本发明属于兽用生物制药领域，具体涉及cap-tflg蛋白在制备pcv2疫苗中的应用。
背景技术：
猪圆环病毒2型（porcinecircovirustype2，pcv2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaningmultisystemicwastingsyndrome，pmws）的主要病原，此外还与猪皮炎与肾病综合征、仔猪先天性震颤、流产和渗出性皮炎等有关，这些疾病统称为猪圆环病毒病。该病广泛流行于世界各地，在我国猪群中流行较为严重，临床上常与猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟和猪细小病毒等混合感染，继发感染，给养猪业造成了巨大的损失。目前，疫苗接种是防控pcv2的有效手段，国内外研发的商品化pcv2疫苗已陆续获得上市认可，主要包括全病毒灭活疫苗、重组病毒嵌合灭活疫苗和重组亚单位疫苗，这些疫苗的应用为pcv2感染的控制发挥了重要的作用，但免疫效果仍有待进一步提高
亚单位疫苗研究较多的是基因工程疫苗亚单位疫苗，是指含有病原体的一种或几种抗原，而不含有病原体的其他遗传信息。因此，亚单位疫苗不含有感染性组分，无须灭活，也无致病性。国内外许多学者将pcv2cap蛋白单独表达以研制能有效防治pcv2感染的亚单位疫苗。常用的是病毒的杆状表达系统在昆虫细胞中表达的cap蛋白，应用该系统获得的cap蛋白能自我组装成类病毒粒子，将其免疫动物后可诱导高水平的elisa抗体以及pcv2特异性的淋巴细胞增殖反应。如boehringer-ingelhein动物保健公司研制的pcv2疫苗（circoflex）和intervet动物保健公司研制的pcv2疫苗（circumvent），均是运用昆虫杆状病毒表达pcv2的orf2基因，大量获得具有免疫原性的pcv2cap蛋白，加入佐剂制备成疫苗。大量田间试验表明该类疫苗可为仔猪提供良好的免疫保护，能减轻病毒血症，减少淋巴结组织损伤及pcv2病毒载量，对欧洲及北美的pcv2的控制发挥了巨大作用。目前我国也已有pcv2亚单位疫苗注册上市（青岛易帮易圆净），适当降低了pcv2疫苗的防治费用，促进了生猪养殖业的发展。
研究表明在pcv2cap蛋白的n端或c端展示t细胞或b细胞表位，能提高特异性的免疫应答。鞭毛素（flagellin）是细菌鞭毛丝状体的主要结构蛋白。作为一类独特的细菌病原相关模式，flagellin具有激活toll-likereceptor5(tlr5)和nlpfamilycarddomaincontaining4(nlrc4)两条信号通路的免疫活性。大量研究表明，flagellin能以tlr5和nlrc4通路依赖的方式有效激活免疫应答，可以作为免疫佐剂有效增强疫苗抗原特异性的免疫应答；最近的研究表明flagellin的第85至111位短肽能作为佐剂增强抗原特异性的免疫应答。
技术实现要素：
：
本发明的目的是公开cap-tflg蛋白在制备pcv2疫苗中的应用。tflg通过与pcv2cap蛋白c端融合展示于pcv2vlps表面，并通过激活tlr5通路来提高pcv2vlps疫苗的免疫效果。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
cap-tflg蛋白在制备pcv2疫苗中的应用，所述疫苗能够使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，能够有效抵抗强毒株的攻击，提高仔猪的存活率。
一种pcv2vlps疫苗，其特征在于，所述疫苗包含cap-tflg蛋白和佐剂。
一种pcv2vlps疫苗的制备方法，其是将cap-tflg蛋白与isa206佐剂按照质量比1:1进行配苗制备得到。
其中编码所述cap蛋白的核苷酸序列为seqidno.1。
编码所述cap-tflg蛋白的核苷酸序列为seqidno.2。
一种制备cap-tflg蛋白的方法，其特征在于，其是将核苷酸序列为seqidno.2转化进大肠杆菌进行原核表达制备得到。
一种制备cap-tflg蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，cap-tflg基因人工合成，其核苷酸序列为seqidno.2所示，5’端带有ncoi酶切位点，3’端带有hindiii酶切位点；
