一种用于促进颅脑损伤后神经功能修复的组合物及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及神经干细胞领域，具体而言涉及一种包含胶原、含胶原结合区(CBD)的 神经营养因子、以及表达Trk受体的神经干细胞的组合物及其制备方法。本发明还涉及该组 合物在促进神经功能修复，优选颅脑损伤后的神经功能修复，尤其优选外伤性颅脑损伤后 的神经功能修复中的用途。
【背景技术】
[0002] 外伤性颜脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是常见的致残性疾病。在美国每 年有170万人罹患TBI，TBI导致的死亡人数约占美国每年因伤死亡总数的三分之一。在我国 TBI主要的发病原因是交通事故。近年来我国经济的快速发展，汽车保有量成倍增加，TBI已 经成为一个沉重的公共卫生问题。
[0003] 在过去的20年里，由于急救、影像、重症监护和康复等学科的进展，TBI患者的护理 水平已明显提高。但是，仍没有确切的临床治疗手段能逆转TBI病理进程、改善遗留的神经 系统功能障碍。
[0004] TBI的病理生理过程可分为三个阶段。早期，原发损伤的应激使脑血流减少，使神 经元因发生兴奋性中毒而死亡，减少的脑血流使大脑代谢水平下调，最终局部能量被耗竭。 中期，细胞因子和趋化因子释放，神经炎症反应开始加强，血脑屏障破坏，使得循环中的免 疫调节因子得以进入中枢神经系统，这进一步加重神经炎症。晚期，修复活动开始，神经网 络重构。
[0005] 随着对TBI病理认识的逐渐深入，干细胞替代修复疗法越来越多的用于TBI的治 疗，包括刺激内源性干细胞及外源性干细胞植入。在创伤性颅脑损伤发生后，中枢神经系统 可以动员内源性的神经干细胞来对受损的区域进行修复，但是数量有限。常用于中枢神经 系统疾病治疗的外源性干细胞主要有神经干细胞、间充质干细胞和胚胎干细胞等。
[0006] 快速流动的脑脊液能带走位于目标组织的干细胞，移植的干细胞通常在几小时至 几天内丢失，造成移植细胞浓度不足影响治疗效果。为了获得更好的疗效，移植的干细胞最 好能够固定在目标组织中以保持足够的局部细胞浓度。另一个影响干细胞治疗疗效的主要 因素是细胞成活率低，这可能同移植造成的机械损伤、移植细胞的占位效应、急性炎症、免 疫反应等因素有关。因此，一个合适的环境对于提高移植干细胞的生存至关重要。
[0007] 神经干细胞(NSC)疗法在创伤性颅脑损伤的临床前研究中显示出明显的治疗作 用，目前神经干细胞移植方法主要包括：1、细胞悬液立体定位脑内注射法；2、静脉/动脉内 细胞悬液输入法;3、细胞悬液蛛网膜下腔注射法。但是，现有神经干细胞移植方法存在以下 缺点：1)局部干细胞及神经生长因子浓度不足:动静脉血管内输入神经干细胞，神经干细胞 迀移到损伤灶的数量有限；对于蛛网膜下腔脑内注射法，快速流动的脑脊液会带走位于目 标组织的干细胞及神经生长因子，影响治疗效果;立体定向脑内注射法虽然局部干细胞浓 度较高，但干细胞周边的微环境差，缺乏细胞赖于生存的营养因子，细胞难以较长时间的存 活，很快死亡。2)损伤灶内炎性、免疫抑制环境:损伤灶内产生大量细胞、化学及免疫调节因 子，影响神经干细胞存活。
【发明内容】
[0008]本发明通过生物工程方法，将制备出具有结合胶原结合区（Collagen binding (1〇11^;[11，030)的神经营养因子3(116111'01：1'(^11；[113，阶3)。具有良好的生物容性、可降解、多孔 的胶原通过结合含CBD的NT3(CBD-NT3)，为神经干细胞(NSC)提供良好的微环境。同时利用 生物工程方法将编码Trk C(NT3的受体）的多核苷酸转入神经干细胞，增强神经干细胞同 NT3的结合能力。胶原、NT3、神经干细胞，三者通过生物工程技术的连接，提高了脑损伤灶周 围的神经干细胞及NT3的浓度，极大改善了神经干细胞的微环境，促进神经干细胞的存活及 对外伤性颅脑损伤的治疗作用。
[0009] 本发明的多肽与现有技术相比所具有的有益效果在于：1、胶原疏松多孔的特性将 神经干细胞固定在损伤灶周边，减少了干细胞的流失，维持干细胞在局部的治疗浓度；另 外，胶原内的CBD-NT3和胶原特异性结合，使得神经营养因子NT3在神经干细胞周边的微环 境中有持续的高浓度，表达Trk C的神经干细胞又增强了和NT3的结合能力，从而促进了神 经干细胞的存活、增殖和分化;2、颅脑损伤灶内空腔形成后再注射我们优化的神经干细胞 体系，此时炎性反应减退，能减少神经干细胞的凋亡；另外，空腔的存在使得结合胶原的神 经干细胞移植物注入脑内后不会对周围脑组织产生占位压迫效应。
