本发明属于中药领域。涉及一种治疗小儿肠系膜淋巴结肿大的药物及其制备 方法。
背景技术：
小儿肠系膜淋巴结肿大多由链球菌感染所致，常见于7岁以下小儿，本病常 与上呼吸道感染有关，多见于回肠末端，淋巴结呈多发性充血、肿大，腹腔内可 有少量炎性渗液。近几年来，该病有增长趋势，临床表现以脐周或右下腹痛为主， 腹痛呈阵发性，伴有食欲不振，影响儿童的生长发育，严重影响患儿的身心健康 及生活质量。
目前西医主要采用广谱抗生素、支持疗法及对症治疗，如头孢类抗生素、氨 苄青霉素、甲硝唑等。用西药治疗，虽能短期缓解腹痛症状，但对整体症状。功 能恢复则相对较慢，且副作用较大，机体抵抗力降低，二重感染几率增加，并反 复发作。经西药治疗炎症虽得到控制，但内滞未清，气运仍阻。中医治疗从病因 着手，从根本上治疗，以调理气机、疏通经脉、解毒散结为主，同时对症施治， 清热祛湿、消食和胃、健脾化积，从而使整体功能得以改善，可使其巩固不发。
本发明用于治疗小儿肠系膜淋巴结肿大的药物是根据中医辩证理论，再经现 代科学的工艺流程制成的复方制剂，把中药内的有效成分全部提取出来，制成药 物，易于机体吸收、起效快，并且服用方便、安全无副作用的优点，以解决目前 西医治疗小儿肠系膜淋巴结肿大副作用较大且机体抵抗力降低的缺点，并且有提 高机体免疫力使其巩固不复发。具有消积止痛，健脾开胃的作用，能治疗小儿肠 系膜淋巴结肿大、抗炎、提高免疫功能。
中医认为小儿肠系膜淋巴结肿大归属于“小儿腹痛”范畴。外邪侵袭，或内有 所伤，以致气血运行受阻，或气血不足以温养者，均可致腹痛。小儿的生理特点 决定了小儿易受内外因素干扰，腹痛可因外感时邪、乳食积滞、脏气虚冷所诱发。 小儿肠系膜淋巴结肿大临床表现多为腹痛、呕吐等胃肠道疾病症状，且腹痛范围 广，多位于脐周，压痛部位以脐周多见，也有表现上腹或下腹部疼痛者，部位不 固定，辩证位在脾及肠胃。该病常反复发作，迁延不愈，严重影响患儿的身心健 康及生活质量，中医认为该病是因小儿行气未充，卫外不固，对寒暖不能自调， 易受外邪或食积，致中焦气机淤滞，湿痰食互结，搏结肠间，经脉不同，故产生 腹痛。因腹痛所涉及的脏腑以六腑居多，而“六腑以通为用”，故治疗从病因着手， 从根本上治疗，以调理气机、疏通经脉、解毒散结为主，同时对症施治，从而使 整体功能得以改善，增强小儿自身的机体免疫力。
技术实现要素：
本发明的解决方案是基于祖国医学对小儿肠系膜淋巴结肿大的认识及治疗 原则，又参考现代药理研究，采用消积止痛，健脾开胃的药物，按中医；理论组 方，达到治疗小儿肠系膜淋巴结肿大的目的。
本发明药物组分的用量也是经过发明人进行大量摸索总结得出的，各组分用 量为在下述重量范围内都具有较好疗效：
延胡索150～200份，白芍200～300份，枳实150～200份，鸡内金150～ 200份，莱菔子150～240份，甘草120～180份，莪术140～180份，夏枯草200～ 300份，麦芽200～300份
优选为：
延胡索180份，白芍240份，枳实180份，鸡内金180份，莱菔子180份， 莪术150份，甘草120份，夏枯草240份，麦芽240份。
本发明药物可以采用中药制剂的常规方法制备成任何常规内服制剂。优选地 本发明药物活性组分的制备方法如下：
(1)按上述重量比称取各原料药，取处方量的延胡索、白芍和莪术进行挥发 油提取后残渣备用。
(2)枳实、鸡内金、莱菔子、甘草、莪术、夏枯草、麦芽及挥发油提取后的 延胡索、白芍和莪术残渣一起加10～12倍量水，水煎煮三次，每次1～2小时， 滤过，合并滤液，在60℃时测量，浓缩至相对密度为1.08～1.10，冷却，浓缩， 蒸干。
(3)延胡索、白芍和莪术提取的挥发油用β-环糊精进行包合，包合物烘干， 备用。
(4)将(2)和(3)所得浓缩物和包合物一起混匀。
本发明一个重要实施方式中，步骤(1)延胡索、白芍、莪术进行挥发油提 取；步骤(2)挥发油提取物用β-环糊精进行包合。
将步骤(4)得到的活性组分用70％乙醇制粒，干燥，装入胶囊。
或加入适量的硬脂酸镁，压片。
或加入2～3.5倍量的糖粉制粒，制成颗粒剂。
本发明药物的活性组分可以加入制备不同剂型时所需的各种常规辅料，如崩 解剂、润滑剂、粘合剂等以常规的中药制剂方法制备成任何一种常规口服剂型， 如丸剂、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液等。
本发明为棕褐色粉末气微，味微酸而涩，微苦，每g粉相当于10.65g生药。 临床用量，口服儿童每日21g生药。口服，一次一袋，一日三次。每袋装25g。 本发明药物具有消积止痛，健脾开胃作用，用于治疗小儿肠系膜淋巴结肿大。
具体实施方式
以下通过试验例来进一步阐述发明所述药物的有益效果，这些试验例包括了 本发明药物(以下称复方参草颗粒)的抗免疫作用机制试验及抗炎镇痛作用试验。
1.发明药物的抗免疫作用机制试验
