本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种clec-2在制备治疗颅脑损伤药物中的应用。
背景技术：
目前临床上颅脑损伤十分常见，如脑外伤等有很高的死亡率和致残率，且在年轻人中尤为多见，给社会造成极大的负担。颅脑损伤之后的病情变化较快且复杂，并且持续时间较长。尽管治疗颅脑损伤的药物和外科手术日渐改进，但是有效的治疗方法和手段相当匮乏，尤其是缺乏药物治疗手段。因此，充分研究颅脑损伤后的病理变化以期寻求更好的治疗手段已经显得刻不容缓。
以脑外伤为例，其发病机制主要分为两种，一是由外力冲击直接引起的物理损伤，二是由物理损伤引起的继发性损伤，包括神经元损伤、炎症反应等。两种损伤都会引起血脑屏障的破坏，并且继发性损伤的破坏显得更为严重和持久。在脑外伤继发性损伤的病理变化过程中，来源于血液单核细胞的小胶质细胞介导的炎症反应起到了关键性的作用。脑损伤发生之后，大量炎症细胞因子从激活的小胶质细胞中产生，这些炎症因子可引起血脑屏障通透性和完整性破坏、导致神经元兴奋性升高、神经毒性物质的积聚，从而破坏神经血管单元各成分之间的相互联系。最近的研究表明，激活的小胶质细胞存在两种表型：具有促进炎症作用的“m1”表型和具有抑制炎症作用的“m2”表型。“m2”型小胶质细胞释放的甘露糖受体、精氨酸酶、白介素10、白介素1-β受体拮抗剂有助于清除细胞碎片，减轻炎症反应，促进神经营养保护因子的释放。由于神经元损伤之后的不可再生性，在脑外伤发生之后，调节“m1”型小胶质细胞向“m2”型小胶质细胞转化，快速抑制炎症反应，将神经元的继发性损害程度降到最低，应该是保护神经元，减轻神经元损害的可靠措施。
c型凝集素受体-2，(clec-2)作为一种新的血小板表面受体，通过与其唯一的内生型配体平足蛋白(pdpn)结合，介导血小板itam(immunoreceptortyrosineactivationmotif，itam)信号转导。该信号通路在胚胎发育过程中可以确保高内皮细胞微静脉(hev)的分化和其完整性，确保淋巴系统的正确生成；又可以维持胚胎发育过程中脑血管的完整性。同时，在多种炎症模型和辐照损伤的疾病模型中，该信号通路都可以发挥抑制炎症，维持血管完整性的功能。
临床实践发现，重度颅脑损伤病人的血小板计数、压积、平均体积和分布宽度等指标出现显著变化。但由于血小板被各种刺激激活之后所拥有的释放和分泌功能，之前对于血小板功能的了解都是以止血和凝血为重点。pdpn作为血小板clec-2唯一的内生型配体，只是被简单的认为作为激活血小板的一种物质，最近也有人发现pdpn还可以影响细胞的迁移和浸润。但其在颅脑损伤中的作用没有报道。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种clec-2在制备治疗颅脑损伤药物中的应用，本发明公开了血小板clec-2对颅脑损伤具有保护作用及作用的潜在机制，提供了一种新的治疗颅脑损伤的药物，为临床治疗颅脑损伤病人提供新的理论与技术支撑。
在一方面，本发明公开了c型凝集素受体-2(clec-2)在制备治疗颅脑损伤药物中的应用。
进一步地，颅脑损伤为脑外伤。
进一步地，clec-2是通过clec-2/pdpn信号通路起作用的。
进一步地，颅脑损伤包括脑外伤引起的神经损伤、炎症反应和血脑屏障中的一种或几种。
进一步地，clec-2通过减少促炎症因子、增加抗炎症因子的表达拮抗颅脑损伤的炎症反应。
进一步地，促炎症因子为白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-12、白细胞介素-23和肿瘤坏死因子-α中的一种或几种。
进一步地，抗炎症因子为白细胞介素-10、精氨酸酶-1、甘露糖受体和类几丁质酶中的一种或几种。
