本发明涉及一种疫苗稀释剂及其制备方法和用途，该稀释剂是一种溶液，用它稀释疫苗后注射动物，可促进疫苗诱导的特异性抗体的产生。
背景技术：
：动物传染病可造成畜禽大量死亡，严重危害养殖业的健康发展，是引起养殖业经济损失的一类重要动物疾病。为减少传染病的发病率和死亡率，需要对动物注射疫苗，使动物产生特异性保护性抗体。但近年来常有报道，动物注射疫苗后体内检测不到足够水平的抗体，无法阻止疾病的发生，给养殖户带来严重的经济损失。例如，王建等人给断奶仔猪注射繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗，70天后用野毒攻毒，保护率仅为63.6％(1)；曹振山等人检测了206份猪血样中的猪瘟抗体，仅有136份血样达到抗体合格水平，合格率只有66.0％(2)；金立忠和万春艳报道了2017年8月的扶余市在注射疫苗后猪群发生猪瘟的情况(3)。因此，提高疫苗的注射效果，有效预防传染病的发生在养殖业具有重要意义。目前用于预防动物传染病的疫苗主要有弱毒疫苗和灭活疫苗两大类。冻干弱毒疫苗由于注射后抗体的持续时间长而在养殖业被广泛使用，如猪伪狂犬弱毒疫苗、传染性法氏囊病弱毒冻干疫苗、猪瘟冻干弱毒疫苗、新城疫ⅳ系弱毒疫苗、鸡新城疫-传染性支气管炎二联弱毒疫苗等。这类疫苗是一种粉末状固体，无法直接给动物接种，需要用稀释液稀释后才能使用。常用的疫苗稀释剂有氢氧化铝铝胶生理盐水溶液和生理盐水。铝胶溶液的缺点是仅仅提高igg1的产生而不能促进igg2a的产生(4,5)、在注射部位局部反应大(6)和冰冻保破坏了胶体结构使其丧失佐剂功能；生理盐水稀释剂无免疫增强作用；也有报道含人参皂甙的水溶稀释弱毒疫苗后免疫动物可以提高疫苗免疫效果(7)。该文中告知：人参皂苷(gsls)和硫柳汞(ts)对小鼠伪狂犬病毒稀释弱毒疫苗的辅助作用。与单独用小鼠伪狂犬病毒免疫的组相比，人参皂苷和/或硫柳汞的共同接种(人参皂苷6μg/100μl；硫柳汞1μg/100μl)具有较高的抗体免疫效果。且当与gsls-ts一起施用时，能够增强伪狂犬病毒疫苗的血清特异性抗体(igg1和igg2a)。参考文献：(1)王建，齐永新，李凯航，葛菲菲，刘佩红，袁世山.三种猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果评价，动物医学进展，2012,33(4)：107-113；(2)曹振山，陈静，马慧玲，孔祥华，王士荣，孙胜福.山东省2016年猪瘟抗体监测与分析，中国畜禽种业，2017.8,7；(3)金立忠，万春艳.兔化弱毒苗免疫猪群发生猪瘟的诊断报告，畜牧兽医，2017(7),246；(4)johnccandalanrc.adjuvants-aclassificationandreviewoftheirmodesofaction.vaccine,1997:248-256(疫苗佐剂：作用模式和分类.疫苗杂志,1997:248-256)；(5)hogeneschh.mechanismsofstimulationoftheimmuneresponsebyaluminumadjuvants.vaccine,2002,20:34–39(铝胶座机刺激免疫反应的机制，疫苗杂志,2002,20:34–39)；(6)eickhoff,t.c.,myers,m.aluminuminvaccine(conferencereport).vaccine2002,20,s1-s4(疫苗中的铝(会议报告).疫苗杂志，2002,20,s1-s4)；(7)nijx,bisc,xuw,zhangcr,luys,zhailj,hush.improvedimmuneresponsetoanattenuatedpseudorabiesvirusvaccinebyginsengstem-leafsaponins(gsls)incombinationwiththimerosal(ts).antiviralresearch,2016:92-98(人参茎叶皂苷和硫柳汞配伍增强机体对伪狂犬弱毒疫苗的免疫反应.抗病毒研究,2016:92-98)。