本发明涉及ctl诱导剂组合物，所述组合物包含用于在多个具有不同hla型的患者群中治疗或预防癌症或丙型肝炎病毒相关疾病的肽。
背景技术：
恶性肿瘤是日本人死亡的主要原因，一年造成大约31万人死亡。全球每年约600万人死于癌症。癌症治疗采用外科切除术、抗癌药物、放射疗法等。然而，这些治疗方案涉及复发、qol问题等问题，此外，在无法给予这些治疗的晚期癌症的情况下，缺乏治疗选择。对作为第四种治疗方案的癌症免疫疗法(疫苗疗法)的热切企盼由来已久。全球对肽疫苗的临床研究始于1990年，当时已可鉴定出人类癌抗原肽。然而，根据单独或在联合疗法中给予肽的临床研究统计结果，在超过1,000例的病例中有效率为2.7%(natureimmunology,2004)，原因是要将肽配制成药物制剂十分困难。
另一方面，本发明的发明人进行了特制的肽疫苗疗法，并且证实了肽疫苗的安全有效性，在所述疗法中预先检查了患者的hla型和特异性免疫应答以选择待给予的肽疫苗。准确地讲，观察到通过仅给予特制的肽疫苗对于脑肿瘤和宫颈癌的临床效果(非专利文献1-3)。此外，以允许将其配制成药物制剂的水平与抗癌药物合用，在前列腺癌和胰腺癌中产生了良好的临床效果，并且安全性也达到了(非专利文献4和5)。
通过特异性t细胞这种被视为癌症肽疫苗疗法中的主要效应物进行的细胞免疫，是人白细胞抗原(hla)限制性的，在此基础上，全世界的研究人员，包括本发明的发明人，都开发出了仅给予具有特异性hla类型(hla-a2和hla-a24)的患者的疫苗。然而，具有这两种hla类型的患者百分比大约为40-75%，因此其余的25-60%具有较不常见hla类型的患者无法受益于肽疫苗的作用。因此，需要对开发可在全世界用于癌症患者的肽疫苗进行研究。
已经鉴定出结合hla-a24、hla-a2、hla-a26和hla-a3超型(supertype)(hla-a3、hla-a11、hla-a31、hla-a33和hla-a68.1)中的任一种并且能够诱导相应hla的hla限制性ctl的肽。据报告，这些肽可用作针对癌症的肽疫苗(专利文献1-13和非专利文献1-17)。
在由本发明的发明人根据这些结果进行的癌症疫苗临床试验中，使用特制的肽，预先检查患者的hla类型，根据患者的hla类型，从候选肽中选出最大4种肽，并给予患者。因此，如果患者的hla类型为hla-a2-a24，则分别从hla-a2和hla-a24的一组8种肽(合计16种肽)中选出肽。然而，在其中患者的hla-a24是纯合的情况下，则应在a24的8种肽中选出肽。要引入可以作为癌症疫苗的其它类型的肽十分困难。因此，通过测定肽是否可以诱导跨不同族群的hla限制性ctl，对于具有特定hla类型的患者便可扩大肽的选择。
一方面，尚未充分了解丙型肝炎病毒(hcv)感染后肝细胞疾病的病理机制，但是多项证据表明，病毒特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)可以对hcv感染后的肝脏疾病起关键作用(非专利文献6)。还有研究指出，在病毒感染期间，ctl可有效限制病毒的扩散并消除病毒(非专利文献7)。因此，对于防治hcv感染相关疾病，用疫苗诱导ctl可能是有前景的策略。因此，从低成本且易于保存方面考虑，需要开发用来诱导ctl的肽疫苗。
本发明的发明人之前曾观察到c35-44肽可在hla-a24或hla-a3超型阳性的患者中诱导ctl，该肽是一种衍生自hcv核心蛋白序列的肽，其序列为yllprrgprl(seqidno:25)(专利文献14)。在此观察前，已有研究报导了这一c35-44肽是能够强力诱导用于消除hla-a2阳性个体外周血中的病毒的ctl(非专利文献8和专利文献15)。
本发明所引述的文献如下。下述文献通过引用结合到本专利申请中。
专利文献1：国际公布号wo2005/071075
专利文献2：国际公布号wo01/011044
专利文献3：日本未审查的专利公布(特开)号：2003-270
专利文献4：国际公布号wo2003/050140
专利文献5：日本未审查的专利公布(特开)号hei11-318455(1999)
专利文献6：国际公布号wo00/12701
专利文献7：国际公布号wo02/010369
专利文献8：国际公布号wo99/67288
专利文献9：日本专利申请号2007-2127179
专利文献10：日本未审查的专利公布(特开)号：2004-216
专利文献11：国际公布号wo2007/000935
专利文献12：国际公布号wo2005/075646
专利文献13：国际公布号wo2008/007711
专利文献14：国际公布号wo2007/083807
专利文献15：国际公布号wo2007/049394
非专利文献1：yajiman等,clincancerres.2005年8月15日;11(16):5900-11
非专利文献2：mochizukik等,intjoncol.2004年7月;25(1):121-31
非专利文献3：tsudan等,jimmunother.2004年1-2月;27(1):60-72