受试药物：复方参草颗粒，药学对延胡索，白芍，枳实，莪术，夏枯草，麦 芽进行了定性鉴别，对白芍进行了含量测定。提供单位：吉林省中医药科学院制 剂研究室。配制方法：临用时将复方参草颗粒以蒸馏水配成所需浓度，常温下摇 动混匀灌服。
实验动物：Balb/c小鼠48只，8周龄，雌雄各半，山东大学实验动物中心提 供，许可证：SCXK(鲁)2016-0001。饲养于清洁环境，给予饲料和水喂养，动 物室温度为25±2℃。
试剂：注射用环磷酰胺(CTX)，江苏恒瑞制药有限公司；注射用左旋咪唑 (LMS)，南京振中生物工程有限公司；牛血清蛋白、RPMIR1640培养基，美国 Ginco公司；乳酸脱氢酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)，南京建成生物工程；ELISA 试剂盒，西塘生物科技有限公司；刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)、中性红 (N7005)，美国Sigma公司；FITC-CD3+、APC-CD4+、PE-CD8+，美国BioLegend 公司；青霉素(160201)，上海先锋药业公司；硫酸链霉素(DOZO03)，上海四 药有限公司。
实验仪器：超低温冰箱(MDF-U72V)，日本Sanyo公司；全自动高速冷冻 离心机，德国Eppendorff公司；普通光学显微镜(OlympusBX51)，日本Olympus 公司；BDS-200倒置生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限责任公司；MS2 Minishaker46涡旋混合器，德国IKA公司；Tecan Infinite200Pro多功能酶标仪， 瑞士TECAN公司；低速台式离心机(TDL-4型)，上海安亭科学仪器厂；超净 工作台，德国Heraeus公司；HEARcell 150iCO2培养箱，美国Thermo公司；FC500 流式细胞仪，美国Beckman，公司；XS205DU分析天平，瑞士Mettler Toledo公 司；DK-420S三用恒温水箱，上海精宏试验设备有限公司。
实验方法及结果
1.1供试品和所需药品溶液配制
1.1.1供试品样品制备
取复方参草颗粒研磨成粉末，准确称取100g，80％的甲醇超声萃取30min， 过滤，残渣加80％的甲醇继续超声萃取30min，重复两次，将所得滤液减压浓缩， 真空干燥后得到FB-E样品(31.5g)。
将上述提取后剩余的残渣加入500ml蒸馏水，在60℃条件下水浴浸提2h， 过滤得到浸提液后减压浓缩约至50ml，缓慢加入3倍体积的无水乙醇，搅拌产 生絮状沉淀，置于4℃冰箱中过夜，过滤收集沉淀，并用80％的乙醇溶液洗涤3 次，蒸馏水复溶后过0.22μm的滤膜，冷冻干燥得沉淀FB-P样品。
1.1.2药品溶液配制
CTX溶液配制：注射用CTX加入生理盐水20ml配制成浓度为25mg/ml的 溶液，使用时加入生理盐水稀释至所需浓度，环磷酰胺水溶液2～3小时内稳定， 最好现配现用。
LMS溶液配制：取50mg LMS加入0.5％CMC研磨混匀至定体积20ml，4℃ 贮存，备用。给药剂量为10mg/kg。
Con A溶液的配制：将0.40mg的Con A溶解于20.00ml不含胎牛血清的 PRMI-1640培养液中，配制成浓度为20μg/ml的Con A溶液。
LPS溶液的配制：将0.60mg的LPS溶解于30.00ml不含胎牛血清的 PRMI-1640培养液中配成浓度为30μg/ml的LPS溶液。
1.2实验动物分组及给药
将健康的Balb/c小鼠48只，雌雄各半，随机分为6组(n＝8).正常对照组(Control)：通过腹腔注射生理盐水(注射体积同CTX造模组)；环磷酰胺诱导 造模组(模型组、给药高、中、低剂量组、阳性对照组)；采用CTX60mg/kg/d 的剂量分别在第1、2、3天进行腹腔注射，建立免疫低下小鼠造型，再在第10 天适当强化1次。建立模型之后，空白对照组、模型组分别于造模后的第二天连 续给予一周的生理盐水0.2mL/只；阳性对照组给予LMS(10mg/kg)；给药组FB-E 按照25mg/kg，100mg/kg的给药剂量口服灌胃给药，连续给药一周；给药组FB-B 按照50mg/kg，200mg/kg的剂量进行口服灌胃给药，连续给药一周。实验期间， 各组小鼠自由进食和饮水，饲养环境稳定。
1.3动物标本采集
1.3.1血清标本采集
在实验末次给药24h之后，对所有的实验小鼠进行称重并记录，行眼球取血 1ml于EP管中，室温放置2h后，在3500rpm条件下离心10min，取上清置于 EP管中并进行分装，在-20℃冰箱中保存待测。
1.3.2腹腔巨噬细胞收集
小鼠取血之后，脱颈处死，以75％乙醇浸泡，在无菌条件下用预冷的PBS 5ml 冲洗小鼠腹腔，收集腹腔渗出细胞作为小鼠腹腔巨噬细胞，重复用PBS洗三次， 合并灌洗液，1000rpm条件下离心5min，除去上清后，沉淀细胞用无菌PBS洗 三遍后加入适量的完全RPMI-1640培养液重悬，调整巨噬细胞密度至2×106个 /ml。用等渗台盼蓝溶液拒染检测细胞活力，活细胞数大于95％。