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种可以提高抗体生成的疫苗稀释剂及其制备方法和用途。为了解决上述技术问题，本发明提供一种促进抗体生成的疫苗稀释剂，每100毫升稀释剂中含人参皂苷0.5～50毫克和亚硒酸钠0.9毫克～200毫克，余量为生理盐水。作为本发明的促进抗体生成的疫苗稀释剂的改进：每100毫升稀释剂中含人参皂苷10毫克和亚硒酸钠75毫克，余量为生理盐水。本发明还同时提供了上述促进抗体生成的疫苗稀释剂的制备方法：在0.5～50毫克人参皂苷和0.9毫克～200毫克亚硒酸钠中加入生理盐水定容至100毫升，再用孔径为22μm的薄膜过滤除菌，得促进抗体生成的疫苗稀释剂。即，将人参皂苷和亚硒酸钠溶解于生理盐水，浓度调整至每100ml溶液含人参皂苷0.5～50mg和亚硒酸钠0.5～200mg，经过0.22μm滤膜过滤除菌，即得。本发明还同时提供了上述促进抗体生成的疫苗稀释剂的用途：促进疫苗诱导的抗体(包括igg1和igg2a等)生成。具体为：将粉状疫苗利用该稀释剂配制成疫苗溶液接种动物以促进疫苗诱导的抗体生成。本发明所述的人参皂苷为从植物人参(panaxginsengc.a.meyer)根或者茎叶中提取的皂苷成分。生理盐水是含0.85～0.9％(质量％)氯化钠的水溶液，和哺乳动物血浆是等渗的；此为常规技术。本发明的稀释剂不仅能提高igg1抗体的产生而且还能促进igg2a抗体的产生、局部刺激性小、可以冰冻长期保存而不影响效果。综上所述，本发明用人参皂甙和亚硒酸钠配伍(gs-se)稀释疫苗显著提高了机体产生抗体的水平，不仅能提高igg1抗体的产生而且还能促进igg2a抗体的产生，局部刺激性小，可以冰冻长期保存而不影响效果。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1为人参皂苷(gs)、亚硒酸钠(se)和gs-se不同稀释液对小鼠注射aprv弱毒苗后抗体水平影响对比图(上标字母不同表示组间有显著性差异，p<0.05)；图2是gs-se和氢氧化铝两种稀释剂对小鼠注射aprv弱毒苗后抗体亚类水平影响对比图(上标字母不同表示组间有显著性差异，p<0.05)；图3是不同比例人参皂苷和亚硒酸钠配伍对igg1和igg2a产生的影响对比图(上标字母不同表示组间有显著性差异，p<0.05)；图4是人参皂苷和不同含硒化合物配伍对igg1和igg2a产生的影响对比图(上标字母不同表示组间有显著性差异，p<0.05)；图5是gs-se和氢氧化铝两种稀释剂冻融前后对小鼠注射模式抗原卵清白蛋白后抗体水平影响对比图(上标字母不同表示组间有显著性差异，p<0.05)；图6是人参皂苷-亚硒酸钠(gs-se)稀释液和商品疫苗专用稀释液对猪注射伪狂犬弱毒苗后抗体水平影响对比图(上标字母不同表示组间有显著性差异，p<0.05)；图7是人参皂苷(gs)、亚硒酸钠(se)和gs-se不同稀释液对鸡免疫传染性法氏囊病疫苗弱毒苗后抗体水平影响对比图(上标字母不同表示组间有显著性差异，p<0.05)。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1、含人参皂苷和亚硒酸钠的溶液稀释疫苗显著增强了小鼠的抗体产生一、材料和方法1.试剂亚硒酸钠(se)，生产批号：1002176793，为sigma-aldrich公司产品；氯化钠注射液，生产批号：1610110113，为浙江都邦药业股份有限公司产品；猪伪狂犬病病毒gb抗体检测试剂盒，生产批号：04-04573-06，为北京爱德士元亨生物科技有限公司产品；人参皂苷(gs)，生产批号20160225，为吉林省宏久生物科技股份有限公司产品，总皂苷含量为大于90％，含rb1(25.90％)，rb2(2.68％)，rc(7.88％)，rd(10.10％)，re(12.48％)和rg1(1.96％)。2.含人参皂苷和亚硒酸钠溶液的配制甲液配制：称取一定量的人参皂苷充分溶解于生理盐水中，调整溶液浓度至20mg/100ml(w/v)，4℃保存备用。乙液配制：称取一定量的亚硒酸钠充分溶解于生理盐水中，调整溶液浓度至150mg/100ml(w/v)，4℃保存备用。