非专利文献4：inouey等,jurol.2001年10月;166(4):1508-13.erratumin：jurol.2002年5月;167(5):2146
非专利文献5：yanagimotoh等,cancersci.2007年4月;98(4)：605-11.epub2007年2月19日
非专利文献6：changkm等,springerseminimmunopathol.1997;19:57-68
非专利文献7：kurokohchik等,j.virol.1996;70:232-240
非专利文献8：takaoy.等,microbiol.immunol.,48(7),507-517,2004
非专利文献9：yamadaa等,cancerres.2001年9月1日;61(17):6459-66
非专利文献10：kobayashik等,cancersci.2003年7月;94(7):622-7
非专利文献11：nakaom等,jimmunol.2000mar1;164(5):2565-74
非专利文献12：harashiman等,eurjimmunol.2001年2月;31(2):323-32
非专利文献13：minamit等,cancerimmunol.immunother.2007年,5月56(5)689-98
非专利文献14：matsuedas等,clincancerres.2005年10月1日;11(19pt1):6933-43
非专利文献15：takedatsuh等,clincancerres.2004年2月1日;10(3):1112-20
非专利文献16：naitom等,brjcancer.2007年12月17日;97(12):1648-54.epub2007年11月27日。
技术实现要素：
发明要解决的技术问题：
本发明的目的是提供能够诱导多种hla类型的hla限制性ctl的肽。
解决技术问题采用的技术手段
本发明的目的是提供包含肽的ctl诱导剂组合物，其中所述肽据报告是具有诱导hla-a24、hla-a2或hla-a3超型的hla限制性ctl的能力的已知肽，并且其中所述肽可以诱导两个以上hla类型(包括已报告以外的hla类型)的hla限制性ctl。
因此，本发明提供ctl诱导剂组合物，所述ctl诱导剂组合物包含一种或多种肽并可用于在两个以上患者群中治疗或预防癌症和/或由丙型肝炎病毒引起的疾病，其中一种或多种肽选自egfr-800(seqidno:1)、lck-208(seqidno:2)、lck-488(seqidno:3)、mrp3-1293(seqidno:4)、pap-213(seqidno:5)、psa-248(seqidno:6)、sart2-93(seqidno:7)、sart3-109(seqidno:8)、sart3-302(seqidno:9)、lck-246(seqidno:10)、ppmapkkk-432(seqidno:11)、whsc2-103(seqidno:12)、ube-43(seqidno:13)、hnrpl-501(seqidno:14)、cypb-129(seqidno:15)、lck-422(seqidno:16)、lck-449(seqidno:17)、β-微管蛋白5-154(β-tubulin5-154)(seqidno:18)、lck-90(seqidno:19)、psa-16(seqidno:20)、pap-248(seqidno:21)、iex1-47(seqidno:22)、sart3-511(seqidno:23)、sart3-734(seqidno:24)、c35-44(seqidno:25)、pap-155(seqidno:26)和β-tubuline-309(seqidno:27)，其中两个以上患者群选自hla-a2阳性患者群、hla-a24阳性患者群、hla-a26阳性患者群和hla-a3超型阳性患者群。
本发明还提供药物组合物，所述药物组合物是包含一种或多种肽并可用于在两个以上患者群中治疗或预防癌症的组合物，其中一种或多种肽选自egfr-800(seqidno:1)、lck-208(seqidno:2)、lck-488(seqidno:3)、mrp3-1293(seqidno:4)、pap-213(seqidno:5)、psa-248(seqidno:6)、sart2-93(seqidno:7)、sart3-109(seqidno:8)、sart3-302(seqidno:9)、lck-246(seqidno:10)、ppmapkkk-432(seqidno:11)、whsc2-103(seqidno:12)、ube-43(seqidno:13)、hnrpl-501(seqidno:14)、cypb-129(seqidno:15)、lck-422(seqidno:16)、lck-449(seqidno:17)、β-微管蛋白5-154(seqidno:18)、lck-90(seqidno:19)、psa-16(seqidno:20)、pap-248(seqidno:21)、iex1-47(seqidno:22)、sart3-511(seqidno:23)、sart3-734(seqidno:24)、pap-155(seqidno:26)和β-tubuline-309(seqidno:27)，其中两个以上患者群选自hla-a2阳性患者群、hla-a24阳性患者群、hla-a26阳性患者群和hla-a3超型阳性患者群。