1.3.3脾细胞悬液的制备
小鼠脱颈椎处死后，在无菌条件下取脾脏放入盛有双抗的PBS缓冲液的培 养皿中，用镊子将脾脏撕碎，置于1ml含有高糖的1640培养基中，用无菌磨棒 过200目筛网，加1ml培养液冲洗，移入离心管中，细胞悬液2000rpm条件下 离心5min后弃除上清液后加入红细胞裂解液4ml，轻轻吹打均匀室温静置5min， 2000rpm离心5min，弃上清，细胞用4mlPBS洗3遍后，加含10％胎牛血清的 1640培养液重悬细胞，培养箱中静置2h，除去贴壁细胞悬液，离心5min，细胞 培养液洗三遍，计数调整细胞密度2×106个/ml。用等渗台盼蓝染料排斥法计数 脾淋巴细胞数目并判断活力。
1.3.4脾脏混悬液的制备
小鼠断颈椎处死，取脾脏在0℃的生理盐水中漂洗，滤纸吸干水分后称重。 将预冷的生理盐水按照脾组织重量的9倍体积加入组织中，冰浴中采用组织匀浆 机10000～15000rpm条件下制成10％的组织匀浆，制备好的匀浆低温离心机 2000rpm离心10min，离心后弃沉淀，收集匀浆上清分装后，于-80℃超低温冰箱 中保存，备用。
未作特别的说明，所进行的后续生物学活性指标测定试验中所用血清、脾细 胞悬液以及脾脏组织匀浆上清液均按照以上处理方法进行制备。
1.4免疫指标检测
1.4.1对生长性能的影响
所用实验动物首次给药之前准备称量记录体重，给药后随时观察动物的生长 情况，并且隔日记录动物体重一次，在末次给药24h后称重记录体重后按照标本 采集过程处理。
如表1-1所示，正常对照组除外，其他各组小鼠在连续3天腹腔注射CTX 基础上给予给药组及阳性对照药物连续7天，隔天称重，由实验结果发现，所有 的免疫低下小鼠与空白组相比体重均有所下降，各给药组以及阳性对照组均能不 同程度的改善小鼠体重以及饮食情况，但趋势并不明显，也没有表现出显著性差 异。
表1-1小鼠体重变化
1.4.2胸腺、脾脏指数测定
在实验末次给药24h之后，脱颈处死小鼠，取出完整脾脏和胸腺，去除脂肪、 系膜，用预冷的生理盐水漂洗表面血污后用滤纸吸干表面水分，称量记录脏器重 量脏器重量，分别按下面公式计算脾脏指数和胸腺指数。
公式：脾脏(胸腺)指数(mg/g)＝脾脏(胸腺)重量/体重。
实验结果表明：模型组小鼠的胸腺指数和脾脏指数均明显低于正常组，差异 具有显著性意义，各给药组小鼠的脾脏指数也明显高于模型组，25mg/kg和 100mg/kg给药剂量的FB-E组较模型组均能显著地提高免疫低下小鼠的胸腺指数 以及脾脏指数，具有显著性差异；50mg/kg和200mg/kg给药剂量的FB-P组也能 够能显著地提高免疫低下小鼠的胸腺指数以及脾脏指数，使免疫低下小鼠的指数 达到正常小鼠的水平，与模型组相比差异具有显著性意义。说明FB-P能提高并 恢复免疫抑制小鼠胸腺指数和脾脏指数，使受抑制机体免疫器官向正常方向恢 复；FB-E组高剂量时可能会使免疫低下小鼠的脾脏指数超过正常小鼠的脾脏指 数。
1.5巨噬细胞吞噬功能测定
按照3.2中的实验方法收集小鼠腹腔巨噬细胞，台盼蓝燃料拒染后检测其活 性(＞95％)，用含有10％胎牛血清的RPM1640培养液调整小鼠腹腔巨噬细胞密 度为2×106个/ml，接种于96孔板中，没孔加入100μL，置于37℃、5％CO2饱和 湿度的培养箱中培养6h，倾去培养液，每孔加入100μL0.1％的中性红溶液，继 续培养0.5h，弃除上清后，每孔用预温的PBS重复洗三次，加入细胞裂解液(冰 醋酸：无水乙醇，1：1)100μL，轻轻振荡，4℃条件静置过夜，使巨噬细胞完 全溶解。用全自动酶标仪测定492nm处的吸光度值(OD值)，以OD值表示巨 噬细胞吞噬能力的强弱。
FB-E和FB-P对巨噬细胞吞噬功能的影响，实验结果表明，Balb/c小鼠经 CTX诱导后腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力明显低于空白对照组，具有显著性差 异，表明CTX造免疫低下小鼠模型成功。低剂量与高剂量的两种复方颗粒提取 物给药组的巨噬细胞吞噬能力均随着剂量的增加而增加，且与模型组相比均有显 著性差异，其中200μg/ml的FB-P组的吞噬中性红的能力极显著增强，这种现象 也可能与FB-P促使巨噬细胞增殖有关，表明复方颗粒提取物可增强免疫低下小 鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力。
1.6血清中多种因子的水平测定
按照上述步骤2.1(小鼠血清样品采集)处理小鼠所收集的血清，采用夹心ELISA方法，进行IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-4、IL-10和IgG、IgM的测定。 在细胞因子单抗包被的酶标板上加入一系列浓度的标准品溶液以及待测样品 (n＝3)。将反应板充分混匀后。37℃孵育40min，洗板5次；加第一抗体工作液 50μL(空白除外)，充分混匀，置37℃下20min，洗板5次；加酶标工作液体100μL， 置于37℃反应10min，洗板5次；加底物工作液100μL，避光37℃反应15min； 加终止液100μL混匀终止反应。用酶标仪在450nm处测定吸光度值，间接表示 血清样品中各因子的含量。