进一步地，clec-2通过促进血脑屏障相关蛋白的表达缓解颅脑损伤引起的血脑屏障的破坏。
进一步地，血脑屏障相关蛋白为基质金属蛋白酶和/或紧密连接蛋白。
进一步地，基质金属蛋白酶为基质金属蛋白酶-2和/或基质金属蛋白酶-9。紧密连接蛋白为咬合蛋白(occludin)和/或闭锁小带蛋白zo-1。
进一步地，药物通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mtor和核糖体蛋白s6激酶信号通路实现小胶质细胞由m1型向m2型的转变。
进一步地，clec-2促进小胶质细胞向m2型的转化依赖于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路。
在另一方面，本发明还公开了一种治疗颅脑损伤的药物，包括c型凝集素受体-2以及药学上可接受的辅料。
进一步地，药物通过减少促炎症因子、增加抗炎症因子的表达拮抗颅脑损伤的炎症反应
进一步地，促炎症因子为白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-12、白细胞介素-23和肿瘤坏死因子-α中的一种或几种。
进一步地，抗炎症因子为白细胞介素-10、精氨酸酶-1、甘露糖受体和类几丁质酶中的一种或几种。
进一步地，药物通过促进血脑屏障相关蛋白的表达缓解颅脑损伤引起的血脑屏障的破坏。
进一步地，血脑屏障相关蛋白为基质金属蛋白酶和/或紧密连接蛋白。
进一步地，基质金属蛋白酶为基质金属蛋白酶-2和/或基质金属蛋白酶-9。紧密连接蛋白为咬合蛋白(occludin)和/或闭锁小带蛋白zo-1。
进一步地，药物通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mtor和核糖体蛋白s6激酶信号通路实现小胶质细胞由m1型向m2型的转变。
pdpn存在于神经元与星形胶质细胞之外的小胶质细胞中，不仅可以作为一种配体，与血小板clec-2结合，激活血小板，行使血小板的功能。同时，血小板clec-2还可通过与pdpn结合，改变小胶质细胞的极化状态。本发明发现了血小板clec-2与pdpn的这些功能，并且通过药物研发达到临床治疗颅脑损伤的目的。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明公开了血小板表面受体clec-2对颅脑损伤引起的神经功能损害具有改善作用；同时clec-2可以减轻颅脑损伤引起的炎症反应；此外clec-2可以减轻颅脑损伤引起的血脑屏障的损害；并发现激活mtor信号通路是clec-2促进小胶质细胞由m1型向m2型转化而起到神经保护作用的机制之一；本发明为利用血小板及clec-2作为治疗颅脑损伤的一种新型药物提供了依据。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是对四组小鼠进行脑水肿程度测量的结果；
图2是对四组小鼠进行握力试验的结果；
图3是对四组小鼠进行水迷宫定位航行试验的结果；
图4是对小鼠大脑皮质和海马组织中的tnf-α的表达水平的测试结果；
图5是对小鼠大脑皮质和海马组织中的il-1β的表达水平的测试结果；
图6是血小板clec-2对小鼠脑外伤后大脑皮质中血脑屏障相关蛋白，包括zo-1，mmp-9，mmp-2表达的影响结果以及相关的直方图统计结果；
图7是血小板clec-2对小鼠脑外伤后大脑皮质中occludin蛋白表达的影响结果以及相关的直方图统计结果；
图8是clec-2对小鼠脑外伤后海马组织中血脑屏障相关蛋白，包括zo-1，mmp-9，mmp-2表达的影响结果以及相关的直方图统计结果；
图9是血小板clec-2对小鼠脑外伤后海马组织中occludin蛋白表达的影响结果以及相关的直方图统计结果；