步骤二：以pet-28α载体为骨架，使用ncoi和hindiii酶切并回收骨架片段，cap-tflg片段使用ncoi和hindiii酶切并回收，然后通过连接酶于16℃连接过夜，将连接产物转化入ez10大肠杆菌感受态细胞中，最终挑取菌落溶于10µl培养基中用于菌落pcr鉴定，将阳性重组子提质粒并酶切鉴定以及测序，最终获得转移载体pbac-cap3；
步骤三，将预表达鉴定为阳性的菌种转接于200mllb加抗生素（如kana抗生素，则终浓度50ug/ml）的容量为1000ml的大锥形瓶中培养，转接比例是1:100，培养条件：37℃，200rpm/min培养3~4小时；
步骤四：当od600值达到0.4~0.6时，加乳糖至终浓度1%，开始诱导表达，诱导表达的条件：37℃，160rpm/min培养6小时；
步骤五：用200ml离心杯收集菌体，6000rpm，4℃离心10分钟，弃上清；
步骤六：加50ml缓冲液于离心杯中，用5ml枪头反复吹打，使细胞均匀分散在缓冲液中，所述缓冲液为20mmol/ltrishcl，0.5mol/lnacl，ph7.9；
步骤七：将重悬均匀的菌体进行匀质机破菌，破菌条件：功率850w；破菌2分钟；
步骤八：将破菌好的菌体离心，8000rpm，4℃离心15分钟，分离上清和沉淀；
步骤九：将沉淀物用50ml缓冲液重悬于50ml离心管中，所述缓冲液为20mmol/ltrishcl，0.5mol/lnacl，ph7.4；
步骤十：分别取40μl上清和40μl重悬的沉淀，加10μl5×蛋白上样缓冲液，100℃加热10分钟，取10μl煮好的样品进行sds-page电泳检测，即得到所述的cap-tflg蛋白。
本发明利用生物信息学手段，通过自主设计，对猪圆环病毒2型的orf2和flagellin(tflg)基因进行原核密码子优化，并人工合成适合在大肠杆菌高效表达的cap和cap-tflg蛋白表达基因。用本发明的cap和cap-tflgvlps与适当的佐剂混合分别免疫仔猪，cap-tflgvlps能显著增强小猪的免疫应答，具有更好的免疫原性和保护性。
附图说明：
图1为重组的pet-28a-cap和pet-28a-cap-tflg表达质粒图谱。
图2为pet-28a-cap（603bp）和pet-28a-cap-tflg（684bp）的验证结果，通道1：takaradnamaker；通道2：阳性对照；通道3：阴性对照；通道4-6：pet-28a-cap目的片段；通道4-8：pet-28a-cap-tflg目的片段。
图3为pet-28a-cap和pet-28a-cap-tflg的可溶性表达结果，通道1：takaraproteinmaker；通道2：pet-28a-cap-tflg上清；通道3：pet-28a-cap-tflg沉淀；通道4：pet-28a-cap上清；通道5：pet-28a-cap沉淀。
图4为pet-28a-cap和pet-28a-cap-tflg蛋白电镜观察结果。
具体实施方式：
实施例1：一种表达cap和cap-tflg蛋白的载体构建
步骤1：cap和cap-tflg基因人工合成，其核苷酸序列为seqidno.1和seqidno.2所示，5’端带有ncoi酶切位点，3’端带有hindiii酶切位点。
步骤2：以pet-28α（本实验室保存）载体为骨架，使用ncoi和hindiii酶切并回收骨架片段，cap-tflg片段使用ncoi和hindiii酶切并回收，然后通过连接酶于16℃连接过夜，将连接产物转化入e.coliez10strain大肠杆菌感受态细胞中，最终挑取菌落溶于10µl培养基中用于菌落pcr鉴定，将阳性重组子提质粒并酶切鉴定以及测序，最终获得转移载体pbac-cap3。
其中pcr鉴定采用pet-28α载体引物，其pcr体系如下：
成分体积
t5taqmix（擎科生物）5µl
菌液1µl
pet-28α-f0.2µl
pet-28α-r0.2µl
ddh2o3.6µl
total10µl。
pcr反应条件如下：
98℃3min
98℃10s
56℃10s30cycles
72℃10s
72℃30s
16℃保存
扩增产物经1%琼脂糖电泳鉴定分析，结果如图2，表明扩增出680bp左右的条带，大小与预期的一致，表明片段已经插入到载体当中。
测序，将pcr鉴定与酶切鉴定均正确的质粒送出测序，测序结果显示与电子模拟图谱完全一致。
实施例2：cap和cap-tflg蛋白的可溶性表达
