本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种能够用于治疗心肌梗死的离子试剂及其制备方法和应用，可应用于受损心肌和心血管的修复重建。
背景技术：
心肌梗死已经成为当前人类健康的最大威胁之一，具有很高的发病率与死亡率(am.j.cardiol.2012,109,187)。缺血性心肌梗死大多数是由于冠状动脉发生血栓，造成了管腔的急性闭塞，使血液供应减少或中断，从而导致心肌缺血性坏死(circulation2000,101,2981)。因此疏通血管堵塞并促进血管再生从而恢复血流供应能够有效抑制心肌细胞凋亡和坏死，这对于心肌梗死的治疗十分重要。临床上针对缺血性心脏疾病的疗法，首先从发病初期的血管组织入手，采取药物治疗或血管支架的方法以期疏通血管；若病情发展到中后期则需采取介入治疗、心脏移植等。但以上方法仅能在一定程度上缓解患者症状，且心脏移植受到了供体器官来源匮乏的限制。近些年来，干细胞(science2014,345,1247391)和组织工程(stemcellstransl.med.2014,3,1090-1099)疗法的发展为治疗心肌梗死带来了新的希望，然而由于干细胞供给有限，分化效率低以及组织工程材料移植的困难性，降解性和安全性问题仍未解决，因此，探索有效的新方法来修复受损心血管和心肌组织以重建心脏功能已成为亟待解决的难题，且具有十分重要的研究意义。
研究表明，促进细胞之间信号交流，激活宿主心肌细胞再生通路，促进血管再生是心肌梗死治疗的关键(stemcells2014,32,2397-2406)。硅基生物材料释放离子能够通过连接蛋白43调控内皮细胞行为(biomaterials2016,84,64-75)，从而促进内皮细胞和骨髓间充质干细胞(biomaterials2014,35,3803-3818)或成纤维细胞(actabiomater.2013,9,6981-6991)的信号交流，进而促进成血管。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种能够用于治疗心肌梗死的离子试剂及其制备方法和应用。
一方面，本发明提供一种能够用于治疗心肌梗死的离子试剂，其包括：具有生物相容性的液体、和分散于所述液体中的生物活性离子，所述生物活性离子选自si、sr、mg、zn、cu、co、mn、ca离子中的至少一种。
使用本发明的离子试剂培养心肌细胞和内皮细胞时，能够维持心肌细胞活力，抑制心肌细胞凋亡，促进心肌细胞间信号交流，促进血管再生。而且，通过静脉注射所述离子试剂，能促进心肌细胞保持活性，抑制心肌细胞凋亡，促进心肌细胞间信号交流，促进血管再生和心梗后的心脏功能修复，可为科学研究及临床治疗提供了可行的方法和依据。此外，本发明的离子试剂来源广泛，安全有效。
较佳地，所述生物活性离子至少含有si和/或sr。
较佳地，所述具有生物相容性的液体为磷酸盐缓冲液或dmem细胞培养基。
较佳地，si离子的浓度为1～40μgml-1，优选为4.53～34.84μgml-1，更优选为4.53～9.08μgml-1，进一步优选为4.53μgml-1。
较佳地，sr离子的浓度为0.63～160μgml-1，优选为5～160μgml-1，更优选为5～40μgml-1，进一步优选为20～40μgml-1，更进一步优选为20μgml-1。
另一方面，本发明提供一种上述离子试剂的制备方法，将具有生物相容性的液体对含有所述生物活性离子的无机生物材料进行浸提，得到所述离子试剂。
该制备方法原料来源广泛，成本低廉，简单易行。
较佳地，所述无机生物材料选自硅酸钙、硅酸锶、氧化锶，镁黄长石、锌黄长石、铜硅钙石、钴黄长石、氧化锰中的至少一种。
