘肽的磷酸盐缓冲液，ph值为5.0-9.0)混合，在20℃条件下，经过300min搅拌反应，获得蛋白的终浓度为60mg/ml的空间结构展开的转铁蛋白均质溶液；
(2)向空间结构展开的转铁蛋白均质溶液中先后加入含10mm索拉非尼(sorafenib，sf)的乙醇溶液和12mm的亚硒酸钠溶液，获得转铁蛋白溶液中转铁蛋白的终浓度为40mg/ml，4℃搅拌12h，得转铁蛋白索拉非尼结合型纳米颗粒粗溶液；
(3)将转铁蛋白索拉非尼结合型纳米颗粒粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃的pbs溶液透析除去多余的谷胱甘肽和硒化合物及索拉非尼等其副产物，获得包裹索拉非尼的转铁蛋白纳米颗粒。
将包裹索拉非尼的转铁蛋白纳米颗粒进行50％硝酸50℃消化，经过icp-ms检测未载药的透析液，元素硒与hsa的摩尔分子比为8:1。得到的转铁蛋白索拉非尼结合型纳米颗粒tfnp纳米尺寸均一，分布均匀，平均粒径约60-150nm。取透析液进行索拉非尼的游离药物检测，hplc-ms检测获得转铁蛋白索拉非尼结合型纳米颗粒中索拉非尼含量为9.6％。
实施例9包裹阿霉素的白蛋白纳米颗粒的制备(hsa-doxnp)：
(1)将120mg/ml范围内的白蛋白溶液，与18mm谷胱甘肽溶液(谷胱甘肽的磷酸盐缓冲液，ph值为5.0-9.0)混合，在25℃条件下，经过100min搅拌反应，获得蛋白的终浓度为80mg/ml的空间结构展开的白蛋白均质溶液；
(2)向空间结构展开的白蛋白均质溶液中先后加入含20mm阿霉素的乙醇溶液和8mm的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中白蛋白的终浓度为50mg/ml，4℃搅拌12h，得白蛋白阿霉素结合型纳米颗粒粗溶液；
(3)将白蛋白阿霉素结合型纳米颗粒粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃的pbs溶液透析除去多余的谷胱甘肽和硒化合物及阿霉素等其副产物，获得包裹阿霉素的白蛋白纳米颗粒。
将包裹阿霉素的白蛋白纳米颗粒进行50％硝酸50℃消化，经过icp-ms检测未载药的透析液，元素硒与hsa的摩尔分子比为6:1。得到的白蛋白阿霉素结合型纳米颗粒hsanp纳米尺寸均一，分布均匀，dls水合粒径为100-190nm，高分辨tem观察的平均粒径约60-100nm。取透析液进行dox的游离药物检测，hplc-ms检测获得白蛋白阿霉素结合型纳米颗粒中dox含量为7.5％。
实施例10包裹吲哚菁绿的白蛋白纳米颗粒的制备(hsa-icgnp)：
(1)将80mg/ml范围内的白蛋白溶液，与15mm谷胱甘肽溶液(谷胱甘肽的磷酸盐缓冲液，ph值为5.0-9.0)混合，在25℃条件下，经过120min搅拌反应，获得蛋白的终浓度为60mg/ml的空间结构展开的白蛋白均质溶液；
(2)向空间结构展开的白蛋白均质溶液中先后加入含20mm吲哚菁绿的乙醇溶液和8mm的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中白蛋白的终浓度为50mg/ml，10℃搅拌21h，得白蛋白吲哚菁绿结合型纳米颗粒粗溶液；
(3)将白蛋白吲哚菁绿结合型纳米颗粒粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃的pbs溶液透析除去多余的谷胱甘肽和硒化合物及吲哚菁绿等其副产物，获得包裹吲哚菁绿的白蛋白纳米颗粒。
将包裹吲哚菁绿的白蛋白纳米颗粒进行50％硝酸50℃消化，经过icp-ms检测未载药的透析液，元素硒与hsa的摩尔分子比为6:1。得到的白蛋白吲哚菁绿结合型纳米颗粒hsanp纳米尺寸均一，分布均匀，dls水合粒径为80-120nm，高分辨tem观察的平均粒径约40-70nm。取透析液进行icg的游离药物检测，hplc-ms检测获得白蛋白阿霉素结合型纳米颗粒中icg含量为9.9％。