包含一种或多种选自以下肽的本发明组合物可以诱导hla-a24和hla-a2两者的hla限制性ctl，并可用于治疗或预防hla-a24阳性癌症患者群和hla-a2阳性癌症患者群：egfr-800(seqidno:1)、lck-488(seqidno:3)、sart2-93(seqidno:7)、sart3-109(seqidno:8)、whsc2-103(seqidno:12)、ube-43(seqidno:13)、hnrpl-501(seqidno:14)、cypb-129(seqidno:15)和pap-155(seqidno:26)。
包含一种或多种选自以下肽的本发明组合物可以诱导hla-a24和hla-a3超型两者的hla限制性ctl，并可用于治疗或预防hla-a24阳性癌症患者群和hla-a3超型阳性癌症患者群：egfr-800(seqidno:1)、sart2-93(seqidno:7)、sart3-109(seqidno:8)、whsc2-103(seqidno:12)、ube-43(seqidno:13)、hnrpl-501(seqidno:14)、β-微管蛋白5-154(seqidno:18)、lck-90(seqidno:19)和iex1-47(seqidno:22)、pap-155(seqidno:26)和β-tubuline-309(seqidno:27)。
包含一种或多种选自以下肽的本发明组合物可以诱导hla-a2和hla-a3超型两者的hla限制性ctl，并可用于治疗或预防hla-a2阳性癌症患者群和hla-a3超型阳性癌症患者群：sart2-93(seqidno:7)、sart3-109(seqidno:8)、lck-246(seqidno:10)、ppmapkkk-432(seqidno:11)、whsc2-103(seqidno:12)、ube-43(seqidno:13)、hnrpl-501(seqidno:14)、lck-422(seqidno:16)、lck-90(seqidno:19)和sart3-511(seqidno:23)。
包含一种或多种选自以下肽的本发明组合物可以诱导hla-a2、hla-a24和hla-a3超型的hla限制性ctl，并可用于治疗或预防hla-a2阳性癌症患者群、hla-a24阳性癌症患者群和hla-a3超型阳性癌症患者群：sart2-93(seqidno:7)、sart3-109(seqidno:8)、whsc2-103(seqidno:12)、ube-43(seqidno:13)和hnrpl-501(seqidno:14)。
包含一种或多种选自以下肽的本发明组合物可以诱导hla-a26的hla限制性ctl，并且除上述患者群以外，还可用于治疗或预防hla-a26阳性癌症患者群：egfr-800(seqidno:1)、ppmapkkk-432(seqidno:11)、hnrpl-501(seqidno:14)和sart3-109(seqidno:8)。
包含肽c35-44(seqidno:25)的本发明组合物可用于治疗或预防hla-a24阳性患者、hla-a2阳性患者、hla-a3超型阳性患者和hla-a26阳性患者的丙型肝炎病毒相关疾病，即治疗或预防患者群的与hcv感染有关的肝炎、肝硬化和肝癌。
发明的效果
本发明ctl诱导剂组合物中包含的肽具有诱导多个hla类型的hla限制性ctl的能力，因此可用于治疗或预防患者的癌症和丙型肝炎感染相关疾病，所述患者的hla类型不是之前已知的所述肽诱导hla限制性ctl的hla类型。本发明为具有相应hla类型的患者提供较大选择范围的肽，可供在特制的癌症疫苗疗法中进行更有效的治疗。
另外，包含由c35-44(seqidno:25)表示的肽的ctl诱导剂组合物能够在hla-a24阳性患者、hla-a2阳性患者、hla-a3超型阳性患者和hla-a26阳性患者中的任一患者体内诱导ctl，并可用于治疗或预防丙型肝炎病毒相关疾病。
附图简述
图1表示通过刺激得自具有hla-a24-结合sart3-109的hla-a11阳性癌患者的pbmc所得到的ctl的细胞毒活性。
图2表示具有结合hla-a26阳性细胞的不同结合特性的不同肽的结合活性。
图3表示得自hla-a3超型等位基因阳性前列腺癌患者的肽刺激的pbmc的细胞毒活性。用肽刺激得自hla-a3超型等位基因阳性前列腺癌患者的pbmc，通过6小时51cr释放测定法(6-hour51crreleaseassay)测定pbmc针对多种靶细胞的细胞毒活性。得自hla-a3超型等位基因阳性健康志愿者的pha刺激的幼稚t细胞母细胞(blast-formingtcellblast)用作对照。*p<0.05。
实现发明的最佳方式