疫苗稀释液(gs-se)的配制：等体积合并甲、乙两液，再过0.22μm滤膜过滤除菌，即得疫苗稀释液。每100ml的该疫苗稀释液中含人参皂甙10mg和亚硒酸钠75mg(即，每200ml的该疫苗稀释液中含人参皂甙20mg和亚硒酸钠150mg)。3.疫苗伪狂犬病活疫苗(aprv)(bartha-k61株，生产批号：1951080b)，为勃林格殷格翰动物保健有限公司产品。4.动物分组和疫苗注射将30只4周龄icr雌性小鼠随机分成5组，每组6只。用以下溶液稀释伪狂犬弱毒疫苗：生理盐水(200μl)、人参皂苷溶液(浓度为20μg/200μl)、亚硒酸钠溶液(浓度为150μg/200μl)、人参皂苷-亚硒酸钠溶液(gs-se)(gs：20μg+se：150μg/200μl)。各组的处理按照表1，每只小鼠1次肌肉注射伪狂犬病弱毒疫苗(103tcid50)，体积为200μl(浓度为病毒量103tcid50/200μl)。备注：上述溶液均过0.22μm滤膜过滤除菌；以下案例同此要求。表1、小鼠分组及处理组别小鼠一次注射含gs(μg)一次注射含se(μg)aprv(103tcid50)1600-2600200μl36200200μl460150200μl5620150200μl5.采样于免疫后第1、2周，眼眶采血约0.4ml，4000rpm，离心10分钟，分离血清，-80℃保存。6.抗体检测用猪伪狂犬病毒gb抗体检测试剂盒检测血清伪狂犬病gb抗体水平，具体步骤如下：(1)将所有从冰箱取出的试剂恢复至室温。(2)在抗原包被板中加入100μl经2倍稀释的阴性对照、阳性对照和血清样品。(3)在18～26℃孵育60分钟。(4)用洗涤溶液洗涤微孔3～5次。(5)每孔加入100μl酶标抗体，在18～26℃条件下孵育20分钟。(5)重复步骤(4)。(6)每孔加入100μltmb底物，在18～26℃条件下孵育15分钟。(7)每孔加入50μl终止液终止反应，在450nm下读取吸光值。8.统计分析抗体水平用平均值士标准差(mean士s.d.)，采用spss(l7.0)统计软件中单因素方差分析(one-wayanova)，并用duncan法进行组间多重比较，p<0.05即判定为差异性显著，p<0.01为差异极显著，microsoftofficeexcel2007软件进行绘图。二、结果由图1可知，人参皂苷(gs)对gb抗体产生有显著促进作用(p<0.05)，亚硒酸钠(se)则无；人参皂苷与亚硒酸钠配伍(gs-se)对抗体的促进作用显著大于人参皂苷单独应用时的作用(p<0.05)，注射局部未见刺激反应。表明人参皂苷与亚硒酸钠配伍可产生更强的抗体增强功能。实施例2、含人参皂苷和亚硒酸钠的疫苗稀释剂可促进igg1和igg2a，而铝胶稀释剂不能提高igg2a的产生一、材料和方法1.试剂亚硒酸钠(se)，生产批号：1002176793，为sigma-aldrich公司产品；氯化钠注射液，生产批号：1610110113，为浙江都邦药业股份有限公司产品；人参皂苷(gs)，生产批号20160225，为吉林省宏久生物科技股份有限公司产品，总皂苷含量为大于90％，含rb1(25.90％)，rb2(2.68％)，rc(7.88％)，rd(10.10％)，re(12.48％)和rg1(1.96％)；rpmi1640细胞培养基，批号：nzf1656，购自赛默飞世尔生化制品(北京)有限公司；hrp标记山羊抗小鼠iggl、igg2a抗体，批号：b16020601，为santacruz生物科技有限公司产品。20％氢氧化铝铝胶生理盐水，批号：1607006，为齐鲁动物保健品有限公司产品；模式抗原卵清白蛋白(ova)购自sigma公司。ova通过内毒素去除柱(pierce公司)去除两次，除去内毒素，然后用bca试剂盒法定量(pierce公司)。2.含人参皂苷和亚硒酸钠溶液的配制甲液配制:称取一定量的人参皂苷充分溶解于用生理盐水中，调整溶液浓度至20mg/100ml(w/v)，4℃保存备用。乙液配制：称取一定量的亚硒酸钠充分溶解于用生理盐水中，调整溶液浓度至150mg/100ml(w/v)，4℃保存备用。