超分子自组装法制备的双功能层胶原纤维复合硬脑膜的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及了一种双功能层胶原纤维复合硬脑膜及其制备方法，属于生物医用材料制备领域。
【背景技术】
[0002]硬脑膜由致密结缔组织构成，贴附于颅骨内表面，是一种保护脑和防止脑脊液与外界交通的重要屏障。临床发现，开放性颅脑损伤、炎症、脑肿胀、脑瘤进犯脑膜、过分电灼脑膜等因素均可能导致术中硬脑膜无法关闭，形成缺损，这必将引起脑组织周围的粘连，进而引起如头痛、脑功能障碍、癫痫发作等并发症。目前，治疗硬脑膜缺损的方法就是将合适的硬脑膜替代材料植入脑部代替原生硬脑膜。
[0003]因此，找寻并制备一种合适的硬脑膜替代材料已成当务之急，目前在临床上应用的脑膜替代材料主要有可降解吸收和不可降解吸收两大类。不可降解吸收材料主要有橡皮膜、聚酯乙烷膜、特氟龙膜等，这类材料作为永久异物存在人体内，会引起不同程度的炎症反应，可造成纤维变性和脑粘连；可降解吸收材料最先使用的是患者自身的筋膜、骨膜等组织，采用这种方法虽不会产生排斥反应，但属于一种“以伤治伤”的落后医疗模式，会给患者带来痛苦和不适。近年来，人们使用不同动物源心包膜、脱细胞真皮基质等作为硬脑膜替代材料，这类材料临床效果明显，但仍存在材料来源受限、价格昂贵、生物可降解性差等问题，无法满足日益增长的市场需求。另一类医院常使用的可降解吸收硬脑膜材料为胶原类材料，其代表为以牛跟腱胶原为原料的产品Duragen, Duramax等。该类硬脑膜修复材料生物相容性优异，也能够明显促进脑膜周围组织中成纤维细胞的生长，但力学性能不佳，无法承受较大的脑内脑脊液产生的压力，导致膨出量过高，术后常引起脑脊液漏，无法形成闭合的脑内环境，再者，胶原海绵类硬脑膜修复材料孔隙率过大，会导致脑组织周围细胞的长入，从而形成黏粘，导致癫痫病的发生。
[0004]综上所述,现已有的硬脑膜材料或多或少还存在着排斥反应、脑膜与周围组织粘连、生物降解性差、术后感染、出血、脑脊液漏、癫痫(脑膜粘连)及其它(如引发肿痛)缺陷。而胶原类硬脑膜修复材料虽存在力学性能差、孔隙率过大、生物可降解性差等缺点，但其优异的生物活性决定了其必将是硬脑膜修复材料的发展方向。胶原纤维是胶原分子的聚集体，胶原分子间通过侧向共价交联，相互呈阶梯式有序排列聚合成直径50?200nm、长280nm至数微米的原纤维，这些原纤维组成胶原纤维，胶原纤维又聚集形成胶原纤维束。相比原胶原分子，胶原纤维除拥有胶原的四级结构外，还保留有更多的天然胶原空间结构特征和生物活性，其具有更为优异的力学性能、热稳定性和生物降解性能。因而将胶原纤维应用于硬脑膜修复材料的制备具有很好的应用前景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术的不足而提供的一种双功能层胶原纤维复合硬脑膜，该材料既具有良好的生物降解性能、生物相容性和力学性能，结构稳定易于保存，具备合适的孔隙结构，能有效防止脑黏连，能够承受较高的颅内高压以防止脑脊液渗漏，可促进硬膜化进程，是理想的硬脑膜替代材料。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
(I)聚己内酯-壳聚糖复合基膜的制备:
(1)聚己内酯-壳聚糖复合基膜的制备:
A)复合母液A的制备:将一定质量的聚己内酯固体颗粒，溶于70%的冰乙酸溶液(v/v)中，常温搅拌30?60min,配制为4?10%的PCL溶液(w/v),即得复合母液A ；
B)复合母液B的制备:将一定质量的壳聚糖，溶于70%的冰乙酸溶液(v/v)中，室温下搅拌4?8h，接着将搅拌好的溶液在8000?15000rpm下离心20?30min，除去底层少量不溶物，取上层真溶液，最终配制为2?4%的壳聚糖溶液(w/v)，即得复合母液B ；
C)聚己内酯-壳聚糖(PCL-CS)复合基膜的制备:将上述复合母液A和复合母液B按两溶液中所含溶质的质量比例为I?9: 9?I共混，室温下搅拌6?10h，配制为PCL-CS复合溶液，接着采用流延成膜机流延流延成膜，而后通过微波干燥烘道，再置于25°C无菌恒温培养箱中干燥10-20h，即得PCL-CS复合基膜；
(2)碳化二亚胺原位改性胶原纤维分散液的制备:将10重量份胶原纤维溶于2000体积份的0.1?0.5M的冰乙酸溶液中，4°C下搅拌24?72h，得到胶原纤维分散液，接着用I?1M氢氧化钠溶液调节胶原纤维分散液pH至4.5?5.5，接着向胶原纤维分散液中加入乙醇，使得胶原纤维分散液中乙醇的最终浓度为50~80%(v/v)，室温下加入50?10mM 2-吗啉乙磺酸处理45~90min，接着加入0.4?3重量份N-羟基琥珀酰亚胺和1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温下搅拌反应16~24h，即得碳化二亚胺原位改性的胶原纤维分散液；
(3)超分子自组装法双功能层胶原纤维复合硬脑膜的构建:
将上述制备好的PCL-CS复合膜固定在功能化玻璃反应器中间的凹槽处，再加入上述制备的碳化二亚胺原位改性的胶原纤维分散液，将PCL-CS复合膜完全浸没在胶原纤维分散液中，4°C下静置反应10?24h，冷冻干燥后即得以PCL-CS膜为芯层、碳化二亚胺改性胶原纤维自组装膜为双外层的复合膜；接着将复合膜分别浸溃在磷酸缓冲液和无水乙醇中反复漂洗5?8次，最终将复合膜经冷冻干燥，恒温恒湿试验箱中静置24?48h，玻璃平板挤压，剂量为6?30KGy/h6°Co所产生的、射线消毒灭菌，成型包装，即制得的双功能层胶原纤维复合硬脑膜。
[0007]本发明中所述双功能层胶原纤维复合硬脑膜的制备过程中所使用的微波干燥设备为江阴辰欧微波能系统设备有限公司提供。
[0008]本发明所得到的双功能层胶原纤维复合硬脑膜满足以下主要关键性能指标:
外观:表面柔软、洁白、柔顺、不易破裂；
厚度:总厚度为2?3mm，其中PCL-CS复合膜的厚度为0.6?1.0mm ;
膨胀压力1.24g/cm2；
抗压刚度:2.37?3.7g/cm2/单位应变；
抗牵拉强度:持续15S施加15N拉力时不断裂；
孔隙率:应不小于70% ；
孔径:应不大于200 μ m ； 细胞毒性:细胞毒性反应不大于I级；
无菌试验:无菌；
致敏试验:无迟发性超敏反应；
皮内反应试验:原发性刺激指数PIK0.4。
[0009]本技术与现有技术相比，具有如下优点:
(1)本发明所制备的双功能层胶原纤维复合型人工硬脑膜，基材胶原纤维为超分子结构，是胶原分子的聚集体，保留了胶原本身的生物活性，其空间结构比胶原更为丰富，可更大程度地仿生天然组织结构，所制得材料的力学性能、生物降解性能更为优异；