步骤1：将预表达鉴定后的菌种转接于200mllb加抗生素（如kana抗生素，则终浓度50ug/ml）的大锥形瓶（容量1000ml）中培养。转接比例一般是1:100。培养条件：37℃，200rpm/min培养3~4小时。
步骤2：当od600值达到0.4~0.6时，加乳糖（终浓度1%），开始诱导表达。诱导表达的条件：37℃，160rpm/min培养6小时。
步骤3：用200ml离心杯收集菌体，6000rpm，4℃离心10分钟，弃上清。湘仪离心机型号：gl-21m
步骤4：加50ml缓冲液（20mmol/ltrishcl，0.5mol/lnacl，ph7.9）于离心杯中，用5ml枪头反复吹打，使细胞均匀分散在缓冲液中。
步骤5：将重悬均匀的菌体进行匀质机破菌。破菌条件：功率，850w；破菌2分钟。均质机，atsengineeringlimited，仪器型号：ah-1500。
步骤6：将破菌好的菌体离心，8000rpm，4℃离心15分钟，分离上清和沉淀，湘仪离心机型号：gl-21m。
步骤7：将沉淀物用50ml缓冲液（20mmol/ltrishcl，0.5mol/lnacl，ph7.4）重悬于50ml离心管中。
步骤8：分别取40ul上清和40ul重悬的沉淀，加10ul5x蛋白上样缓冲液，100℃加热10分钟。取10ul煮好的样品进行sds-page电泳检测。
实施例3：cap和cap-tflg蛋白vlps电镜观察样品制备
铜网经过10~30s的等离子清洗，碳面朝上；将一块封口膜铺在冰盒上冷却；将铜网放在冰的封口膜上；封口膜上分别滴样品、超纯水、pta染液各20μl；放置1-2分钟，将铜网、样品、超纯水、pta冷却；将铜网碳面扣在样品液滴上吸附样品1分钟，用滤纸与铜网垂直接触吸掉多余液体，直至看不到残留液体，持续吸水10s；将铜网碳面扣在pta液滴上染色0.5-~1分钟，用滤纸吸干；放置在滤纸上，在阴凉处自然干燥，即可用于电镜观察。
实施例4：不同疫苗免疫仔猪的抗体消涨规律
步骤1：将cap和cap-tflg蛋白的破菌上清经中饱和硫酸铵沉淀纯化后，分别与isa206佐剂按照质量比1:1进行配苗。
步骤2：筛选圆环抗体阴性、圆环抗原和蓝耳抗原阴性14~21日龄仔猪25头，随机分为5组，每组5头。其中3组分别免疫cap、cap-tflg和国内商品化疫苗2ml（哈尔滨维科生物技术开发公司，猪圆环病毒2型灭活疫苗（lg株），兽药生字（2010）080011071），1组免疫cap-tflg蛋白疫苗1ml，剩余1组作为空白对照组，分别与免疫后14日、28日、60日、90日、120日、150日、180日采血，用商品化圆环抗体elisa试剂盒进行抗体检测。
表1不同圆环疫苗免疫仔猪抗体检测结果
注：“-”表示抗体检测结果为阴性，以od值为阳性的血清最大稀释倍数的抗体效价从实验结果可以看出，cap蛋白2ml组、cap-tflg蛋白1ml组和商品化圆环疫苗组免疫效果无明显差异，cap-tflg蛋白2ml组抗体产生时间更早，持续时间更长。
实施例5：cap-tflg蛋白疫苗对初生仔猪的攻毒保护试验
步骤1：筛选圆环抗体阴性、圆环抗原和蓝耳抗原阴性怀孕母猪4头，其中1头在产前42天免疫cap-tflg蛋白疫苗2ml，1头在产前42天免疫国内商品化疫苗2ml（哈尔滨维科生物技术开发公司，猪圆环病毒2型灭活疫苗（lg株），兽药生字（2010）080011071），另外两头不做免疫。
步骤2：待母猪生产14~21日后，每窝随机挑选5头仔猪进行试验，免疫母猪生产仔猪作为免疫组，另外两组分别设为攻毒对照组和空白对照组。
步骤3：对免疫组和攻毒对照组仔猪，在两腋下及两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（klh/icfa，0.5mg/ml）4ml/头，并经腹腔注射巯基乙酸培养基，10ml/头。3日后，使用pcv2强毒（病毒含量≥105.5tcid50/ml）滴鼻1.0ml/头和肌肉注射2.0ml/头,连续观察25日。对所有猪进行扑杀、剖检，符合以下3项判为发病：
a体温特征：仔猪体温升高(≥40.5℃)持续3日以上。
b体重标准：相对增重率下降应不低于5%。
相对增重率（%）=(空白对照组仔猪平均日增重-攻毒对照组仔猪平均日增重)/攻毒对照组仔猪平均日增重。
c病毒抗原检测：用免疫组化方法检测淋巴结组织，应pcv2抗原检测阳性。
以上任意两项，即可判断为pcv2发病。