疫苗稀释液(gs-se)的配制：等体积合并甲、乙两液，再过0.22μm滤膜过滤除菌，即得疫苗稀释液。每100ml的该疫苗稀释液中含人参皂甙10mg和亚硒酸钠75mg。3.动物分组及处理将24只icr小鼠随机分成4组，每组6只，各处理见表2。组1：用gs-se稀释剂(终浓度为gs：20μg+se150μg/200μl)稀释抗原ova(终浓度为10μg/200μl)，2次肌肉注射ova，间隔2周，每次ova10μg，体积200μl；组2：用氢氧化铝铝胶(终浓度为10％)稀释ova(终浓度为10μg/200μl)，注射方法同组1；组3：用生理盐水稀释ova(终浓度为10μg/200μl)，注射方法同组1和组2；组4：用生理盐水肌注小鼠，注射方法同前。表2.小鼠分组及处理(每只小鼠一次注射量)组别小鼠稀释剂ova16gs-se(含gs20μg+se150μg)10μg2610％氢氧化铝10μg36生理盐水10μg46生理盐水-4.血样采集于二免疫后第2周，眼眶采血约0.4ml，4000rpm，离心10分钟，分离血清，-80℃保存。5.ova特异性igg亚类的检测检测步骤如下：用5μg/mlova(溶于碳酸盐缓冲液，ph9.6)包被96孔聚酯板，置于4℃过夜。1)、用pbst(含0.05％吐温-20的pbs)洗3次。2)、用含5％小牛血清的pbs封闭96孔板1小时，pbst清洗3次。3)、向孔内加入100μl血清(一免后的血清1：100稀释；二免后血清1：1000稀释)。4)、将含上述血清的96孔板孵育1小时，再次用pbst洗三次。5)、加入生物素(biotin)标记的二抗igg1,igg2a(1:1000)，孵育1小时，用pbst清洗3次。6)、加入抗生物素标记的辣根过氧化梅(1：5000)，孵育30分钟，用pbst洗三次。7)、加入100μltmb底物(exalphabiologicals,inc)显色10-20分钟。8)、最后用50μl的2mh2so4终止显色反应，用酶标仪上在450nm处读取od值。二、结果图2表示各组小鼠免疫后的血清抗体igg1和igg2a水平。三组中，gs-se+抗原组的igg1和igg2a均显著高于生理盐水+抗原组；铝胶+抗原组中只有igg1显著高于生理盐水+抗原组(p<0.05)，而igg2a的水平和生理盐水+抗原组比较无显著性差异。igg2a是代表细胞免疫的一个参数。本实验中gs-se+抗原组的igg2a显著高于生理盐水+抗原组，而铝胶+抗原组中igg2a和生理盐水+抗原组比较无显著差异，说明gs-se对细胞免疫有促进作用而铝胶则无。铝胶+抗原组可见注射部位有肿胀等局部反应，而其余各组均未见局部反应。实施例3、不同比例人参皂苷和亚硒酸钠稀释剂对igg1和igg2a的促进作用一、材料和方法1.试剂亚硒酸钠(se)，生产批号：1002176793，为sigma-aldrich公司产品；氯化钠注射液，生产批号：1610110113，为浙江都邦药业股份有限公司产品；人参皂苷(gs)，生产批号20160225，为吉林省宏久生物科技股份有限公司产品，总皂苷含量为大于90％，含rb1(25.90％)，rb2(2.68％)，rc(7.88％)，rd(10.10％)，re(12.48％)和rg1(1.96％)；rpmi1640细胞培养基，批号：nzf1656，购自赛默飞世尔生化制品(北京)有限公司；hrp标记山羊抗小鼠iggl、igg2a抗体，批号：b16020601，为santacruz生物科技有限公司产品。20％氢氧化铝铝胶生理盐水，批号：1607006，为齐鲁动物保健品有限公司产品；模式抗原卵清白蛋白(ova)购自sigma公司。ova通过内毒素去除柱(pierce公司)去除两次，除去内毒素，然后用bca试剂盒法定量(pierce公司)。2.含人参皂苷和亚硒酸钠溶液的配制甲液配制:称取一定量的人参皂苷充分溶解于用生理盐水中，调整溶液浓度至20mg/100ml(w/v)，4℃保存备用。乙液配制：称取一定量的亚硒酸钠充分溶解于用生理盐水中，调整溶液浓度至200mg/100ml(w/v)、150mg/100ml(w/v)、100mg/100ml(w/v)、50mg/100ml(w/v)和1.6mg/100ml(w/v)，4℃保存备用。