实验结果表明，模型组小鼠血清中的IFN-γ、TNF-α以及IL-2、IL-6的浓度 均明显下降，与空白对照组相比具有显著性差异；血清中的IL-4和IL-10的浓度 则显著的升高，与空白对照组相比也具有显著性差异，说明CTX造免疫低下小 鼠模型成功。从各个给药组以及阳性对照组的结果来看，各给药组对改善CTX 造成的小鼠免疫低下均有很好的调节作用，使小鼠血清中的IFN-γ、TNF-α以及 IL-2、IL-6四种因子的浓度有所回升，有的甚至要优于阳性对照组的治疗效果， 并且均呈现出浓度依赖性；而对IL-4和IL-10两种因子的浓度则是起到降低的作 用，也呈现出了浓度依赖性，浓度越高效果越显著。
细胞因子是Th1/Th2平衡的主要调节因素，将以上因子分为Th1(IFN-γ、 TNF-α、IL-2)和Th2(IL-4、IL-10)两个亚群，根据以上小鼠血清中的因子变 化，来讨论Th1/Th2的比值相对比于空白对照组来说明显著的降低，具有统计学 意义；阳性对照药物对CTX造成的Th1/Th2的失衡有一定的上调的作用；给药 组也对Th1/Th2的失衡有调节作用，均能够显著上调Th1/Th2的值，呈现出浓度 依赖性，尤其是在高浓度时，几乎能够纠正失衡。所以益肺通络两个组均能够调 整免疫失衡，一定程度上提高CTX造成的免疫力低下症状。
表1-2Th1/Th2的比值变化
IgG和IgM的测定结果可知，经CTX造模后的小鼠的血清中IgG和IgM的 水平明显的降低，与空白对照组相比具有显著性差异；与模型组小鼠相比，CTX 造模后的小鼠在分别给予低剂量和高剂量的FB-E或者FB-P时，血清中IgG和 IgM的水平都有所提高，除了低剂量的FB-E给药组之外，其他给药组以及阳性 对照组与模型组相比，均具有显著性差异，且均呈剂量依赖性。
1.7脾淋巴细胞的转化实验
取脾细胞悬液100μL加入96孔板中，每孔细胞数为2×105个，并加入Con A (LPS)溶液100μL使最终浓度为5μg/ml的Con A(LPS)100μL，同时设空白 对照孔(只加脾细胞悬液)，每孔设3平行，置于37℃，5％CO2培养箱中培养 68h后，每孔加入10μL的CCK 8溶液，继续培养2h后，充分震荡后，于450nm 波长下测定吸光度值。
以刺激指数(SI)为指标，评定小鼠脾淋巴细胞转化增殖程度，SI计算公式 如下：
SI＝(刺激孔OD值-空白孔OD值)/(未刺激孔OD值-空白孔OD值)
实验结果表明，与空白组实验小鼠相比，模型组小鼠脾淋巴细胞对Con A或 LPS诱导的增殖反应受到了明显的抑制，而各给药组(FB-E和FB-P)均能够显 著增强免疫低下小鼠脾脏淋巴细胞对Con A和LPS诱导的增殖反应恢复至正常， 效果甚至略优于阳性对照组。而低剂量组的作用并不明显。
1.8脾细胞自然杀伤活性的测定
1.8.1效应细胞和靶细胞的制备
按照2.3脾细胞悬液制备方法制备脾细胞悬液作为效应细胞，用含10％胎牛 血清的1640培养液调整细胞至5×106个/ml。HL-60(人原髓细胞白血病细胞)， K562(人红白血细胞)，P815(小鼠肥大细胞瘤细胞)细胞作为靶细胞，培养 24-48h，采用台盼蓝染料排斥法测定活力在95％以上后，调细胞密度为1×105个 /ml。
1.8.2脾细胞活性的测定
将效应细胞与靶细胞铺在96孔板中分为：1)效应细胞组：加入脾细胞悬液 和RPMI-1640培养液各100μL；2)靶细胞组：加入靶细胞悬液(HL-60、K562、 P815)和RPMI-1640培养液各100μL；3)杀伤实验组：加入脾细胞悬液和靶细 胞悬液各100μL。设置3个平行孔，在37℃，5％CO2和饱和湿度的培养箱中培 养24h后，加入10μL的CCK 8溶液，继续培养4h后，采用全自动酶标仪于450nm 波长下测定吸光度值。
小鼠脾脏中细胞的活性计算公式：
细胞活性(％)＝[1-(实验孔OD值-效应细胞孔OD值)/靶细胞孔OD值]×100％ 由实验结果可知，与正常对照组比较，模型组自然杀伤细胞(NK)杀伤活性降 低；与模型组比较，FB-E和FB-P在低、高剂量组中杀伤活性均提高，其中FB-E 的高剂量组作用最为显著；阳性对照组也能够提高杀伤活性。
与正常对照组比较，模型组自然杀伤细胞(CTL)杀伤活性降低；与模型组比较， FB-E和FB-P在低、高剂量组中活性均提高，其中FB-E的高剂量组作用最为显 著；阳性对照组也能够提高杀伤活性。
1.9流式细胞仪检测小鼠T淋巴细胞亚群