第三方面，本发明提供上述离子试剂的在制备治疗心肌梗死药物中的应用。
较佳地，上述离子试剂可用于制备治疗心肌梗死的静脉注射药物。
根据本发明，可以促进受损心肌功能恢复以及心血管的再生，为关于心肌梗死的科学实验研究和临床治疗提供了可行的方法和依据。
附图说明
图1为含不同浓度si离子浸提液对新生大鼠心肌细胞(nrcms)活性的影响。由图可见，在常氧状态下(a)si离子dmem浸提液在稀释至1/64～1/8之间，对照表1，si离子浓度在1.63～13.32μgml-1能够明显提高nrcms活性。在低氧/低糖状态下(b)，nrcms活性明显下降，si离子pbs浸提液在稀释至1/64～1/8之间，对照表1，si离子浓度在4.53～34.84μgml-1能够明显促进细胞活性保持，并且si离子浓度在4.53～9.08μgml-1处具有极明显的促进心肌细胞活性保持效果。
图2为在低氧/低糖状态下，si离子pbs浸提液稀释至1/64(4.53±0.18μgml-1)分别培养nrcms90和120min后，经原位末端标记技术(tunel)的染色图(a)与tunel阳性标记nrcms百分比统计图(b)。tunel染色阳性(绿色)表示细胞已经凋亡。由图可见，在低氧/低糖状态下，随着培养时间的延长，nrcms凋亡数目越来越多，si离子在4.53±0.18μgml-1的浓度下可以有效抑制心肌细胞凋亡。图a比例尺代表50μm。
图3为在低氧/低糖状态下，si离子pbs浸提液稀释至1/64(4.53±0.18μgml-1)对nrcms凋亡相关的丝裂原活化蛋白激酶(mapk)家族蛋白和cleaved-casepase3蛋白表达的影响。由图可知，培养90min后si离子可以有效抑制p38蛋白表达(a,b)，并在培养90min和120min后促进erk1/2蛋白表达(a,b)，同时抑制cleaved-casepase3蛋白的表达(c,d)，进一步说明了si离子pbs浸提液在此浓度能够通过调控细胞凋亡相关蛋白的表达而减缓心肌细胞凋亡，从而使受损心肌细胞启动自我保护机制。
图4为在低氧/低糖状态下，si离子pbs浸提液稀释至1/64(4.53±0.18μgml-1)对nrcms间隙连接相关的cx43表达的影响。免疫荧光染色(a)结果显示低氧/低糖状态抑制了cx43的表达，而si离子在此浓度能够减弱低糖/低糖的抑制效应。通过蛋白表达(b,c)和基因表达(d)的结果，进一步说明了si离子在此浓度能够上调cx43蛋白和基因表达。因此si离子在此浓度能够促进细胞之间的信号交流，进而有利于受损心肌的功能修复。图a比例尺代表25μm。
图5为在低氧/低糖状态下，si离子pbs浸提液稀释至1/64(4.53±0.18μgml-1)对nrcms和人脐静脉内皮细胞(huvecs)共培养中血管内皮生长因子(vegf)调控的成血管的影响。血管假性血友病因子(vwf)染色(a)和血管环定量(b)的结果显示，si离子pbs浸提液在此浓度能够显著地促进共培养体系成血管。共培养体系中vegf(c,d)和kdr(e)基因的表达结果显示，共培养的nrcms通过旁分泌效应分泌的vegfa和共培养的huvecs通过自分泌效应分泌的vegf165均能促进血管再生，同时旁分泌效应在促进心肌梗死后血管重建中发挥了重要作用。图a比例尺分别代表75μm或50μm。
图6为采用本发明提供的方法，经静脉注射si离子pbs浸提液4周后的大鼠心脏功能(a,b)，心脏重塑(c,d)和肥大(e-g)图。其中，“sham”表示假手术组，即未造成心梗模型的大鼠组，ami表示经左冠状动脉前降支结扎术后未经修复组，ami+cs表示经左冠状动脉前降支结扎术后静脉注射治疗实验组。由图可知，“si离子疗法”能够通过衰减心室重塑和肥大进而对于心肌梗死具有明显的治疗作用。