图10是小鼠脑外伤后脑组织中血小板clec-2的配体pdpn表达分布的结果；
图11是小鼠源性小胶质细胞系bv2细胞系在是否受到lps刺激的情况下pdpn表达的结果以及相关的直方图统计结果；
图12是血小板clec-2对于正常的小鼠源性小胶质细胞系bv2细胞的极化状态的影响结果以及相关的直方图统计结果；
图13是不同剂量的血小板clec-2对于受到lps刺激下的小鼠源性小胶质细胞系bv2细胞的极化状态的影响结果以及相关的直方图统计结果；
图14是血小板clec-2发挥调节小鼠源性小胶质细胞系bv2细胞极化状态可能涉及的信号通路的免疫印迹检测结果；
图15是图14中信号通路相关的直方图统计结果，但并不限于此信号通路。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明以下实施例中所涉及的神经反射实验和行为学实验包括：
(1)脑水肿程度测量试验，具体如下：
将小鼠脑组织分成三部分，分别为左半球，右半球以及小脑，称量并且记录三部分的湿重。然后将这三部分分别放入烘箱，100℃下干燥5天，进行彻底烘干，称量并且记录干重。各部分脑水肿程度的计算公式为：[(湿重-干重)/湿重]×100％。
(2)wire-grip试验(握力试验)，具体如下：
将长度为45cm的金属丝横置悬挂在45cm高的框架上，金属丝的下方放置柔软的弹力海绵垫，将小鼠轻置于金属丝上确保小鼠前肢握住金属丝后开始计时，记录小鼠60s以内的运动情况。此实验采用5分制评分系统对其运动功能进行评分：1分，小鼠的前、后爪均不能握住金属丝；2分，小鼠的前、后爪均握住金属丝，但是尾巴不能盘绕金属丝；3分，小鼠前、后爪可以握住金属丝，并且尾巴可以盘绕金属丝；4分，小鼠尾巴可以盘绕金属丝，前、后爪均握住金属丝，并且在金属丝上移动；5分，小鼠尾巴可以盘绕金属丝，前、后爪均握住金属丝，并且在金属丝上移动，而且可以进一步沿着框架爬到地面。如果小鼠不能握住金属丝并且停留30秒，记为0分。该试验可以反映小鼠的运动功能以及平衡能力。
(3)morris水迷宫定位航行试验：
用于测量小鼠对水迷宫学习记忆的能力，试用于处于脑外伤恢复期的小鼠，历时10天，第一天让每只小鼠在水池中自由游泳1分钟，以熟悉水池及周围环境；从第二天起，随机将小鼠从某一象限(靶象限除外)置入池内，小鼠登上平台后系统自动终止记录，记为上台潜伏期，即逃避潜伏期(escapelatency)，实验至第10天结束，每天上午、下午各训练一次，每次分别选择不同象限作为入水点，将小鼠面向池壁放入水中，观察并记录小鼠寻找并爬上平台的路线图、所需时间(逃避潜伏期)搜寻策略。系统设定90s为最长潜伏期，小鼠爬上平台后，让其在平台上再适应5s，若小鼠入水后90s内未能找到平台，将小鼠引至平台上适应5s，其潜伏期记为90s。
(4)免疫荧光实验
在小鼠脑外伤24h和7d后，将小鼠深麻醉之后，用pbs和4％多聚甲醛对小鼠进行心脏灌流，迅速分离获取整个脑组织，而后进行蔗糖梯度脱水，利用oct包埋，进行冰冻切片，获得小鼠脑切片。将切片孵育在bsa稀释的一抗中，4℃过夜，然后漂洗切片，利用荧光标记的二抗在室温中孵育2h，随后，使用尼康正置荧光显微镜进行观察，利用imagej对所得图片进行合并处理。
(5)酶联免疫吸附测定法实验(elisa)：
在小鼠脑外伤后6h，24h和72h，将小鼠深度麻醉，迅速取出脑组织并沿矢状缝分成左右两侧大脑，分离获取大脑皮质和海马，然后将脑组织放在预先含有蛋白酶抑制剂(pmsf)的裂解液中匀浆，离心，取上清。依据细胞因子检测试剂盒的说明书，利用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法测定样品中小鼠两种细胞因子tnf-α和il-1β的表达水平。简要的步骤如下：向预先包被了小鼠tnf-α或il-1β单克隆抗体的酶标孔中加入前面处理好的脑组织匀浆液，温育；温育后，加入生物素标记的抗tnf-α和il-1β抗体，再与链霉亲和素-hrp结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物a、b，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅与样品中小鼠tnf-α或il-1β的浓度呈正相关。