所谓“与两种以上选自hla-a24、hla-a2、hla-a3超型和hla-a26的hla分子结合”是指肽可与两种以上选自hla-a24、hla-a2、hla-a3超型和hla-a26分子的hla分子形成复合物并可呈现在细胞表面。
本发明中，通过用肽刺激外周血单核细胞(pbmc)，并通过elisa法等测定肽刺激的pbmc是否对经相应肽进行脉冲处理的抗原呈递细胞产生应答并产生细胞因子(例如ifn-γ)，可检测诱导肽特异性ctl的能力。另外，经诱导的ctl的细胞毒活性可通过51cr释放测定法等予以证实。
本发明的肽可通过常规肽合成法制备。用于此目的的方法包括例如以下文献披露的方法：peptidesynthesis，interscience，newyork,1966;theproteins,第2卷,academicpressinc.,newyork,1976；peptidesynthesis[日文],maruzenco.,ltd.,1975;basicsandexperimentsinpeptidesynthesis[日文],maruzenco.,ltd.,1985;以及developmentofpharmaceuticals,第二系列,第14卷,peptidesynthesis[日文],hirokawashotenco.,1991。
本发明ctl诱导剂组合物中包含的肽通过使包含本发明肽的氨基酸序列的多肽经胞内断裂而产生。本发明还包括在这类实施方案中使用本发明的肽。可按需要而无任何限制地选择这类多肽的氨基酸残基数和氨基酸序列，只要所述多肽可以提供本发明的肽。
本发明ctl诱导剂组合物中包含的肽可有效地诱导特异性杀死两种以上选自以下患者群体内的癌细胞的ctl并使之扩增：hla-a24、hla-a2、hla-a3超型和hla-a26阳性患者群，因此可用于治疗各种癌症患者。
本发明提供用于治疗或预防癌症的药物组合物，所述组合物包含如上具体说明的肽。本发明用于治疗或预防癌症的药物组合物可包含一种肽、或两种以上肽和/或其衍生物的组合。由于得自癌症患者的ctl是识别不同癌-抗原肽的细胞亚型，因此还可有效地使用多种癌-抗原肽和/或其衍生物的组合。本发明的肽还可与本发明以外的癌抗原肽合用。
本发明用于治疗或预防癌症的药物组合物可包含各含有多种肽(例如包括各本发明的肽在内的8种肽)的药物制剂，使得该组合物可用于特定疗法。
本发明的药物组合物除肽以外还可包含药学上可接受的载体等。所用载体可为纤维素、聚合氨基酸、白蛋白等。本发明的药物组合物可包括脂质体制剂、与直径为几微米的微珠粒子结合的制剂、与脂质结合的制剂等。还可与之前已知用于疫苗接种的佐剂联合给予本发明的药物组合物，以使得有效地产生免疫应答。给药方法包括例如真皮内或皮下给药等。
本发明用于治疗或预防癌症的药物组合物可以用作癌症疫苗。可根据疾病状况、个体患者的年龄和体重等，适当调整剂量。一般地讲，药物组合物中肽含量的范围通常为0.0001-1000mg，优选0.001-100mg，更优选0.01-10mg，甚至更优选0.1-5mg或0.5-3mg，优选重复给药，每几天、几周或几个月一次。
本发明还提供诱导癌反应性ctl的方法，该方法包括使采自hla-a24、hla-a2、hla-a26或hla-a3超型呈阳性的癌症患者群的外周血单核细胞(pbmc)与本发明的肽接触。本发明的肽可以从得自两种以上上述癌症患者群的pbmc中诱导ctl。有关ctl的“癌反应性”是指ctl识别靶标癌细胞的癌抗原肽和hla分子的复合物，并且能够杀死癌细胞。例如，在本发明的肽存在下，将采自hla-a24呈阳性的恶性脑肿瘤患者的pbmc在体外进行培养，以进行ctl的诱导。本发明诱导ctl的方法可用于过继免疫疗法，其中将诱导后的ctl输回到从中采集pbmc的患者体内以杀死癌细胞。
本发明还提供用于诱导ctl的试剂盒，所述试剂盒用于实施所述诱导ctl的方法。本发明的试剂盒包括一种或多种本发明的肽，并且还可包括合适的缓冲液、培养基等。
本发明还提供用于制备抗原呈递细胞的方法，其中所述抗原呈递细胞可以诱导针对选自以下的癌细胞具有细胞毒性的ctl：hla-a24阳性癌细胞、hla-a2阳性癌细胞、hla-a26阳性癌细胞和hla-a3超型阳性癌细胞。例如，通过将衍生自hla-a24阳性癌症患者的具有抗原呈递能力的细胞与本发明的肽一起培养，使得该肽与hla-a24分子结合并呈递，以实施本发明用于制备抗原呈递细胞的方法。或者在替代方法中，可将能够表达这类肽的载体导入衍生自hla-a24阳性癌症患者的具有抗原呈递能力的细胞中以表达该肽。具有抗原呈递能力的细胞包括例如树突细胞。可以获得衍生自患者的树突细胞，例如，从采自患者的pbmc中分离出培养平板贴壁细胞后，将贴壁细胞在il-4和gm-csf存在下培养大约1周。通过本发明方法制备的抗原呈递细胞可以诱导特异性识别呈递在两种以上选自以下细胞的细胞表面上的肽与hla分子的复合物的ctl：hla-a24阳性癌细胞、hla-a2阳性癌细胞和hla-a3超型阳性癌细胞，并且当给予癌症患者时，可在癌症患者体内促进癌反应性ctl的诱导。即通过本发明方法制备的抗原呈递细胞可以作为药物用于治疗或预防癌症。