图7为采用本发明提供的方法，经静脉注射si离子pbs浸提液4周后对nrcms凋亡的影响。通过对心肌梗死边界区域免疫组化tunel染色的定性(a)和定量(b)结果显示，缺血诱导心肌凋亡，而“si离子疗法”能够保护心肌细胞减少细胞凋亡数量。图a比例尺代表50μm。
图8为采用本发明提供的方法，经静脉注射si离子pbs浸提液4周后对nrcms间隙连接相关的cx43表达的影响。由图可知，“si离子疗法”能够促进心肌梗死区域和边界区域的cx43的表达，这就进一步证明了“si离子疗法”能够促进细胞之间的信号交流，进而利于心肌梗死后修复。比例尺代表50μm。
图9为采用本发明提供的方法，经静脉注射si离子pbs浸提液4周后对大鼠心肌缺血边界部位vegf调控的血管再生的影响。vwf免疫荧光染色定性(a)和血管环数量(b)结果显示，“si离子疗法”能够显著促进心肌梗死边界区域血管再生。血清vegfa蛋白定量(c)结果显示，“si离子疗法”能够促进vegfa蛋白表达进而促进血管再生。图a比例尺分别代表75μm或50μm。
图10为含不同浓度sr离子dmem浸提液对nrcms活性的影响。由图可见，在常氧状态下sr离子dmem浸提液在稀释至1～1/256之间，对照表2，sr离子浓度在0.63～160μgml-1能够明显提高nrcms活性。并且sr离子浓度在5～40μgml-1处具有极明显的促进细胞活性保持效果，进一步优选得到了sr离子dmem浸提液在稀释至1/8，也就是sr离子浓度在20μgml-1具有最佳的保持活性作用。
图11为在常氧状态下，sr离子dmem浸提液稀释至5～80μgml-1时对nrcms凋亡相关的bcl-2和c-casepase3基因表达的影响。由图可知，sr离子dmem浸提液在sr离子浓度为5～80μgml-1时可以有效促进bcl-2基因表达(a)，并抑制c-casepase3基因表达(b)，并且sr离子浓度在20～80μgml-1处具有极明显的效果，进一步优选得到了sr离子dmem浸提液在sr离子浓度为20μgml-1时具有最佳的促进bcl-2表达并抑制c-casepase3基因表达的作用，进一步说明了sr离子在一定浓度范围能够通过调控细胞凋亡相关基因的表达而减缓心肌细胞凋亡，从而使受损心肌细胞启动自我保护机制。
图12为在常氧状态下，sr离子dmem浸提液稀释至5～80μgml-1时对nrcms和huvecs共培养中vegf调控的成血管的影响。共培养体系vegf(a,b)和kdr(c)基因的表达结果显示，在sr离子的刺激下，共培养的nrcms和huvecs能够分别通过旁分泌和自分泌效应分泌vegf，并一步作用于huvecs，促进kdr的基因表达，进而促进成血管，且sr离子在浓度为20μgml-1处具有最佳的作用效果。
具体实施方式
以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图和下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
在此提出“离子疗法”的概念，通过静脉注射活性离子(例如无机生物材料释放的活性离子)，调控细胞之间的信号交流，增强心肌细胞活力和促进心血管再生。
本发明一实施方式提供一种能够治疗心肌梗死的离子试剂。该离子试剂中含有生物活性离子，所述生物活性离子可选自si、sr、ca、mg、zn、cu、co、mn离子中的至少一种。
该离子试剂还可含有具有生物相容性的液体，生物活性离子分散于所述具有生物相容性的液体中。
该离子试剂中，si离子的存在形式可为sio44-。金属离子(m，包括sr、ca、mg、zn、cu、co、mn)的存在形式可为m2+。