(2)本发明所制备的双功能层胶原纤维复合型人工硬脑膜，是采用超分子自组装法将改性后的胶原纤维导向粘附在PCL-CS复合膜表面上形成自组装膜，所用交联剂能够同时起到有效交联胶原纤维和桥联PCL-CS复合膜中的壳聚糖与胶原纤维聚集体的双重作用，这样使得胶原纤维结构稳定、耐降解性增强，同时又是胶原纤维双外层膜与芯层共价交联的媒介，有效地增强了胶原纤维双外层与PCL-CS芯层的粘合，提高了复合型人工硬脑膜的双外层与芯层间的剥离强度；
(3)双功能层胶原纤维复合型人工硬脑膜芯层中壳聚糖成分的主链结构上含有大量的氨基、酰胺基等基团，能与胶原纤维聚集态结构侧链的氨基、羧基、酰胺基等产生氢键及静电作用，同样加固了人工硬脑膜的双外层与芯层间的剥离力；
(4)本发明所制备的双功能层胶原纤维复合硬脑膜，是面向大脑皮层的综合性能优越的改性胶原纤维双面复合PCL-CS芯层的复合膜。改性胶原纤维双外层具有一定孔径的多孔网状结构，能有效诱导硬脑膜成纤维细胞及血管内皮细胞的粘附、生长和增殖，且能有效地防止脑脊液的渗漏，在复合膜表面快速脑膜化与血管化；PCL-CS复合膜降解时间较长，防脑脊液渗漏效果好，也可防止因脑皮层面成纤维细胞的长入而引起的黏连效应；最后，壳聚糖成分的存在使其具有良好的抗菌性能，同时面向大脑皮层一面也为胶原纤维膜，有利于成纤维细胞及血管内皮细胞等粘附、生长和增殖，加速修复大脑皮层；
(5)本发明所制备的双功能层胶原纤维复合硬脑膜不影响X射线、脑电、超声、CT等检查，使用方便，安全可靠；
(6)本发明所制备的双功能层胶原纤维复合硬脑膜的基材取材丰富，成本低廉，技术可靠，工艺简便，易于产业化和商品化。
【附图说明】
[0010]图1为双功能层胶原纤维复合硬脑膜(a为EDC改性胶原纤维海绵一双外层；b为PCL-CS复合膜一芯层)；
图2为制备厚度可控的双功能层胶原纤维复合硬脑膜的玻璃反应器。
【具体实施方式】
[0011]下面通过实施对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可根据上述发明的内容作非本质的改进和调整。
[0012]实施例1 (1)聚己内酯-壳聚糖(0.6mm)复合基膜的制备:
A)复合母液A的制备:将I重量份的聚己内酯固体颗粒，溶于25体积份的70%的冰乙酸溶液(v/V)中，常温搅拌30min，配制为4%的PCL溶液(w/v)，即得复合母液A ;
B)复合母液B的制备:将I重量份的壳聚糖，溶于50体积份的70%的冰乙酸溶液(v/V)中，室温下搅拌4h,接着将搅拌好的溶液在8000rpm下离心20min,除去底层少量不溶物，取上层真溶液，最终配制为2%的壳聚糖溶液(w/v)，即得复合母液B ；
C)聚己内酯-壳聚糖(PCL-CS)复合基膜的制备:将上述复合母液A和复合母液B按两溶液中所含溶质的质量比例为1:9共混，室温下搅拌6h，配制为PCL-CS复合溶液，接着采用流延成膜机流延流延成膜，而后通过微波干燥烘道，再置于25°C无菌恒温培养箱中干燥10h，即得PCL-CS复合基膜；；
(2)碳化二亚胺原位改性胶原纤维分散液的制备:将10重量份胶原纤维溶于2000体积份的0.5M的冰乙酸溶液中，4°C下搅拌24h，得到胶原纤维分散液，接着用IM氢氧化钠溶液调节胶原纤维分散液PH至4.5，接着向胶原纤维分散液中加入乙醇，使得胶原纤维分散液中乙醇的最终浓度为50% (v/v),室温下加入