(6)免疫印迹实验：
在小鼠脑外伤后6h，24h和72h将小鼠麻醉后分别分离脑皮质和海马组织，将分离提取的脑组织加入到含有蛋白酶抑制剂的裂解液中超声裂解，离心，匀浆后提取上清液；在小鼠源性小胶质细胞系bv2细胞受到lps刺激12h之后，提取不同处理组的蛋白，然后，利用增强型bca测量蛋白浓度，每孔上样等量60ug蛋白样品，利用sds-page凝胶电泳分离各蛋白，然后，将分离胶上的蛋白转到pvdf膜上，随后，将转有蛋白的pvdf膜孵育在bsa稀释的抗体中于4℃过夜，第二天洗膜后，蛋白条带在辣根过氧化物酶链接的二抗中室温孵育2h，随后，应用ecl化学发光系统检测蛋白条带，最后扫描蛋白条带，并使用imagej分析蛋白条带的灰度值。
(7)实时荧光定量pcr
在小鼠源性小胶质细胞系bv2细胞受到lps刺激12h之后，提取不同处理组的rna，利用nanodrop2000检测各个处理组样本rna浓度，然后进行逆转录，获得cdna。对于合成的cdna，利用
实施例1
将24只体重基本相同6周龄icr小鼠随机分为四组，每组6只，分别为：单纯对照组(sham组)、单纯颅脑损伤组(tbi组)、颅脑损伤前处理组(pre组)和颅脑损伤后处理组(post组)。
颅脑损伤建模步骤如下：将各组小鼠利用立体定位仪进行固定，将小鼠头皮剪开暴露颅骨，以冠状缝与矢状缝切线分为两边，在左半球钻一个直径为4mm的圆形小孔，暴露脑组织，然后利用自由落体打击器进行打击，建立颅脑损伤模型。sham组小鼠颅脑损伤前后不做任何操作，pre组小鼠在颅脑损伤前30min通过侧脑室注射的方式给与400ng血小板clec-2。post组小鼠在颅脑损伤后30min通过侧脑室注射的方式给与400ng血小板clec-2，三组小鼠饲养条件均相同。
对各组小鼠进行相关试验测试，测试结果分别如图1、图2和图3所示。图1反应了各组小鼠在颅脑损伤后不同时间点的脑水肿程度变化情况，图1a为sham组小鼠在不同时间的脑水肿程度变化情况，图1b为其余各组小鼠在不同时间的脑水肿程度变化情况。图2反应了各组小鼠在颅脑损伤以后，连续10天的运动、平衡功能的变化。图3反映了各组小鼠在水迷宫定位航行试验中，颅脑损伤11天以后连续10天训练的逃避潜伏期的时间。
对比图1-3中tbi组和pre组的各项试验结果可知，pre组小鼠颅脑损伤以后的脑水肿程度减轻，运动、平衡功能增强和水迷宫试验潜伏期缩短，说明血小板clec-2改善了颅脑损伤引起的脑水肿和神经行为功能缺损。
应用elisa酶联免疫吸附实验检测的炎症细胞因子tnf-α和il-1β的表达水平。如图4、图5所示，图4a、b、c分别为四组小鼠在颅脑损伤后6h、24h、72h时脑皮质中tnf-α的表达水平，图4d、e、f分别为四组小鼠在颅脑损伤后6h、24h、72h时海马组织中tnf-α的表达水平。图5a、b、c分别为四组小鼠在颅脑损伤后6h、24h、72h时脑皮质中il-1β的表达水平，图5d、e、f分别为四组小鼠在颅脑损伤后6h、24h、72h时海马组织中il-1β的表达水平。从图可知，外源性注入的血小板clec-2，无论是在脑皮质或者海马组织中，均抑制了颅脑损伤导致的炎症因子il-1β和tnf-α的增加，说明血小板clec-2在颅脑损伤以后发挥了拮抗炎症反应的作用。