mg、zn、cu、co、mn离子和si、sr离子类似具有促进血管再生的作用，ca离子能加强心脏的兴奋性，因此mg、zn、cu、co、mn、ca和si、sr离子一样能够用于心肌梗死治疗。
所述生物活性离子可以是由无机生物材料释放的生物活性离子。所述无机生物材料可选自硅酸钙、硅酸锶、氧化锶，镁黄长石、锌黄长石、铜硅钙石、钴黄长石、氧化锰等一系列含si、sr、ca、mg、zn、cu、co、mn离子的无机盐类和金属氧化物的至少一种，或其中任意两种以上的混合。
一个示例中，所述离子试剂中含有si离子，其中si离子的浓度可为1～40μgml-1，优选为4.53～34.84μgml-1，更优选为4.53～9.08μgml-1，进一步优选为4.53μgml-1。在所述离子试剂中，如果si离子的浓度过大，则会有一定细胞毒性；如果si离子的浓度过小，则难以起到治疗心肌梗死的作用。
另一示例中，所述离子试剂中含有sr离子，其中sr离子的浓度可为0.63～160μgml-1，优选为5～160μgml-1，更优选为5～40μgml-1，进一步优选为20～40μgml-1，更进一步优选为20μgml-1。
另外，所述离子试剂中，mg离子的浓度可为0～100μgml-1。
所述离子试剂中，zn离子的浓度可为0～40μgml-1。
所述离子试剂中，cu离子的浓度可为0～10μgml-1。
所述离子试剂中，co离子的浓度可为0～5μgml-1。
所述离子试剂中，mn离子的浓度可为0～40μgml-1。
所述离子试剂中，ca离子的浓度可为1～110μgml-1。若所述具有生物相容性的液体中含有ca离子，则此浓度是具有生物相容性的液体中原有的ca离子和生物材料释放的ca离子的总和。
所述具有生物相容性的液体优选为液态细胞培养基、或者能够注射到生物体内的液体。例如优选为磷酸盐缓冲溶液(pbs)或细胞培养基(dmem)。选用磷酸盐缓冲溶液时，可以维持与人体ph相近的恒定的ph值。选用细胞培养基(dmem)时，可以为细胞的生长提供必需的营养物质。
所述pbs可为本领域公知的pbs。所述pbs可购自商用，例如购自pbs购自生工生物工程(上海)股份有限公司，型号为e607008-0500。
一个示例中，pbs的成分为nacl136.89mm；kcl2.67mm；na2hpo48.1mm；kh2po41.76mm；ph7.2～7.4。
所述细胞培养基(dmem)可为本领域公知的dmem，尤其是用于培养心肌细胞、内皮细胞的培养基，例如可为本领域公知的nrcms和huvecs培养基，具体可举出nrcms专用完全培养基dmem/f12等。所述nrcms专用完全培养基可购自商用，例如购自美国应用生物系统公司，型号为11320-022。
在可选的实施方式中，所述离子试剂是含有无机生物材料释放的生物活性离子的浸提液。
所述无机生物材料可含si、sr、ca、mg、zn、cu、co、mn等离子中的至少一种，例如可选自硅酸钙、硅酸锶、氧化锶，镁黄长石、锌黄长石、铜硅钙石、钴黄长石、氧化锰等一系列无机盐类和金属氧化物中的至少一种。所述生物材料可购自商用或自行制备。其制备方法不限，例如，可以采用共沉淀或溶胶凝胶法制备。
本发明一实施方式中，以具有生物相容性的液体为提取溶剂，对含有所述生物活性离子的无机生物材料进行浸提，制备离子试剂。即，所述离子试剂可以是具有生物相容性的液体对无机生物材料的浸提液。
制备含有si离子的浸提液时，可以对casio3粉体进行浸提。casio3可由ca(no3)2·4h2o(例如购自国药)和nasio3·9h2o(例如购自国药)经过沉淀法制备，经800℃～1500℃煅烧。所得的casio3的纯度为99％以上。casio3陶瓷可以是1～10mm的颗粒或陶瓷块体，粒径优选为30～150μm，此粒径范围内的casio3陶瓷易获得，浸提较方便且浸提原液离子浓度适中便于后期原液稀释。