表2各试验动物发病结果判定
从结果可以看出，在产前42天前进行cap-tflg蛋白免疫，可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，能够有效抵抗强毒株的攻击，提高仔猪的存活率。从本次实验结果来看，相比国内商品化疫苗，本发明的cap-tflg蛋白疫苗能够提供更好的免疫保护。
序列表
<110>武汉中拓康明生物科技有限公司
<120>cap-tflg蛋白在制备pcv2疫苗中的应用
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>603
<212>dna
<213>pcv-cap(pcv-cap)
<400>1
cgtcaccgttatcgttggcgtcgtaaaaatggtatctttaatacccgtctgagccgcacc60
tttggttataccattaaacgtaccaccgttaaaaccccgagctgggcagttgatatgatg120
cgttttaacatcaacgattttctgcctccaggtggtggtagcaatccgcgtagtgttccg180
tttgaatattatcgtattcgcaaggtgaaagtggaattttggccgtgtagcccgattaca240
cagggtgatcgtggtgttggtagcagcgcagttattctggatgataattttgttaccaaa300
gcaaccgcactgacctacgatccgtatgtgaattatagcagccgtcataccattacacag360
ccgtttagctatcatagccgttattttaccccgaaaccggttctggatagcaccattgat420
tattttcagccgaataacaaacgcaatcagctgtggctgcgcctgcagaccgcaggtaat480
gttgatcatgttggtctgggcaccgcatttgaaaatagcatttatgatcaagagtacaac540
atccgcgttaccatgtatgttcagtttcgcgaatttaacctgaaagatccgcctctgaat600
ccg603
<210>2
<211>81
<212>dna
<213>tflg(tflg)
<400>2
attaataacaatctgcagcgtgttcgtgaactggccgttcagagcgcaaatagcaccaat60
agccagagcgatctggatagt81
<210>3
<211>684
<212>dna
<213>cap-tflg(cap-tflg)
<400>3
cgtcaccgttatcgttggcgtcgtaaaaatggtatctttaatacccgtctgagccgcacc60
tttggttataccattaaacgtaccaccgttaaaaccccgagctgggcagttgatatgatg120
cgttttaacatcaacgattttctgcctccaggtggtggtagcaatccgcgtagtgttccg180
tttgaatattatcgtattcgcaaggtgaaagtggaattttggccgtgtagcccgattaca240
cagggtgatcgtggtgttggtagcagcgcagttattctggatgataattttgttaccaaa300
gcaaccgcactgacctacgatccgtatgtgaattatagcagccgtcataccattacacag360
ccgtttagctatcatagccgttattttaccccgaaaccggttctggatagcaccattgat420
tattttcagccgaataacaaacgcaatcagctgtggctgcgcctgcagaccgcaggtaat480
gttgatcatgttggtctgggcaccgcatttgaaaatagcatttatgatcaagagtacaac540
atccgcgttaccatgtatgttcagtttcgcgaatttaacctgaaagatccgcctctgaat600
ccgattaataacaatctgcagcgtgttcgtgaactggccgttcagagcgcaaatagcacc660
aatagccagagcgatctggatagt684