实施例11包裹羟基喜树碱的白蛋白纳米颗粒的制备(hsa-hcptnp)：
(1)将170mg/ml范围内的白蛋白溶液，与25mm谷胱甘肽溶液(谷胱甘肽的磷酸盐缓冲液，ph值为5.0-9.0)混合，在25℃条件下，经过100min搅拌反应，得到空间舒展的，获得蛋白的终浓度为90mg/ml空间结构展开的白蛋白均质溶液；
(2)向空间结构展开的白蛋白均质溶液中先后加入含30mm羟基喜树碱的乙醇溶液和10mm的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中白蛋白的终浓度为60mg/ml，4℃搅拌12h，得白蛋白羟基喜树碱结合型纳米颗粒粗溶液；
(3)将白蛋白羟基喜树碱结合型纳米颗粒粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃的pbs溶液透析除去多余的谷胱甘肽和硒化合物及羟基喜树碱等其副产物，获得包裹羟基喜树碱的白蛋白纳米颗粒。
将包裹羟基喜树碱的白蛋白纳米颗粒进行50％硝酸50℃消化，经过icp-ms检测未载药的透析液，元素硒与hsa的摩尔分子比为9:1。得到的白蛋白羟基喜树碱结合型纳米颗粒hsanp纳米尺寸均一，分布均匀，dls水合粒径为200-290nm，高分辨tem观察的平均粒径约90-150nm。取透析液进行hcpt的游离药物检测，hplc-ms检测获得白蛋白羟基喜树碱结合型纳米颗粒中hcpt含量为10.6％。
实施例12包裹吉非替尼的白蛋白纳米颗粒的制备(hsa-gfnnp)：
(1)将200mg/ml范围内的白蛋白溶液，与35mm谷胱甘肽溶液(谷胱甘肽的磷酸盐缓冲液，ph值为5.0-9.0)混合，在20℃条件下，经过120min搅拌反应，得到空间舒展的，获得蛋白的终浓度为120mg/ml的空间结构展开的白蛋白均质溶液；
(2)向空间结构展开的白蛋白均质溶液中先后加入含30mm吉非替尼的乙醇溶液和20mm的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中白蛋白的终浓度为90mg/ml，4℃搅拌24h，得白蛋白吉非替尼结合型纳米颗粒粗溶液；
(3)将白蛋白吉非替尼结合型纳米颗粒粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃的pbs溶液透析除去多余的谷胱甘肽和硒化合物及吉非替尼等其副产物，获得包裹吉非替尼的白蛋白纳米颗粒。
将包裹吉非替尼的白蛋白纳米颗粒进行50％硝酸50℃消化，经过icp-ms检测未载药的透析液，元素硒与hsa的摩尔分子比为10:1。得到的白蛋白吉非替尼结合型纳米颗粒hsanp纳米尺寸均一，分布均匀，dls水合粒径为160-220nm，高分辨tem观察的平均粒径约80-130nm。取透析液进行gfn的游离药物检测，hplc-ms检测获得白蛋白吉非替尼结合型纳米颗粒中hcpt含量为13.1％。
实施例13白蛋白纳米药物的表征和鉴定：
针对前述实施例5获得的包裹索拉非尼的白蛋白纳米颗粒(hsa-sfnp)和人血清白蛋白(hsa)分别进行动态光散射(dynamiclightscattering)dls测定白蛋白颗粒纳米尺寸的水合粒径，从dls分析结果来看，hsa和hsanp水合粒径大约为10nm和100nm左右，且分散性良好，pdi值均<0.4，具体如图1。同时，对实施例6获得的包裹紫杉醇的白蛋白纳米颗粒进行了透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope)tem确证，扫描结果表明其干燥后的纳米尺寸约40nm左右，具体如图2。
实施例14包裹紫杉醇的白蛋白纳米颗粒的保存放置时间稳定性评价：
针对前述实施例6制得的包裹紫杉醇的白蛋白纳米颗粒在4，10，20和30℃条件下，放置不同时间，对其纳米的水合粒径和透明度进行考察，然后进行统计分析，发现其可以在不同温度条件下长期稳定保存(具体见表1和表2)。