制备含有sr离子的浸提液时，可以对sro粉体(例如购自阿拉丁)进行浸提。sro粉体的纯度优选为99.7％以上，粒径优选为30～150μm，此粒径范围内的sro粉体易获得，浸提较方便且便于后期原液稀释。得到的浸提原液还可以通过提取溶剂进行稀释以得到所需浓度。
制备含其它离子的浸提液时，亦可对含有该离子的无机生物材料进行浸提，在此不再赘述。
一个示例中，含不同浓度si或sr离子浸提液的制备方法为：按照iso10993-5标准制备粉体浸提液，所用提取溶剂为dmem或pbs，纯casio3粉体用于制备含si离子浸提液，纯sro粉体用于制备含sr离子浸提液，最后将浸提原液通过dmem或pbs梯度配比稀释。
在不影响本发明的目的的情况下，所述离子试剂中还可以含有其它组分。
在此公开的离子试剂可用于“离子疗法”，即，将该离子试剂注射入人或动物中，可以促进受损心肌功能恢复以及心血管的再生，治疗心肌梗死。注射方式可为静脉注射等。
以下，说明获得离子试剂的最优作用浓度的步骤以及“离子疗法”对心肌梗死的治疗效果。
在此，通过含不同浓度生物活性离子(例如si、sr离子)浸提液培养细胞的方法，探究了生物活性离子(例如si、sr离子)促进nrcms活性保持的最优浓度，并发现离子试剂在此浓度下能抑制心肌细胞凋亡，促进细胞间信号交流，通过旁分泌效应促进血管再生以及受损心脏功能恢复。该离子试剂及“离子疗法”具有制备工艺简单易行、成本低廉、且便于推广等优点。
一个实施方式中，获得si(图1)、sr(图11)离子试剂促进nrcms活性维持的最优作用浓度的步骤以及si、sr离子试剂在此浓度下对nrcms凋亡，信号交流，成血管和受损心肌功能恢复的影响包括以下步骤。其它离子试剂亦可采用该步骤。
(1)含不同浓度si、sr离子浸提液的制备。
(2)将步骤(1)中获得的含si、sr离子浸提液培养nrcms，采用cck8法检测细胞活力，筛选促进nrcms活力保持的最优si、sr浓度。
(3)将步骤(2)中获得的促进nrcms活力保持的最优离子试剂培养nrcms和huvecs，采用tunel染色的方法检测nrcms的凋亡情况，采用蛋白分离和蛋白质印迹法检测nrcms凋亡相关的mapk家族蛋白和cleaved-casepase3蛋白的表达情况，采用cx43免疫荧光染色，蛋白质印迹法和sybrgreen荧光实时定量pcr来检测与nrcms细胞间隙连接相关的cx43蛋白和基因的表达，采用vwf免疫荧光染色和sybrgreen荧光实时定量pcr来检测nrcms-huvecs共培养的成血管情况，进一步的采用动物实验，将离子试剂静脉注射4周后，检测离子试剂对于大鼠心梗后的心脏功能恢复和血管再生的影响。
本发明利用具有生物相容性的液体(例如pbs或dmem)与生物活性离子(例如si、sr离子)复配，得到了用于治疗心肌梗死的离子试剂，最终实现了心肌梗死后心脏功能修复，心血管重建的目的。继“干细胞疗法”，“组织工程疗法”之后，提出了“离子疗法”的新概念，经过反复实验验证，效果极佳。
本发明的有益效果：
(1)制备工艺简单易行；(2)成本低廉且便于推广；(3)提出了用于心肌梗死干预治疗的“离子疗法”的新概念；(4)治疗方法易操作且无二次伤害。
本发明为心肌梗死的治疗提出了新的可行方法—“离子疗法”，可以用于心肌梗死的科学研究和临床治疗等。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