疫苗稀释液(gs-se)的配制：等体积合并甲、乙两液，得含人参皂苷和亚硒酸钠不同比例混合液，分别过0.22μm滤膜过滤除菌，即5种不同的疫苗稀释液：稀释液1(每100ml含gs10mg+se100mg)、稀释液2(每100ml含gs10mg+se75mg)、稀释液3(每100ml含gs10mg+se50mg)、稀释液4(每100ml含gs10mg+se25mg)、稀释液5(每100ml含gs10mg+se0.8mg)。3.动物分组及处理将42只icr小鼠随机分成7组，每组6只，各处理见表3。分别用不同的稀释液稀释抗原ova。每只小鼠2次肌肉注射ova，间隔2周，每次注射ova10μg，体积200μl。表3.小鼠分组及处理(每只小鼠一次注射量)组别小鼠稀释剂(每200μl成分含量)抗原ova16gs-se(gs20μg+se200μg)10μg26gs-se(gs20μg+se150μg)10μg36gs-se(gs20μg+se100μg)10μg46gs-se(gs20μg+se50μg)10μg56gs-se(gs20μg+se1.6μg)10μg66氢氧化铝(10％)10μg76生理盐水10μg4.血样采集于二免疫后第2周，眼眶采血约0.4ml，4000rpm，离心10分钟，分离血清，-80℃保存。5.ova特异性igg亚类的检测检测步骤如下：1)、用5μg/mlova(溶于碳酸盐缓冲液，ph9.6)包被96孔聚酯板，置于4℃过夜。2)、用pbst(含0.05％吐温-20的pbs)洗3次。3)、用含5％小牛血清的pbs封闭96孔板1小时，pbst清洗3次。4)、向孔内加入100μl血清(一免后的血清1：100稀释；二免后血清1：1000稀释)。5)、将含上述血清的96孔板孵育1小时，再次用pbst洗三次。6)、加入生物素(biotin)标记的二抗igg1,igg2a(1:1000)，孵育1小时，用pbst清洗3次。7)、加入抗生物素标记的辣根过氧化梅(1：5000)，孵育30分钟，用pbst洗三次。8)、加入100μltmb底物(exalphabiologicals,inc)显色10-20分钟。9)、最后用50μl的2mh2so4终止显色反应，用酶标仪上在450nm处读取od值。二、结果图3表示各组小鼠免疫后的血清抗体igg1和igg2a水平。稀释剂1～5(gs-se)组的igg1和igg2a水平均高于生理盐水组，以稀释剂2组抗体水平为最高；而氢氧化铝组仅有igg1显著高于生理盐水组，igg2a的水平和生理盐水组比较无显著性差异。因此，gs-se可促进igg和igg2a的产生，而氢氧化铝对igg1的产生有促进作用，对igg2a的产生无作用。氢氧化铝组可见注射部位有肿胀等局部反应，而其余各组均未见局部反应。实施例4：人参皂苷和不同硒化合物配合对igg1和igg2a的促进作用一、材料和方法1.试剂亚硒酸钠(se)，为sigma-aldrich公司产品；l-甲基硒代半胱氨酸，为深圳思美生物科技有限公司产品；蛋氨酸硒，为武汉远成共创科技有限公司产品；氯化钠注射液，生产批号：1610110113，为浙江都邦药业股份有限公司产品；人参皂苷(gs)，生产批号20160225，为吉林省宏久生物科技股份有限公司产品，总皂苷含量为大于90％，含rb1(25.90％)，rb2(2.68％)，rc(7.88％)，rd(10.10％)，re(12.48％)和rg1(1.96％)；rpmi1640细胞培养基，批号：nzf1656，购自赛默飞世尔生化制品(北京)有限公司；hrp标记山羊抗小鼠iggl、igg2a抗体，批号：b16020601，为santacruz生物科技有限公司产品。20％氢氧化铝铝胶生理盐水，批号：1607006，为齐鲁动物保健品有限公司产品；模式抗原卵清白蛋白(ova)购自sigma公司。ova通过内毒素去除柱(pierce公司)去除两次，除去内毒素，然后用bca试剂盒法定量(pierce公司)。2.