本发明还提供用于制备抗原呈递细胞的试剂盒，该试剂盒用于实施所述用于制备抗原呈递细胞的方法。本发明的试剂盒包括一种或多种本发明的肽和/或其衍生物，并且还可包括合适的缓冲液、培养基等。
本发明还提供包含肽c35-44(seqidno:25)的ctl诱导剂组合物，并用于治疗或预防hla-a24阳性患者、hla-a2阳性患者和hla-a3超型阳性患者的丙型肝炎病毒相关疾病。本发明中，“丙型肝炎病毒相关疾病”往往不仅包括丙型肝炎，而且还包括由于hcv感染引起的所有疾病，例如肝硬化和肝癌。
下面参照下列实施例对本发明进行更详细说明，这并不意味着以任何方式将本发明局限于此。
本发明的发明人检测了已知能够诱导hla-a24、hla-a2、hla-a26和hla-a3超型任一种的hla限制性ctl的共34种肽结合其它hla类型的能力(分别为13种、9种和12种肽)。
表1表示本发明的发明人检测的肽及其已知的hla结合特性。
肽
制备表1中列举的肽。
所有这些肽的纯度均>90%并购自biologicaco.(nagoya，japan)。gag77-85(slyntvatl)(seqidno:35)用作结合hla-a2型的对照肽，env-gp(rylrdqqll)(seqidno:36)用作结合hla-a24型的对照肽，hiv-gag167-175(evipmfsal)(seqidno:37)用作结合hla-a26型的对照肽，hiv衍生的肽(rlrdlllivtr)(seqidno:38)用作结合hla-a3超型等位基因分子的对照肽。使用二甲亚砜使剂量为10μg/ml的肽完全溶解。
hla-a3超型中所包括的5个hla-a等位基因有共同的结合基序，但是hla-a3或hla-a68.1阳性的日本人个体十分罕见。因此，在本研究中，检测了肽结合hla-a11、hla-a31和hla-a33分子的能力。
患者(pt)
本研究包括其hla-a2、hla-a24、hla-a26、hla-a11、hla-a31和hla-a33中的任一种hla呈阳性的癌症患者。
健康供体(hd)
健康供体包括了hla-a2阳性患者、hla-a24阳性患者、hla-a26阳性患者、hla-a11阳性患者、hla-a31阳性患者和hla-a33阳性患者。
由其采集pbmc的全部患者和健康供体都未感染hiv。从患者/健康供体中采集20毫升外周血，通过菲可(ficoll)-康锐(conray)梯度离心制备pbmc。将全部样品在低温下保存，直到用于实验。使用下列抗体通过流式细胞术证实了hla-a2、hla-a24、hla-a11、hla-a31和hla-a33分子在pbmc中的表达：抗hla-a24单克隆抗体(mab)、抗hla-a2mab、抗hla-a26mab、抗hla-a11mab、抗hla-a31mab、抗hla-a33mab(所有均获自onelambda，ca，usa)；以及fitc缀合的抗小鼠免疫球蛋白g(igg)mab。
细胞系
表达hla-a2的t2细胞获自atcc(crl-1992)。c1r-a24、c1r-a26、c1r-a11、c1r-a31和c1r-a33是c1r亲本细胞系分别用hla-a24、hla-a26、hla-a11、hla-a31和hla-a33基因转染以表达相应hla分子的细胞(takedatsu等,clincancerres2004；10:111220)。c1r亲本细胞是人b淋巴母细胞(hmy2.cir：人b淋巴母细胞；atcccrl-1993)，并属于用γ射线照射hmy.2b类淋巴母细胞细胞系，通过抗体和补体选择表达mhci类-cw4并缺乏hlai-a类和hlai-b类的细胞所得到的细胞系(storkuswj,alexanderj,payneja,dawsonjr和cresswellp,procnatlacadsciusa,86:2361-2364,1989)。
rma-s-a2601是通过将hla-a2601基因导入rma-s细胞后所产生的稳定转染细胞(rma-s细胞是一种作为变异体rma细胞分离出来、显示mhci类分子在细胞膜上低表达的细胞：karrek,ljunggrenh-g,piontekg和kiesslingr.1986,selectiverejectionofh-2-deficientlymphomavariantssuggestalternativeimmunedefencestrategy(h-2-缺陷型淋巴瘤变异体的选择性排斥表明替代免疫防御策略),nature(lond)319:675)。
pc-93是前列腺肉瘤细胞系，为hla-a11阴性。tsu-pr是前列腺癌细胞系，为hla-a11阳性。sq-1是肺癌细胞系，为hla-a11阴性。colo-201是结肠癌细胞系，为hla-a11阳性。lc-1是肺癌细胞系，为hla-a31/hla-a33阳性。将所有这些肿瘤细胞系在含有10%fcs的rpmi1640(invitrogen)中进行培养。
pbmc中肽反应性ctl的诱导