以下实施例中，casio3(简称cs)以分析纯ca(no3)2·4h2o(购自国药)和na2sio3·9h2o(购自国药)为原料，采用化学沉淀法制备casio3粉体。首先将na2sio3·9h2o，ca(no3)2·4h2o分别溶于去离子水中，配制成浓度均为0.5mol·l-1的水溶液，再将ca(no3)2溶液缓慢滴入强烈搅拌的na2sio3溶液中，直到滴加完毕。继续搅拌24小时，将反应所得沉淀过滤，用去离子水及无水乙醇各洗涤3次后置于60℃恒温干燥箱内干燥48小时。最后将所得的前驱体粉体在900℃煅烧2小时，再经过研磨过200目筛，得到纯度大于99％，粒径小于70μm的casio3粉体。sro购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，型号为1314-11-10，dmem购自美国应用生物系统公司，型号为11320-022。pbs购自生工生物工程(上海)股份有限公司，型号为e607008-0500。
实施例1：
“si离子疗法”对心肌细胞和心肌梗死后心脏功能恢复的影响：
(1)si离子试剂的制备
按照iso10993-5标准制备casio3浸提液。以粉体和dmem或pbs质量体积比200mgml-1将粉体添加到浸提溶剂中，密封置于37℃恒温摇床中浸提24h，4000rpm离心10min，取上清液并经过0.22μm滤菌膜过滤后得到200mgml-1casio3浸提原液。将200mgml-1的casio3浸提原液用dmem或pbs稀释至1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128以及1/256，置于4℃冰箱待用，并通过电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测得离子浓度(见表1)。
表1梯度稀释si浸提液中的si浓度(μgml-1)
(2)si离子试剂对nrcms活力的影响(体外)
常氧状态：以1.5×104个细胞/孔的密度将nrcms接种到96孔细胞培养板中，每个组分设置6个平行孔实验，使用nrcms完全培养基培养的对照组作为空白对照(control)，si离子dmem浸提液作为实验组。细胞贴壁96h后，将培养基换成100μl/孔的梯度稀释的si离子dmem浸提液完全培养基和空白对照组培养基继续培养，并隔天换液。到达预设时间的1、3和5天后，采用cck8法检测细胞活性。
低氧/低糖状态：以1.5×104个细胞/孔的密度将nrcms接种到96孔细胞培养板中，每个组分设置6个平行孔实验，使用pbs培养的对照组作为空白对照(control)，si离子pbs浸提液作为实验组。细胞贴壁96h后，将培养基换成100μl/孔的梯度稀释的si离子pbs浸提液完全培养基和空白对照组培养基继续培养。到达预设时间的60min和120min后，采用cck8法检测细胞活性。
图1显示，在常氧状态下(a)si离子dmem浸提液在稀释至1/64～1/8之间，对照表1，si离子浓度在1.63～13.32μgml-1能够明显提高nrcms活性。在低氧/低糖状态下(b)，nrcms活性明显下降，si离子pbs浸提液在稀释至1/64～1/8之间，对照表1，si离子浓度在4.53～34.84μgml-1能够明显促进细胞活性保持，并且si离子浓度在4.53～9.08μgml-1处具有极明显的促进细胞活性保持效果，进一步优选得到了si离子pbs浸提液在稀释至1/64，也就是si离子浓度在4.53±0.18μgml-1的pbs浸提液进行接下来的实验探究。
(3)si离子试剂对nrcms凋亡的影响(体外)