表1不同温度和周期下的澄清透明度观察
表2不同温度和周期下的纳米水合粒径检测(平均值±sd)
实施例15包裹紫杉醇的白蛋白纳米颗粒的抗胃液、肠液和血浆中的稳定性评价：
参考中国药典，配置人工胃液，即取稀盐酸16.4ml，加水约800ml，再加入10g胃蛋白酶(活性效价不小于3000)，搅拌摇匀稀释至1000ml，得人工胃液缓冲液。
参考中国药典，配置人工肠液，即取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml溶解，用0.1mol/l的氢氧化钠溶液调ph值至6.8；另取胰酶pancreatin10g，加水适量溶解，然后将两液混合，加水稀释到1000ml，得人工肠液缓冲液。
实验所用血浆为临床所用的替代血浆样品。
针对前述实施6所制得的包裹紫杉醇的白蛋白纳米颗粒，分别取0.5ml稀释至2ml，加入截留分子量为3500的millipore透析管中，放入1l的模拟缓冲液中，37℃条件下，搅拌，分别在0，0.5，1，2，4和8小时下取样进行icp-ms的含量分析，具体结果如下表3所示。结果表明，白蛋白紫杉醇结合型纳米颗粒在人工模拟液中非常稳定，对口服或注射具有非常好的科学支撑。
表3不同时间作用后检测的包裹紫杉醇的白蛋白纳米颗粒ptx浓度(平均值±sd)
实施例16包裹紫杉醇的白蛋白纳米颗粒的体外抗肿瘤效应评价：
针对前述实施例6所制得的hsa-ptx和非纳米化的裸药物ptx及载体对照hsanp同时平行进行体外抗肿瘤效应评价。本实施例采用肝癌hepg2，乳腺癌细胞mcf-7，肺癌细胞a549及正常肝脏细胞lo2对其进行药效评价。
取对数生长期的细胞，根据细胞的大小接种4～10×103个于96孔板上，待生长24小时后，弃上清，然后按以下分组给药：肿瘤细胞设不加药组和加药组(浓度0.1～10μm对肿瘤细胞，浓度1～50μm对正常细胞)，每组设4～6个复孔，培养24小时，弃上清，加入100μl含0.5mg/ml的mtt(四氮唑盐)无血清培养液培养4小时，加入100μldmso(二甲亚砜)，放置于微型振荡仪上振荡10min，再置于酶标仪上490/570nm处检测od值。正常人肝脏细胞lo2做对照。每次实验均重复3次。
结果显示，随着药物浓度增加，与相应不加药对照组比较，细胞增殖活性分别下降，说明化合物呈浓度依赖性抑制肿瘤细胞细胞增殖，且hsa-ptx组比ptx组显著提高杀伤癌细胞的功能，hsanp组无毒。而对正常肝脏细胞系lo2细胞的增殖活性抑制明显低于肿瘤细胞组，显示出hsa-ptx对正常细胞具有更低毒特性，对癌细胞具有高选择性(如表4)。
表4不同细胞的ic50值(72h)及不同化合物ic50比值
实施例17包裹荧光染料cy5的白蛋白纳米颗粒的口服体内靶向性评价：
按实施例1所述白蛋白纳米颗粒的制备方法，将荧光染料cy5制得的cy5-hsa和非纳米化的裸染料cy5和hsa的混合物(简称cy5组)同时在接种pc3前列腺癌细胞肿瘤成功的裸鼠进行口服成像分析。
将购于spf动物中心种源的无胸腺裸鼠(balb/c,3-4周)的左或右边侧部位注射6-8×106pc3细胞，注射时间记为0天；约一周后，待肿瘤体积长大至0.8cm直径后，口服灌胃注射300μl的cy5-hsa和非纳米化的裸染料cy5生理盐水溶液，ivisluminaiiinvivoimagingsystem进行跟踪荧光成像监测。12h后，活体观察及牺牲小鼠；观察在心、肝、脾、肺、肾和胃肠及肿瘤的蓄积情况，如图3所示(因单体cy5主要富集在肝脏和肾脏，本图片没有单独列举，特此说明)，结果表明cy5-hsa在肿瘤显著富集，而对照的cy5组没有富集现象。充分说明本申请的hsa载体制备工艺具有非常确定的癌症靶向性，为肿瘤药物的口服靶向传递提供了新的希望。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。