取2.3中制备的脾细胞悬液100μL于EP管中，各实验组分别加入荧光标记 的抗小鼠T细胞单克隆抗体，FITC-CD3+0.5μL，APC-CD4+0.4μL，PE-CD8+0.3μL。 充分混匀后，4℃条件下避光保存30min，2000rpm离心5min，移液枪吸弃上清 液，加入PBS液200μL洗涤2次，在2000rpm下离心5min，加入100μL PBL 重悬，过200目晒网后至流式管中，经流式细胞仪分析测定结果，实验结果如表 1-3。
本实验将以流式细胞仪检测到的各组T细胞亚群各指标样本均数进行比较， 实验结果显示，与正常对照组相比较，模型组小鼠的外周血中CD3+T、CD4+T 和CD8+T细胞亚群的百分率均有降低，并且CD4+T具有极显著性差异，提示小 鼠细胞免疫功能受抑制，说明建模成功；FB-E和FB-P组分的各剂量组能够不同 程度提高小鼠外周血中CD3+T和CD4+T细胞亚群的百分率，且具有剂量依赖性； 模型组小鼠血清中的CD8+T细胞亚群的百分率和CD4+/CD8+比值均有所下降， 且CD4+/CD8+比值与对照组相比具有显著性差异；给药治疗组中对CD4+T细胞 亚群的百分率的影响规律不明显，但均能使CD4+/CD8+比值升高，特别是FB-P 高剂量组与模型组相比具有显著性差异。说明给药组有较好的疗效，能提高其细 胞免疫功能，具有免疫增强作用。
表1-3T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+比值
1.10乳酸脱氢酶及酸性磷酸酶活性测定
取2.4中制备的小鼠脾脏匀浆稀释成5％的匀浆液，按试剂说明方法进行乳 酸脱氢酶(LDH)及酸性磷酸酶(ACP)活性的测定。
实验结果，与空白对照组小鼠相比，无论是LDH还是ACP，在采用CTX 造模后，小鼠脾中的含量均下降；阳性对照组能够显著的提高免疫抑制小鼠脾中 两种酶的活性；与阳性对照组相同，给药组也能提高两种酶的活性，且具有剂量 依赖性，无论是FB-E还是FB-P，在高剂量时均具有显著性差异。
2.发明物的抗炎镇痛作用研究
2.1复方参草颗粒抗炎镇痛作用研究
2.1.1分组及给药小鼠按体重及性别将其随机分为4组，每组10只，雌雄 各半，灌胃给药，给药量如表2-1。
表2-1各组给药剂量
2.1.2模型制备
各组给药前先用自制足体积测量器测量每只小鼠左后肢体积(以左后足关节 为界)，后用微量注射器向小鼠左后肢足跖部皮下注射2.5％福尔马林溶液20μL， 注射后立即将小鼠置于一悬挂在铁架台上的烧杯内(记录下注射时间)，烧杯下 方置一倾斜30°左右的镜子，从镜面观察60min内小鼠足部在0-10min(Ⅰ相) 和10-60min(Ⅱ相)中疼痛反应并评分。
评分方法如下：舔、咬、抖足-3分；提足-2分；轻触足底但不负重、行走 时跛行-1分；正常负重、走动自如-0分。
表2-2福尔马林致小鼠疼痛反应评分结果
注：与模型组比较*P＜0.05
2.1.3实验方法
造模成功24h后用自制足体积测量器测量每只小鼠左后肢体积，计算足肿 胀率(结果见表2-3)，持续饲养一周后，各组按药物与剂量灌胃给药三天，2次 /d，在第三天给药1h后，按“2.1.2”项下造模，24h后用自制足体积测量器测量 每只小鼠右后肢体积，记录小鼠足肿胀度并计算右后足肿胀率及镇痛抑制率。抑 制率＞30％并具有统计学意义，可认为具有抗炎作用。
表2-3福尔马林小鼠致足肿胀率结果
注：与模型组比较*P＜0.05
抑制率(％)＝(模型组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/模型组平均肿胀度 ×100％
2.1.4福尔马林致小鼠疼痛对小鼠体内PGE2含量的影响
将“2.1.2”项下小鼠右踝关节处剪下炎足，称重，剥皮后浸于盛有3mL生 理盐水的5mL离心管中浸泡1h(生理盐水4℃预冷)，取出炎足，浸出液离心， 取上清液2mL，加2mL0.15mol/LKOH-甲醇溶液，混匀，50℃水浴20min稍冷后， 紫外分光光度计278nm下测定PGE2含量，比较各组间差异。
PGE2含量(μg/g)＝(E278×13.13×Vt×D)/W。[注：Vt＝PGE2浸泡液总体 积，D＝稀释倍数，W＝右下肢重量(g)，E278＝278nm处的吸收值。]
PGE2抑制率(％)＝(模型组PGE2含量-给药组PGE2含量)/模型组PGE2含量×100％
表2-4福尔马林致小鼠疼痛对体内PGE2含量的影响
注：与模型组比较*P＜0.05，与空白组比较：△P＜0.05
统计学处理：统计学方法结果采用完全随机设计资料的方差分析方法 (One-Way ANOVA)进行分析，应用SPSS15.0统计软件协助统计。当各组方 差齐时用LSD法进行均数间的两两比较；当各组方差不齐时用Dunnett’sC法进 行均数间的两两比较。
2.1.5复方参草颗粒HPLC指纹图谱与镇痛作用相关分析
结合复方参草颗粒与白芍总苷提取物中的1、3、4号峰的峰面积(表2-5) 与福尔马林致小鼠疼痛足肿胀抑制率、PGE2抑制率、冰醋酸致大鼠扭体反应抑 制率，利用双变量相关分析进行处理。得到Pearson相关系数如表2-6.