低氧/低糖状态：以5×105个细胞/孔的密度将nrcms接种到6孔细胞培养板中，每个组分设置3个平行孔实验，使用pbs培养的对照组作为空白对照(control)，si离子pbs浸提液(1/64)作为实验组。细胞贴壁96h后，将培养基换成2ml/孔的si离子pbs浸提液(1/64)和空白对照组培养基继续培养。到达预设时间的60min和120min后，采用tunel荧光染色法定性检测细胞活性，并定量统计tunel-阳性细胞数量。进一步采用蛋白分离和蛋白质印迹法检测nrcms凋亡相关的mapk家族蛋白和cleaved-casepase3蛋白的表达情况。
图2显示，在低氧/低糖状态下，随着培养时间的延长nrcms凋亡数目越来越多，si离子pbs试剂(si:4.53±0.18μgml-1)可以有效抑制心肌细胞凋亡。
图3显示，培养90min后si离子试剂可以有效抑制p38蛋白表达(a,b)，并在培养90min和120min后促进erk1/2蛋白表达(a,b)，同时抑制cleaved-casepase3蛋白的表达(c,d)，进一步说明了si离子pbs浸提液在此浓度能够通过调控细胞凋亡相关蛋白的表达而减缓心肌细胞凋亡，从而使受损心肌细胞启动自我保护机制。
(4)si离子试剂对nrcms间信号交流的影响(体外)
低氧/低糖状态：以5×105个细胞/孔的密度将nrcms接种到6孔细胞培养板中，每个组分设置3个平行孔实验，使用pbs培养的对照组作为空白对照(control)，si离子pbs浸提液(1/64)作为实验组。细胞贴壁96h后，将培养基换成2ml/孔的si离子pbs浸提液(1/64)和空白对照组培养基继续培养。到达预设时间的60min和120min后，采用cx43免疫荧光染色，蛋白质印迹法和sybrgreen荧光实时定量pcr来检测与nrcms细胞间隙连接相关的cx43蛋白和基因的表达。
图4免疫荧光染色(a)的结果显示低氧/低糖状态抑制了cx43的表达，而si离子在此浓度能够减弱低糖/低糖的抑制效应。通过蛋白表达(b,c)和基因表达(d)的结果，进一步说明了si离子在此浓度能够上调cx43蛋白和基因表达。因此si离子在此浓度能够促进细胞之间的信号交流，进而有利于受损心肌的功能修复。
(5)si离子试剂对vegf调控的成血管的影响(体外)
低氧/低糖状态：采用分层共培养(康宁,直径12mm,12孔)的方法，nrcms以5×104个细胞/孔的密度种在培养孔的上层，huvecs以5×104个细胞/孔的密度种在培养孔的下层，每个组分设置3个平行孔实验，使用pbs培养的对照组作为空白对照(control)，si离子pbs浸提液(1/64)作为实验组。细胞贴壁96h后，将培养基换成1ml/孔的si离子pbs浸提液(1/64)和空白对照组培养基继续培养。到达预设时间的60min和120min后，采用vwf免疫荧光染色和sybrgreen荧光实时定量pcr来检测nrcms-huvecs共培养的成血管情况。
图5中vwf染色(a)和血管环定量(b)的结果显示si离子pbs浸提液在此浓度能够显著地促进共培养体系成血管。共培养体系中vegf(c,d)和kdr(e)基因的表达结果显示，共培养的nrcms通过旁分泌效应分泌的vegfa和共培养的huvecs通过自分泌效应分泌的vegf165均能促进血管再生，同时旁分泌效应在促进心肌梗死后血管重建中发挥了重要作用。
(6)“si离子疗法”对心肌梗死后心脏功能恢复的影响(体内)
大鼠急性心肌梗塞模型通过左前降枝急性冠状动脉血栓手术建立。采用静脉注射的方法将si离子pbs浸提液(1/64)以200μl/次的量注入大鼠体内，隔天注射一次，连续注射两周。4周后采用超声心动描记术考察心脏功能，采用masson三色染色考察心肌组织结构，采用免疫荧光染色和蛋白表达考察心肌形貌，心肌细胞凋亡，心肌细胞信号交流和心肌血管化程度。