对以前报告的方法略作修改以检出肽反应性ctl(hidan，maeday，katagirik，takasuh，haradam，itohk.,cancerimmunolimmunother2002;51:219-28)。将按常规方法由各个患者(pt)和健康供体(hd)中获得的pbmc在体外用相应的肽或对照肽刺激。将所得的肽刺激的pbmc与经肽(与用于刺激pbmc的肽相同)脉冲处理过的t2、c1r-a24、c1r-a26、c1r-a11、c1r-a31或c1r-a33细胞共培养后，测定所产生的用作ctl诱导标志的ifn-γ的量。
具体地讲，在u型底96孔微量培养板(nunc，roskilde，denmark)中的200μl培养基中，按一组4孔将pbmc(1x105个细胞/孔)与肽的每一种(10μl/ml)一起孵育。培养基由45%rpmi1640、45%aim-v培养基(gibco-brl，gaithersburg，md)、10%fcs、100u/ml白介素-2(il-2)和0.1mmmem非必需氨基酸溶液(gibco-brl)组成。每3天取出一半培养基后，用含有相应肽(10μg/ml)的新鲜培养基替换。培养后第15天，将一半培养细胞与经相应肽脉冲处理过的t2、c1r-a24、c1r-a26、c1r-a11、c1r-a31或c1r-a33细胞相混合，另一半与经相应对照肽脉冲处理过的t2、c1r-a24、c1r-a26、c1r-a11、c1r-a31或c1r-a33细胞相混合。将各种混合的培养物再孵育18小时。然后，收集上清液，通过酶联免疫吸附测定法(elisa)测定上清液中干扰素(ifn)-γ的水平。与经相应对照肽脉冲处理过的细胞相比，当在响应经相应肽脉冲处理过的细胞时p值小于0.05且产生超过50pg/ml的ifn-γ时，肽反应性ctl的诱导被认定为阳性。
细胞毒活性的测定
通过标准6小时51cr释放测定法测定了肽刺激的pbmc针对hla-a11阳性细胞系tsu-pr和hla-a11阴性细胞系pc93的细胞毒活性。使用衍生自hla-a11阳性健康供体的植物凝集素(pha)激活的t细胞作为阴性对照细胞。在圆底96孔板中，按效应细胞与靶细胞的规定比率，将2,000个细胞/孔的51cr标记的靶细胞与效应细胞一起培养。在临测定细胞毒活性实验之前，使用cd8阳性分离试剂盒(dynal，oslo，norway)，从肽刺激的pbmc中分离出cd8阳性t细胞，所获得的细胞用作效应细胞。将从实验中得到的c.p.m.减去自发释放的c.p.m.，计算得到特异性51cr释放。从不存在效应细胞培养的样品上清液中测定自发释放，随后样品用1%曲通x(wakopurechemicalindustries，osaka，japan)培养以测定总释放。
肽与hla-a26分子的结合试验
将用hla-a2601基因转染的rma-s细胞(rma-s-a2601)在26℃下培养20小时，接着与浓度为0.1-100μm的各种肽及人β2-微球蛋白一起在26℃下培养2小时，然后在37℃下再培养3小时。细胞用pbs洗涤后，向细胞中加入最适浓度的抗人mhci类抗体或hla类型特异性抗体后，放置在冰中30分钟。细胞用pbs洗涤2次，然后加入alexafluor488标记的山羊抗小鼠igg，使之在冰中静置30分钟。使用流式细胞仪进行了测量，并对荧光强度进行了比较。
肽是否能够诱导多种hla类型的hla限制性ctl的检测
从过去已鉴定的癌症肽疫苗的候选肽中，在总共34种肽中选出与hla-a2、hla-a24和hla-a3超型结合的肽(分别为9种、13种和10种肽)，并检测这些肽诱导其类型不同于被最初证实每种肽与之结合的hla的hla限制性ctl的能力。得自具有不同hla类型的患者的外周血用相应的肽刺激，通过使用经肽脉冲处理过的细胞(相当于通过转染每个类型的hla基因所产生的c1r转染细胞)作为靶标，来测定诱导ctl的能力。
在hla-a24结合肽中，首先用如seqidno:1～seqidno:8所示的肽检查了交叉反应性。egfr-800(seqidno:1)诱导hla-a11的hla限制性ctl，lck-488(seqidno:3)诱导hla-a2的hla限制性ctl，sart2-93(seqidno:7)诱导hla-a2和hla-a11的hla限制性ctl，以及sart3-109(seqidno:8)诱导hla-a2、hla-a11和hla-a31的hla限制性ctl(表2)。该表中，数字表示ifn-γ水平(ng/ml)，其中水平等于或大于50ng/ml视为显著。空白项表示未进行实验，减号(-)表示ifn-γ的水平在检出限以下。
表2
表2：hla-a24结合肽诱导hla-a2、hla-a11、hla-a31或hla-a33的hla限制性ctl的能力