表2-5白芍总苷提取物及复方参草颗粒相关峰面积
表2-6双变量Pearson相关系数
由表2-5，2-6中相关系数可以看出，复方参草颗粒中1、2、3、4、5号峰 均来源于白芍药材与肿胀抑制率和PEG2抑制率的相关系数都为正，表明白芍药 材与镇痛药效存在着较强的相关性，以此可以推论白芍是复方参草颗粒中主要的 镇痛药。
2.2冰醋酸致大鼠扭体反应
2.2.1分组及给药
大鼠按体重将其随机分为14组，每组10只，灌胃给药，给药量如表3-1。
表3-1各组给药剂量
2.2.2实验方法
大鼠随机分6组，每组10只，各组按给药剂量连续灌胃3天，2次/d，于第 三天给药40min后模型组注射生理盐水15m L/kg，其余各组腹腔注射0.7％冰醋 酸15m L/kg，以注射后20min内发生扭体总数作为疼痛定量指标。观察扭体反 应后于大鼠眼球后静脉丛采血，离心15min(3000r/min)，取出血清并冻存。 抑制率(％)＝(模型组扭体次数－给药组扭体次数)/模型组扭体次数×100％
2.2.3醋酸扭体法致痛对大鼠体内c AMP含量的影响
c AMP含量的影响各组按照试剂盒操作标准，操作方法如下：(1)取出试剂盒， 于室温(20-25℃)放置15-30分钟。实验过程应在室温(20-25℃)内进行。(2) 取出酶标板，按照标准品的次序分别加入100μL的标准品溶液于空白微孔中。(3) 空白微孔中加入100μL的样品，空白对照加入100μL的蒸馏水；(4)在各孔中 加入50μL的酶标记溶液；(不含空白对照孔)；(5)将酶标板用封口胶密封后， 37℃孵育反应1小时；(在孵育箱中保持稳定的是读和温度)；(6)充分清洗酶标 板3-5次，保持各孔有充足的水压；(浓缩洗涤液以1:100的比例与蒸馏水稀释)； (7)酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干；(8)各孔加入显色剂A、B液各50μL； (不含空白对照孔)；(9)20-25℃下避光反应15分钟；(10)各孔加入50μL终 止液，终止反应。
结果判断：(1)30分钟内在波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；(2) 以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；(3)根据样品的 OD值查找对应的浓度范围；
2.2.4醋酸扭体法致痛对大鼠体内c GMP含量的影响
各组按照试剂盒操作标准，操作方法如下：(1)取出试剂盒，于室温(20-25℃) 放置15-30分钟。实验过程应在室温(20-25℃)内进行。(2)取出酶标板，按 照标准品的次序分别加入100μL的标准品溶液于空白微孔中。(3)空白微孔中 加入100μL的样品，空白对照加入100μL的蒸馏水。(4)在各孔中加入50μL的 酶标记溶液；(不含空白对照孔)。(5)将酶标板用封口胶密封后，37℃孵育反应 1小时；(在孵育箱中保持稳定的是读和温度)。(6)充分清洗酶标板3-5次，保 持各孔有充足的水压；(浓缩洗涤液以1:100的比例与蒸馏水稀释)。(7)酶标板 洗涤后用吸水纸彻底拍干。(8)各孔加入显色剂A、B液各50μL；(不含空白 对照孔)；(9)20-25℃下避光反应15分钟；(10)各孔加入50μL终止液，终止 反应。
结果判断：(1)30分钟内在波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；(2) 以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；(3)根据样品的 OD值查找对应的浓度范围。
2.2.5醋酸扭体法致痛对大鼠体内PGE2含量的影响