[0010] -方面，本发明提供一种促进神经功能修复的组合物，其包含:胶原，优选胶原凝 胶;含CBD的神经营养因子，所述神经营养因子选自神经生长因子(Nerve Growth Factor， NGF)、脑源神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF)、NT4/5和NT3,优选 NT3,更优选所述NT3的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示；以及表达Trk受体的神经干细胞，所 述Trk受体选自Trk A、Trk B和Trk C，优选Trk C，更优选所述TrkC的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0011] 进一步地，CBD的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
[0012]进一步地，CBD与神经营养因子通过连接肽连接，优选连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No .9所示。
[0013] 进一步地，含CBD的神经营养因子是含CBD的NT3，优选含CBD的NT3的氨基酸序列如 SEQ ID No .5所示。
[0014] 进一步地，胶原与含CBD的神经营养因子的比例为40ng: 0.8-1.2ml，优选为40ng: Iml;胶原与表达Trk受体的神经干细胞的比例为50μ1:0.8-1.2 X IO6个，优选为50μ1:1 X IO6 个。
[0015]进一步地，含CBD的神经营养因子与胶原特异性地结合，优选含CBD的ΝΤ3与胶原凝 胶特异性地结合。
[0016] 进一步地，Trk C是ΝΤ3的受体，表达Trk C的神经干细胞可以和ΝΤ3结合。
[0017]进一步地，胶原凝胶是可注射的。
[0018] 另一方面，本发明提供一种促进神经功能修复的组合物的制备方法，其包括：
[0019] 1)构建编码含CBD的神经营养因子的多核苷酸的第一载体，其中所述神经营养因 子选自NGF、BDNF、NT4/5和ΝΤ3,优选ΝΤ3,更优选编码含CBD的ΝΤ3的多核苷酸的序列如SEQ ID No.6所示；
[0020] 2)将第一载体转化至宿主细胞并表达，从而获得含CBD的神经营养因子；
[0021] 3)将含CBD的神经营养因子与胶原混合；
[0022] 4)构建编码Trk受体的多核苷酸的第二载体，然后将第二载体转染神经干细胞，从 而获得表达Trk受体的神经干细胞，其中所述Trk受体选自Trk A、Trk B和Trk C，优选Trk C，更优选编码Trk C的多核苷酸的序列如SEQ ID No.4所示；
[0023] 5)将含CBD的神经营养因子与胶原混合后的混合物和表达Trk受体的神经干细胞 混合，从而获得促进神经功能修复的组合物，
[0024] 其中步骤4)于步骤1)至3)中任一步骤之前或之后进行。
[0025]进一步地，将第二载体转染神经干细胞的转染复数为100、200、300、500，优选为 100〇
[0026]进一步地，胶原为胶原凝胶。
[0027] 进一步地，含CBD的神经营养因子与胶原以40ng:0.8-1.2ml，优选40ng: Iml的比例 混合;含CBD的神经营养因子与胶原混合后的混合物和表达Trk受体的神经干细胞按照50μ 1:0 · 8-1 · 2 X IO6个，优选50μ1:1 X IO6个的比例混合。
[0028] 进一步地，含CBD的神经营养因子中CBD与神经营养因子通过连接肽连接，优选编 码连接肽的多核苷酸的序列如SEQ ID No. 10所示。
[0029] 进一步地，编码CBD的多核苷酸的序列如SEQ ID No.8所示。
[0030] 进一步地，编码NT3的多核苷酸的序列如SEQ ID No.2所示。
[0031 ]进一步地，用于构建第一载体的表达载体为原核表达载体，原核表达载体选自 PGEX-4T-1 和 pET28a，优选 pET28a。
[0032] 进一步地，用于构建第二载体的病毒载体选自逆转录病毒、慢病毒和腺病毒载体， 优选腺病毒载体;腺病毒载体可为第一代腺病毒载体、第二代腺病毒载体、第三代腺病毒载 体，优选第三代腺病毒载体。
[0033] 进一步地，宿主细胞可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞等，优选大肠 杆菌；大肠杆菌可为E.coli