同样，在hla-a2结合肽中，用如seqidno:9～seqidno:16所示的肽检查了交叉反应性。发现cypb-128(seqidno:15)能够诱导hla-a24的hla限制性ctl，lck-246(seqidno:10)能够诱导hla-a11和hla-31的hla限制性ctl，lck-422(seqidno:16)能够诱导hla-a31的hla限制性ctl，ppmapkkk(seqidno:11)能够诱导hla-11和hla-a31的hla限制性ctl，whsc2-103(seqidno:12)能够诱导hla-a24和hla-a31的hla限制性ctl，ube-43(seqidno:13)能够诱导hla-a24和hla-a31的hla限制性ctl，以及hnrpl-501(seqidno:14)能够诱导hla-a24和hla-a11的hla限制性ctl(表3)。该表中，数字表示ifn-γ水平(ng/ml)，其中水平等于或大于50ng/ml视为显著。
表3
表3：hla-a2结合肽诱导hla-a24、hla-a11或hla-a31的hla限制性ctl的能力
另外，在hla-a3超型结合肽中，用如seqidno:17～seqidno:27所示的肽检查了交叉反应性。发现β-微管蛋白5-154(seqidno:18)能够诱导a24的hla限制性ctl，lck-90(seqidno:19)能够诱导a2的hla限制性ctl，iex1-47(seqidno:22)能够诱导a24的hla限制性ctl，以及sart3-511(seqidno:23)能够诱导a2的hla限制性ctl(表4)。该表中，数字表示ifn-γ水平(ng/ml)，其中水平等于或大于50ng/ml视为显著。
表4
表4：hla-a3结合肽诱导hla-a2或hla-a24的hla限制性ctl的能力
不同的hla-a3-超型限制性细胞毒活性
sart3-109(seqidno:8)，一种已知结合hla-24的肽，用来刺激得自hla-a11阳性前列腺癌患者的pbmc以诱导ctl。所得ctl的细胞毒活性在铬释放反应中得到证实。至于针对hla-a11阳性细胞系tsu-pr的细胞毒活性，与hla-a11阴性细胞系pc93以及得自hla-a11阳性健康供体的pha刺激的淋巴母细胞相比，针对tsu-pr细胞系的铬释放速率显著较高(图1)。
肽与hla-a26的结合试验
对结合rma-s-a2601的各种肽的能力进行了检测。将肽溶于dmso后使用。仅dmso用作阴性对照。从这些实验结果来看，显示出能够诱导hla-a24限制性的ctl的sart3-109(seqidno:8)也与属于完全不同hla超型的hla-a26结合。同样，研究表明同样是hla-a24限制性的egfr-800(seqidno:1)也与hla-a26分子结合，虽然水平较低(图2)。
lck-90和lck-449肽与hla-a3超型等位基因的结合能力
数据表明lck-90(seqidno:19)和lck-449(seqidno:17)肽结合hla-a3超型等位基因的能力如下，正如专利文献9中所公开的一样。
对于lck-90和lck-449肽已经证实的是，在hla-a3阳性前列腺癌患者血浆中非常频繁地观察到肽反应性igg。同样，由得自hla-a3超型等位基因阳性前列腺癌患者的pbmc诱导lck-90和lck-449肽特异性ctl的能力通过上述方法得到证实。lck-90和lck-449肽分别诱导与以下相应肽的反应性ctl：得自7名hla-a11阳性癌患者中的5名和2名患者、5名hla-a31阳性癌患者中的3名和3名患者、以及5名hla-a33阳性癌患者的2名和3名患者的pbmc的相应肽。
得自hla-a3超型等位基因阳性前列腺癌患者的pbmc在体外用lck-90(seqidno:19)或lck-449(seqidno:17)肽刺激以检测肽反应性ctl是否因此诱导针对癌细胞的细胞毒活性。比起针对hla-a11阴性colo201细胞和阴性对照即得自hla-a11阳性健康供体的pha刺激的幼稚t细胞母细胞，得自hla-a11阳性患者分别用lck-90和lck-449肽刺激的pbmc具有较高水平的针对hla-a11阳性sq-1细胞的细胞毒活性。同样，观察到这些肽能够从得自hla-a31阳性患者和hla-a33阳性患者的pbmc中诱导lc-1(hla-a31+/-a33+)反应性ctl。比起colo201细胞或幼稚t-细胞，每种肽的特异性ctl都具有针对lc-1细胞较强的细胞毒活性。因此，研究表明在体外用lck-90和lck-449肽刺激的pbmc以hla-a11、hla-a31和hla-a33限制性方式对癌细胞发挥细胞毒活性。
细胞毒活性的测定
得自具有各种hla类型的癌症患者的pbmc用肽刺激以检测肽诱导针对各hla类型的ctl的活性。使用各具有与每名患者hla类型相应的hla类型的癌细胞系作为靶细胞，通过标准6小时51cr释放测定法测定针对靶细胞的细胞毒活性。