各组按照试剂盒操作标准，操作方法如下：(1)取出试剂盒，于室温(20-25℃) 放置15-30分钟。实验过程应在室温(20-25℃)内进行；(2)取出酶标板，按 照标准品的次序分别加入50μL的标准品溶液于空白微孔中；(3)空白微孔中加 入50μL的样品，空白对照加入50μL的蒸馏水；(4)在各孔中加入100μL的酶 标记溶液；(不含空白对照孔)；(5)将酶标板用封口胶密封后，37℃孵育反应1 小时；(在孵育箱中保持稳定的是读和温度)；(6)充分清洗酶标板3-5次，保持 各孔有充足的水压；(浓缩洗涤液以1:100的比例与蒸馏水稀释)；(7)酶标板洗 涤后用吸水纸彻底拍干；(8)各孔加入显色剂A、B液各50μL；(不含空白对照 孔)(9)20-25℃下避光反应15分钟；(10)各孔加入50μL终止液，终止反应。 结果判断：(1)30分钟内在波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；(2)以 OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；(3)根据样品的OD 值查找对应的浓度范围。
2.2.6统计学处理
统计学方法结果采用完全随机设计资料的方差分析方法(One-Way ANOVA) 进行分析，应用SPSS15.0统计软件协助统计。当各组方差齐时用LSD法进行均 数间的两两比较；当各组方差不齐时用Dunnett’s C法进行均数间的两两比较。
2.2.7实验结果与分析
福尔马林致小鼠疼痛反应(预防性给药)评分结果见表3-2。福尔马林小鼠 致痛(预防性给药)各阶段足肿胀率见表3-3，预防性给药各组肿胀抑制率见表 3-4，福尔马林致小鼠疼痛对体内PGE2含量的影响表3-5，福尔马林小鼠致痛(治 疗性给药)各组痊愈时间见表3-6。
表3-2福尔马林致小鼠疼痛反应(预防性给药)评分结果
注：与模型组比较*P＜0.05
由表3-2可得，在预防性给药阶段的给药前致痛Ⅰ相反应中，各组均与模型 组有显著性差异，且与给药后Ⅰ相反应相比较亦具有显著性差异，表明其对福尔 马林引发的小鼠疼痛Ⅰ相反应有抑制作用。在预防性给药阶段给药前致痛Ⅱ相反 应中，各组均与模型组有显著性差异，且与给药后Ⅱ相反应相比较亦具有显著性 差异，表明其对福尔马林引发的小鼠疼痛Ⅱ相反应有抑制作用。
3-3福尔马林小鼠致痛(预防性给药)各阶段足肿胀率
注：与模型组比较*P＜0.05
表3-3中，与模型组相比，在治疗性给药阶段24h后，各组左后足肿胀率与 模型组相比并无显著性差异，在预防性给药阶段与模型组相比却出现了显著性差 异，这表明由于预防性给药的作用，使福尔马林再次刺激足底所引发的肿胀率明 显降低，各组均有预防福尔马林刺激引起足部肿胀的作用；各个组内间在两个阶 段间肿胀率也出现了显著性差异，这表明各组在福尔马林对小鼠致痛的实验中均 可抑制由福尔马林刺激造成的足肿胀。
表3-4预防性给药各组肿胀抑制率
注：与模型组比较*P＜0.05
表3-4的结果表明，在预防性给药阶段，给药组24h后右后足的平均肿胀度 明显低于模型组，各组足肿胀度抑制率均可达到50％以上，说明各组均有抑制福 尔马林刺激引发足肿胀的功效，也说明各给药组均能抑制福尔马林刺激而引发的 炎性介质的升高。
表3-5福尔马林致小鼠疼痛对体内PGE2含量的影响
注：与模型组比较*P＜0.05，与空白组比较，△P＜0.05
由表3-5表明，与空白组相比，模型组PGE2含量明显升高，说明本实验引 发的小鼠足部炎性疼痛可诱发体内PGE2含量的升高，除白芍总苷组，其余各组 PGE2含量均与空白组无显著性差异，说明这些给药组在福尔马林引发小鼠足部 炎性疼痛反应中均能使PGE2含量恢复到正常值，白芍总苷组PGE2含量较空白 组明显降低，说明白芍总苷组不仅能使福尔马林刺激小鼠引发炎性疼痛所导致 PGE2含量下降，并且低于正常水平；与模型组相比，各组的PGE2含量均与模型 组有显著性差异，表明其在实验中可明显抑制PGE2含量升高，对PGE2所引发 的炎性疼痛有显著的抑制作用。
表3-6福尔马林小鼠致痛(治疗性给药)各组痊愈时间
由表3-6可看出，在治疗性给药阶段，与模型组不给予药物治疗自然恢复的 时间相比，各给药组对小鼠给予药物治疗恢复的时间显著缩短，气滞胃痛、阿司 匹林、可待因三组的恢复时间可达到模型组的1/2，表明各给药组对福尔马林注 射小鼠足底引发的炎性疼痛具有显著的治疗效果。
2.3冰醋酸致大鼠扭体反应
冰醋酸致大鼠扭体反应扭体次数和抑制率结果见表3-7，冰醋酸致大鼠疼痛 对c AMP的影响见表3-8，冰醋酸致大鼠疼痛对c GMP的影响见表3-9，冰醋酸 致大鼠疼痛对PGE2的影响见表3-10。
表3-7冰醋酸致大鼠扭体反应
注：与模型组比较*P＜0.05
表3-7可知，各给药组在冰醋酸致大鼠扭体反应中扭体均数均低于模型组扭 体均数，与模型组比较，组间均有显著性差异，各组扭体抑制率均大于30％，白 芍总苷组抑制率大于50％，可待因组抑制率可达到70％表明气滞胃痛颗粒复方 及白芍总苷可抑制冰醋酸引发的大鼠扭体反应。