含人参皂苷和含硒化合物溶液的配制甲液配制:称取一定量的人参皂苷充分溶解于用生理盐水中，调整溶液浓度至20mg/100ml(w/v)，4℃保存备用。含硒化合物母液配制：分别将一定量的亚硒酸钠、l-甲基硒代半谷氨酸和蛋氨酸硒充分溶解于用生理盐水中，调整溶液浓度至150mg/100ml(w/v)，4℃保存备用。疫苗稀释液的配制：将每一种含硒化合物母液和甲液等体积合并，分别过0.22μm滤膜过滤除菌，即三种不同的疫苗稀释液：稀释液1(每100ml含gs10mg+se75mg)、稀释液2(每100ml含gs10mg+l-甲基硒代半谷氨酸75mg)、稀释液3(每100ml含gs10mg+蛋氨酸硒75mg)。3.动物分组及处理将30只icr小鼠随机分成5组，每组6只，各处理见表4。分别用不同的稀释液稀释抗原ova。每只小鼠2次肌肉注射ova，间隔2周，每次注射ova10μg，体积200μl。表4.小鼠分组及处理(每只小鼠一次注射量)组别小鼠稀释剂(每200μl成分含量)抗原ova16gs20μg+se150μg10μg26gs20μg+l-甲基硒代半谷氨酸150μg10μg36gs20μg+蛋氨酸硒150μg10μg46氢氧化铝(10％)10μg56生理盐水10μg4.血样采集于二免疫后第2周，眼眶采血约0.4ml，4000rpm，离心10分钟，分离血清，-80℃保存。5.ova特异性igg亚类的检测检测步骤如下：1)、用5μg/mlova(溶于碳酸盐缓冲液，ph9.6)包被96孔聚酯板，置于4℃过夜。用pbst(含0.05％吐温-20的pbs)洗3次。2)、用含5％小牛血清的pbs封闭96孔板1小时，pbst清洗3次。3)、向孔内加入100μl血清(一免后的血清1：100稀释；二免后血清1：1000稀释)。4)、将含上述血清的96孔板孵育1小时，再次用pbst洗三次。5)、加入生物素(biotin)标记的二抗igg1,igg2a(1:1000)，孵育1小时，用pbst清洗3次。6)、加入抗生物素标记的辣根过氧化梅(1：5000)，孵育30分钟，用pbst洗三次。7)、加入100μltmb底物(exalphabiologicals,inc)显色10-20分钟。8)、最后用50μl的2mh2so4终止显色反应，用酶标仪上在450nm处读取od值。二、结果图4表示各组小鼠血清抗体igg1和igg2a水平。对于igg1，稀释剂(gs-se)、gs-硒代半胱氨酸、gs-蛋氨酸硒和氢氧化铝组的水平均高于生理盐水组，各稀释剂之间无显著差异；而对igg2a，仅稀释剂(gs-se)的水平显著高于生理盐水组，gs-硒代半胱氨酸、gs-蛋氨酸硒和氢氧化铝组的水平和生理盐水组比较无显著性差异。因此，gs和亚硒酸钠配伍可促进igg1和igg2a的产生，而其它对igg1的产生有促进作用，对igg2a的产生无促进作用。氢氧化铝组可见注射部位有肿胀等局部反应，而其余各组均未见局部反应。实施例5：含人参皂苷和亚硒酸钠的疫苗稀释剂可冰冻保存一、材料和方法1.试剂亚硒酸钠(se)，生产批号：1002176793，为sigma-aldrich公司产品；氯化钠注射液，生产批号：1610110113，为浙江都邦药业股份有限公司产品；人参皂苷(gs)，生产批号20160225，为吉林省宏久生物科技股份有限公司产品，总皂苷含量为大于90％，含rb1(25.90％)，rb2(2.68％)，rc(7.88％)，rd(10.10％)，re(12.48％)和rg1(1.96％)20％氢氧化铝铝胶生理盐水，批号：1607006，为齐鲁动物保健品有限公司产品；模式抗原卵清白蛋白(ova)购自sigma公司。ova通过内毒素去除柱(pierce公司)去除两次，除去内毒素，然后用bca试剂盒法定量(pierce公司)。2.含人参皂苷和亚硒酸钠溶液的配制甲液配制:称取一定量的人参皂苷充分溶解于用生理盐水中，调整溶液浓度至20mg/100ml(w/v)，4℃保存备用。乙液配制：称取一定量的亚硒酸钠充分溶解于用生理盐水中，调整溶液浓度至300mg/100ml(w/v)，4℃保存备用。疫苗稀释液(gs-se)的配制：等体积合并甲、乙两液，再过0.22μm滤膜过滤除菌，即得疫苗稀释液。