图6是四组小鼠颅脑损伤后6h、24h、72h的脑皮质中血脑屏障相关蛋白，包括zo-1，mmp-9，mmp-2表达的影响结果(6a、6b、6c)以及6h、24h、72h的脑皮质中zo-1(6d、e、f)，mmp-9(6g、h、i)，mmp-2(6j、k、l)的直方图统计结果。图7是四组小鼠颅脑损伤后6h、24h、72h的脑皮质中occludin蛋白表达的影响结果(7a、7b、7c)以及6h、24h、72h的脑皮质中分子量为125kda的occludin蛋白(7d、e、f)，分子量为65kda的(7g、h、i)，分子量为50kda的(7j、k、l)的直方图统计结果。图8是四组小鼠颅脑损伤后6h、24h、72h的海马组织中血脑屏障相关蛋白，包括zo-1，mmp-9，mmp-2表达的影响结果(8a、8b、8c)以及6h、24h、72h的海马组织中zo-1(8d、e、f)，mmp-9(8g、h、i)，mmp-2(8j、k、l)的直方图统计结果。图9是四组小鼠颅脑损伤后6h、24h、72h的海马组织中occludin蛋白表达的影响结果(9a、9b、9c)以及6h、24h、72h的海马组织中分子量为125kda的occludin蛋白(9d、e、f)，分子量为65kda的(9g、h、i)，分子量为50kda的(9j、k、l)的直方图统计结果。图中sha均表示sham组。由测试结果可知，在颅脑损伤以后，血脑屏障的完整性和通透性遭到破坏，血脑屏障相关蛋白表达减少，基质金属蛋白酶表达增加，而外源性给与的血小板clec-2可以逆转该现象，说明血小板clec-2对颅脑损伤引起的血脑屏障的破坏具有抑制作用。
对tbi组颅脑损伤不同时间点(24h和7d)的小鼠脑切片进行免疫荧光试验，结果如图10所示，图中第一列的图自上而下为神经元(24h)，星形胶质细胞(7d)，周细胞(24h)，小胶质细胞(24h)和血管内皮细胞的标志物(24h)，图片均呈现红色；第二列的图代表血小板clec-2的配体pdpn，均呈现绿色；第三列的图代表细胞核，均呈现蓝色；第四列的图为前三列合并后的图。除了神经元与星形胶质细胞之外，小胶质细胞也表达血小板clec-2的配体pdpn。证明了血小板clec-2发挥抑制炎症的作用可能是通过与小胶质细胞的pdpn相结合。
在体外，利用小鼠源性的小胶质细胞系bv2细胞，经受lps刺激，模仿体内颅脑损伤以后的炎症变化，经过免疫印迹和免疫荧光检测，结果如图11所示。图11a为免疫荧光检测结果，图11b为免疫印迹检测结果，图11c为直方图统计结果，结果表明炎症会引起小胶质细胞系表达血小板clec-2的配体pdpn。在此基础之上，检测血小板clec-2对不同处理组的小胶质细胞系的极化状态的影响。通过酶联免疫吸附测定、免疫印迹和实时荧光定量聚合酶链式反应检测，结果如图12-15所示。
图12a-c为m2型小胶质细胞的标志物检测结果，12d-e表示m1型小胶质细胞的标志物检测结果。图12表明外源性给与的血小板clec-2在正常情况下对小胶质细胞的极化无影响。
图13a-e，表明外源性给与的血小板clec-2可以介导小胶质细胞由m1型向m2型转化。
图14为血小板clec-2发挥调节小鼠源性小胶质细胞系bv2细胞极化状态可能涉及的信号通路的免疫印迹检测结果，但并不限于此信号通路。
图15a-d证明mtor信号通路的阻断剂雷帕霉素(rap)可以抑制血小板clec-2引起的mtor信号通路的激活。图15e-g分别证明在加入rap的情况下，血小板clec-2引起的小胶质细胞的极化会受到抑制，进一步证明了血小板clec-2介导的小胶质细胞极化是通过mtor信号通路。
以上结果表明血小板clec-2通过pdpn发挥调节炎症状态下小胶质细胞的极化状态，并且mtor信号通路是可能涉及的通路之一，但并不仅限于此条通路。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。