表3-8冰醋酸致大鼠疼痛对cAMP
注：与模型组比较*P＜0.05
表3-8中，与空白组比较，模型组c AMP含量降低，给药各组c AMP含量 与空白组无显著性差异，与模型组比较，给药组与模型组c AMP含量有显著性 差异，表明冰醋酸致大鼠疼痛使大鼠体内cAMP含量下降，给药组具有抑制c AMP含量下降的作用。
表3-9冰醋酸致大鼠疼痛对cGMP的影响
注：与模型组比较*P＜0.05
表3-9中，与空白组比较，模型组在腹腔注射冰醋酸后c GMP含量显著下 降，表明冰醋酸致大鼠疼痛可使c GMP含量降低，与模型组相比，各组与模型 组比较均无显著性差异且cGMP含量接近模型组含量，表明在冰醋酸致大鼠疼痛 反应中并未作用在c GMP靶点上。
表3-10冰醋酸致大鼠疼痛对PGE2的影响
注：与模型组比较*P＜0.05
表3-10中，与空白组比较，模型组PGE2含量显著升高，表明在冰醋酸致大 鼠疼痛反应实验中体内内源性物质PGE2含量升高，与模型组比较，阿司匹林组 与模型组无显著性差异，表明阿司匹林组在疼痛反应中并未作用在PGE2靶点上， 其它各组与模型组比较均存在显著性差异，表明各组通过抑制PGE2含量升高， 使其含量恢复正常水平来抑制疼痛。
以下通过实施例来进一步说明本发明药物的制备方法。
实施例1，本发明片剂的制备
1)按如下重量份称取各原料药，延胡索180份，白芍240份，枳实180份， 鸡内金180份，莱菔子180份，甘草150份，莪术150份，夏枯草240份，麦芽 240份。
取处方量的延胡索、白芍和莪术进行挥发油提取后残渣备用。
2)枳实、鸡内金、莱菔子、甘草、莪术、夏枯草、麦芽及挥发油提取后的 延胡索、白芍和莪术残渣一起加10～12倍量水，水煎煮三次，每次1～2小时， 滤过，合并滤液，在60℃时测量，浓缩至相对密度为1.08～1.10，冷却，浓缩， 蒸干。
3)滤液浓缩蒸干后，粉碎，加入硬脂酸镁，混匀，压片。
实施例2，本发明胶囊剂的制备
1)按如下重量份称取各原料药，延胡索180份，白芍240份，枳实180份， 鸡内金180份，莱菔子180份，甘草150份，莪术150份，夏枯草240份，麦芽 240份。
取处方量的延胡索、白芍和莪术进行挥发油提取后残渣备用。
2)枳实、鸡内金、莱菔子、甘草、莪术、夏枯草、麦芽及挥发油提取后的 延胡索、白芍和莪术残渣一起加10～12倍量水，水煎煮三次，每次1～2小时， 滤过，合并滤液，在60℃时测量，浓缩至相对密度为1.08～1.10，冷却，浓缩， 蒸干。
3)滤液浓缩蒸干后，粉碎，加入硬脂酸镁，混匀，用70％乙醇制粒，干燥， 装入胶囊。
实施例3，本发明颗粒剂的制备
1)按如下重量份称取各原料药，延胡索180份，白芍240份，枳实180份， 鸡内金180份，莱菔子180份，甘草150份，莪术150份，夏枯草240份，麦芽 240份。
取处方量的延胡索、白芍和莪术进行挥发油提取后残渣备用。
2)枳实、鸡内金、莱菔子、甘草、莪术、夏枯草、麦芽及挥发油提取后的 延胡索、白芍和莪术残渣一起加10～12倍量水，水煎煮三次，每次1～2小时， 滤过，合并滤液，在60℃时测量，浓缩至相对密度为1.08～1.10，冷却，浓缩， 蒸干。
3)滤液浓缩蒸干后，粉碎，加入硬脂酸镁，混匀，加入糖粉制粒，制成颗 粒剂。
实施例4，本发明颗粒剂的制备
1)按如下重量份称取各原料药，延胡索160份，白芍240份，枳实160份， 鸡内金160份，莱菔子160份，甘草120份，莪术120份，夏枯草200份，麦芽 200份。
取处方量的延胡索、白芍和莪术进行挥发油提取后残渣备用。
以下步骤同实例2
实施例5，本发明颗粒剂的制备
1)按如下重量份称取各原料药，延胡索180份，白芍200份，枳实180份， 鸡内金180份，莱菔子160份，甘草140份，莪术140份，夏枯草220份，麦芽 220份。
取处方量的延胡索、白芍和莪术进行挥发油提取后残渣备用。
以下步骤同实例2
实施例6，本发明颗粒剂的制备
1)按如下重量份称取各原料药，延胡索160份，白芍220份，枳实160份， 鸡内金160份，莱菔子150份，甘草120份，莪术120份，夏枯草200份，麦芽 200份。
取处方量的延胡索、白芍和莪术进行挥发油提取后残渣备用。
以下步骤同实例2。