每100ml的该疫苗稀释液中含人参皂甙10mg和亚硒酸钠150mg。3.稀释剂的冻融将稀释剂gs-se和20％氢氧化铝铝胶生理盐水在室温至-20℃反复冻融3次，备用。4.动物分组及处理将30只小鼠随机分成5组，每组6只。分别将经过和未经过冻融的稀释剂gs-se和20％氢氧化铝铝胶生理盐水稀释模式抗原(稀释至浓度为ova10μg/200μl,10％氢氧化铝铝胶)，每只小鼠2次皮下注射疫苗0.2ml(含ova10μg/200μl)，间隔2周，设生理盐水对照组。5.血样采集二免后2周采血。血样静置于4℃冰箱过夜，600g，离心，吸取血清，分装于0.2ml塑料离心管中，-80℃保存。6.ova特异性igg的检测(1)用5μg/mlova(溶于碳酸盐缓冲液，ph9.6)包被96孔聚酯板，置于4℃过夜。(2)用pbst(含0.05％吐温-20的pbs)洗3次。(3)用含5％小牛血清的pbs封闭96孔板1小时，pbst清洗3次。(4)向孔内加入100μl血清(1：100稀释)。(5)将含上述血清的96孔板孵育1小时，再次用pbst洗三次。(6)向孔内加入hrp标记的二抗(山羊抗鼠igg，1:5000)100μl，孵育1小时，用pbst洗三次。(7)加入100μltmb底物(exalphabiologicals,inc)显色10-20分钟。(8)最后用50μl的2mh2so4终止显色反应，用酶标仪上在450nm处读取od值。二、结果图5显示，铝胶经过冻融后稀释抗原免疫动物，igg水平比未冻融的铝胶组显著下降(p<0.05)；而gs-se经过冻融后稀释抗原免疫动物，igg水平和未经冻融的gs-se比较，无显著变化(p>0.05)。备注说明：将gs-se改为浓度为每100ml的该疫苗稀释液中含人参皂甙10mg和亚硒酸钠75mg，其经过冻融后稀释抗原免疫动物，igg水平和未经冻融的相同浓度的gs-se比较，结果也为无显著变化(p>0.05)。实施例6：含人参皂苷和亚硒酸钠的溶液(gs-se)稀释疫苗显著增强了猪的抗体产生一、材料和方法1.试剂亚硒酸钠(se)，生产批号：1002176793，为sigma-aldrich公司产品；氯化钠注射液，生产批号：1610110113，为浙江都邦药业股份有限公司产品；猪伪狂犬病病毒gb抗体检测试剂盒，生产批号：04-04573-06，为北京爱德士元亨生物科技有限公司产品；人参皂苷(gs)，生产批号20160225，为吉林省宏久生物科技股份有限公司产品，总皂苷含量为大于90％，含rb1(25.90％)，rb2(2.68％)，rc(7.88％)，rd(10.10％)，re(12.48％)和rg1(1.96％)；2.含人参皂苷和亚硒酸钠溶液的配制甲液配制:称取一定量的人参皂苷充分溶解于用生理盐水中，调整溶液浓度至1mg/100ml(w/v)，4℃保存备用。乙液配制：称取一定量的亚硒酸钠充分溶解于用生理盐水中，调整溶液浓度至2mg/100ml(w/v)，4℃保存备用。疫苗稀释液(gs-se)的配制：等体积合并甲、乙两液，再过0.22μm滤膜过滤除菌，即得疫苗稀释液。每100ml的该疫苗稀释液中含人参皂甙0.5mg和亚硒酸钠1mg。3.疫苗伪狂犬病活疫苗(bartha-k61株，生产批号：1962040c)，美国辉瑞动物保健有限公司产品。4.动物分组和疫苗注射将24只4周龄仔猪随机分成3组，每组8只。用以下溶液稀释伪狂犬弱毒疫苗：生理盐水、辉瑞疫苗专用稀释剂和人参皂苷-亚硒酸钠溶液(gs-se)。各组的处理按照表5，每头猪1次肌肉注射伪狂犬病弱毒疫苗2ml。表5.仔猪分组及处理组别仔猪稀释剂伪狂犬弱毒疫苗18生理盐水(2ml)-28辉瑞稀释剂(2ml)1头份38gs-se(gs:10μg+se:20μg/2ml)1头份5.采样于免疫后第2周前腔静脉采血约2ml，4000rpm，离心10分钟，分离血清，-80℃保存。6.抗体检测用猪伪狂犬病毒gb抗体检测试剂盒检测血清伪狂犬病gb抗体水平，具体步骤如下：(1)将所有血清从冰箱取出的试剂恢复至室温。(2)在抗原包被板中加入100μl经2倍稀释的阴性对照、阳性对照和血清样品。