用于该测定法的靶细胞是下列癌细胞系：pc93(a68)、ke4(a24/a26)、ke5(a1101/)、pc93-a24(a24/a68)、pc93-a33(a33/a68)、pc93-a31(a31/a68)、colo201(a0101/0201)、11-18(a0201/a2402)、tsu-pr(a11)、lc-1(a3101/a3303)、panc-1(a0201/a1101)、lc-1(a3101/a3303)、lc65a(1101/2402)、lncap-a11(a11/a0101/0201)、kns42(a2402/2601)、lncap-a24(a24/a0101/0201)和lncap-a31(a31/a0101/0201)。使用qg56(a2601)、pc93(a68)、lncap(a0101/0201)、lc-1(a3101/a3303)、colo201(a0101/0201)、colo320(a2402/)和k562作为阴性对照。括号内表示各个细胞系的hla类型。有关上述方面，意思是指pc93(wt)表达hla-a68，且例如当靶细胞表示为pc93-a24时，是指导入hla-a24编码基因所产生的稳定转染细胞。所有肿瘤细胞系都在含有10%fcs的rpmi1640(invitrogen)中培养。在表示结果的表5中，hla仅表示转染细胞，“(wt)”则表示非转染细胞。
在表示结果的表5中，按照同样方法，使用hla类型不同于从中得到pbmc的癌症患者的hla类型的肿瘤细胞系作为阴性对照靶细胞，检测由肽激活的pbmc介导的细胞毒活性，当观察到比起针对阴性对照靶细胞的细胞毒活性，针对hla配型靶细胞的细胞毒活性有统计显著性时，则认为发生了所述hla类型的hla限制性细胞毒活性的诱导，用“+”标注。表5表示用于试验的hla配型靶细胞和对照靶细胞。当各类细胞未记录在该表中，并标注为“+”，它是指用于诱导指定hla类型的hla限制性ctl的肽活性是已知的。
对于作为hcv衍生肽的c35-44(seqidno:25)的肽特异性ctl活性，按照常规方法，使用用c35-44肽刺激得自hcv感染患者的pbmc所得到的细胞，并使用用各相应hla基因稳定转染并用c35-44经脉冲处理过的c1r细胞作为hla配型靶细胞，c1r(wt)作为阴性对照靶细胞，在铬释放反应中测定该肽的活性。
在圆底96孔板中，将2,000个细胞/孔的51cr标记的靶细胞与效应细胞(效应细胞与靶细胞之比为40)一起培养。在临测定细胞毒活性实验之前，使用cd8阳性分离试剂盒(dynal，oslo，norway)，从肽激活的pbmc中分离出cd8阳性t细胞，所获得的细胞用作效应细胞。将从实验中得到的c.p.m.减去自发释放的c.p.m.，计算得到特异性51cr释放。从不存在效应细胞培养的样品上清液中测定自发释放，随后样品用1%曲通x(wakopurechemicalindustries，osaka，japan)培养以测定总释放。
分别在使用针对hlai类和cd8的单克隆抗体的特异性抑制实验以及在使用未标记靶细胞的未标记靶标抑制实验(cold-targetsuppressionexperiment)中，鉴定出经诱导的hla限制性ctl的hla类型和肽特异性。这些实验按一式三份进行，当与阴性对照相比时，观察到用抗体或未标记靶标(未用同位素标记的靶细胞)的抑制为显著水平(p<0.05)时，视为阳性，用“+”表示。
结果
hla-a2结合肽
实验表明，c35-44(seqidno:25)具有诱导hla-a2402、hla-a2601、hla-a3101、hla-a3303和hla-a1101的hla限制性ctl的能力。
实验表明，cypb-129(seqidno:15)、lck-422(seqidno:16)、sart3-302(seqidno:9)、ube-43(seqidno:13)和whsc2-103(seqidno:13)具有诱导hla-a3101的hla限制性ctl的能力。
实验表明，hnrpl-501(seqidno:14)和ppmapkkk-432(seqidno:11)具有诱导hla-2601的hla限制性ctl的能力。
hla-a24结合肽
实验证实，sart3-109具有诱导hla-a3101、hla-a3303和hla-a1101的hla限制性ctl的能力，lck208具有诱导hla-a1101的hla限制性ctl的能力，egrf-800具有诱导hla-a0201的hla限制性ctl的能力，sart2-93具有诱导hla-a0201和a0207的hla限制性ctl的能力。
hla-a3结合肽
实验表明，pap-155具有诱导hla-a0201和hla-a2402的hla限制性ctl的能力、β-tubline-309和lck-90具有诱导hla-a2402的hla限制性ctl的能力。这些结果概括于表5中。
根据上述结果可以理解，本发明所具体描述的如seqidno:1-27所示的肽可以在两个以上选自以下患者群的患者体内诱导hla特异性ctl：hla-a2阳性患者群、hla-a24阳性患者群、hla-a26阳性患者群和hla-a3超型阳性患者群，因此适用于对这类患者进行治疗或预防。本发明如seqidno:1-24和seqidno:26-27所示的肽特别适合用作癌症肽疫苗的活性成分，本发明如seqidno:25所示的肽适用于治疗或预防丙型肝炎病毒相关疾病。
<110>株式会社绿多肽(greenpeptideco.，ltd.)
<120>ctl诱导剂组合物
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