(3)在18～26℃孵育60分钟。(4)用洗涤溶液洗涤微孔3～5次。(5)每孔加入100μl酶标抗体，在18～26℃条件下孵育20分钟。(6)重复步骤4。(7)每孔加入100μltmb底物，在18～26℃条件下孵育15分钟。(8)每孔加入50μl终止液终止反应，在650nm下读取吸光值。7.统计分析抗体水平用平均值士标准差(mean士s.d.)，采用spss(l7.0)统计软件中单因素方差分析(one-wayanova)，并用duncan法进行组间多重比较，p<0.05即判定为差异性显著，p<0.01为差异极显著，microsoftofficeexcel2007软件进行绘图。二、结果由图6可知，用含人参皂苷和亚硒酸钠的溶液(gs-se)对抗体产生的促进作用显著高于生理盐水对照组(p<0.05)，商品疫苗专用稀释剂和生理盐水对照组无显著性差异(p>0.05)。实施例7：含人参皂苷和亚硒酸钠的溶液(gs-se)稀释疫苗显著增强了鸡的抗体产生一、材料和方法1.试剂亚硒酸钠(se)，生产批号：1002176793，为sigma-aldrich公司产品；氯化钠注射液，生产批号：1610110113，为浙江都邦药业股份有限公司产品；人参皂苷(gs)，生产批号20160225，为吉林省宏久生物科技股份有限公司产品，总皂苷含量为大于90％，含rb1(25.90％)，rb2(2.68％)，rc(7.88％)，rd(10.10％)，re(12.48％)和rg1(1.96％)。2.含人参皂苷和亚硒酸钠溶液的配制甲液配制:称取一定量的人参皂苷充分溶解于用生理盐水中，调整溶液浓度至40mg/100ml(w/v)，4℃保存备用。乙液配制：称取一定量的亚硒酸钠充分溶解于用生理盐水中，调整溶液浓度至400mg/100ml(w/v)，4℃保存备用。疫苗稀释液(gs-se)的配制：等体积合并甲、乙两液，再过0.22μm滤膜过滤除菌，即得疫苗稀释液。每100ml的该疫苗稀释液中含人参皂甙20mg和亚硒酸钠200mg。3.疫苗鸡传染性法氏囊病(ibd)弱毒活疫苗(b87株)，购自浙江荐量生物工程有限公司(批号:160108)。4.动物分组和疫苗给药将7日龄商品肉鸡75只按照体重随机分成5组，每组15只。组1：每只鸡滴鼻点眼生理盐水(共50μl)；组2：每只鸡滴鼻点眼生理盐水稀释的ibd疫苗(共50μl)；组3：每只鸡滴鼻点眼用gs溶液稀释的ibd疫苗(共50μl)；组4：每只鸡滴鼻点眼用se溶液稀释的ibd疫苗(共50μl)；组5：每只鸡滴鼻点眼gs-se溶液稀释的ibd疫苗(共50μl)，见表6。ibd疫苗在上述稀释液中的浓度均为按照说明书，每次一个头份。表6.雏鸡分组及处理5.采样于免疫后20天翼下静脉采血(0.5ml)收集血样分离血清，于-20℃保存，备用。6.抗体检测用样品稀释液将样品作500倍稀释。采用idexx公司的elisa试剂盒进行检测，方法按照产品说明书。具体操作如下(1)取出包被板，在表上记录样品的位置。(2)在合适的两个孔中加入100μl阴性对照。(3)在合适的两个孔中加入100μl阳性对照。(4)在相应的孔中加入100μl稀释好的样品。(5)18～26℃条件下孵育30min。(6)将孔内的液体倒入合适废液筒内。(7)用大约350μl蒸馏水洗涤反应孔3～5次，最后一次洗涤后将孔内液体吸干。(8)每孔加入100μl酶标抗体(hrp-山羊抗鸡抗体)。(9)18～26℃条件下孵育30min。(10)重复步骤6和7。(11)每孔加入100μltmb底物溶液。(12)18～26℃条件下孵育15min。(13)每孔加入100μl终止液终止反应。(14)在650nm，测量和记录吸光值a。二、结果由图7可知，人参皂苷(gs)对抗体产生有显著促进作用(p<0.05)，亚硒酸钠(se)则无；人参皂苷与亚硒酸钠配伍(gs-se)对抗体的促进作用显著大于人参皂苷单独应用时的作用(p<0.05)。表明人参皂苷与亚硒酸钠配伍(gs-se)可产生更强的促抗体生成功能。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。当前第1页12