图6-9显示出实施例1所得si离子试剂治疗心肌梗死的动物实验结果。如图所示，si离子试剂促进了心梗部位心脏功能的恢复(图6)，减缓了心肌细胞凋亡(图7)，促进了心肌细胞间的信号交流(图8)，以及新生血管的形成(图9)，说明si离子试剂具有促进心肌梗死后组织修复和促成血管的诱导活性。
实施例2：
“sr离子疗法”对心肌细胞的影响：
(1)sr离子试剂的制备
按照iso10993-5标准制备sro浸提液。以粉体和dmem质量体积比200mgml-1将粉体添加到浸提溶剂中，密封置于37℃恒温摇床中浸提24h，4000rpm离心10min，取上清液并经过0.22μm滤菌膜过滤后得到200mgml-1sro浸提原液。将200mgml-1的sro浸提原液用dmem稀释至1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128以及1/256，置于4℃冰箱待用，并通过电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测得离子浓度(见表2)。
(2)sr离子试剂对nrcms活性的影响(体外)
常氧状态：以1.5×104个细胞/孔的密度将nrcms接种到96孔细胞培养板中，每个组分设置6个平行孔实验，使用nrcms完全培养基培养的对照组作为空白对照(control)，sr离子dmem浸提液作为实验组。细胞贴壁96h后，将培养基换成100μl/孔的梯度稀释的sr离子dmem浸提液完全培养基和空白对照组培养基继续培养，并隔天换液。到达预设时间的1、3和7天后，采用cck8法检测细胞活性。
图10显示，在常氧状态下sr离子dmem浸提液在稀释至1～1/256之间，对照表2，sr离子浓度在0.63～160μgml-1能够明显提高nrcms活性。并且sr离子浓度在5～40μgml-1处具有极明显的促进细胞活性保持效果，进一步优选得到了sr离子dmem浸提液在稀释至1/8，也就是sr离子浓度在20μgml-1具有最佳的保持活性作用。
表2梯度稀释sr浸提液中的sr浓度(μgml-1)
(3)sr离子试剂对nrcms凋亡的影响(体外)
常氧状态：以5×105个细胞/孔的密度将nrcms接种到6孔细胞培养板中，每个组分设置3个平行孔实验，使用pbs培养的对照组作为空白对照(control)，sr离子dmem浸提液(1/8)作为实验组。细胞贴壁96h后，将培养基换成2ml/孔的sr离子dmem浸提液(1/8)和空白对照组培养基继续培养。到达预设时间的3天后，采用sybrgreen荧光实时定量pcr来检测nrcms凋亡相关基因表达的情况。
图11显示，在常氧状态下，sr离子dmem浸提液在sr离子浓度为5～80μgml-1可以有效促进bcl-2基因表达(a)，并抑制c-casepase3基因表达(b)，并且sr离子浓度在20～80μgml-1处具有极明显的效果，进一步优选得到了sr离子dmem浸提液在sr离子浓度为20μgml-1具有最佳的促进bcl-2表达并抑制c-casepase3基因表达的作用，进一步说明了sr离子在一定浓度范围能够通过调控细胞凋亡相关基因的表达而减缓心肌细胞凋亡，从而使受损心肌细胞启动自我保护机制。
(4)sr离子试剂对vegf调控的成血管的影响(体外)
常氧状态：采用分层共培养(康宁,直径12mm,12孔)的方法，nrcms以5×104个细胞/孔的密度种在培养孔的上层，huvecs以5×104个细胞/孔的密度重在培养孔的下层，每个组分设置3个平行孔实验，使用pbs培养的对照组作为空白对照(control)，sr离子dmem浸提液(1/8)作为实验组。细胞贴壁96h后，将培养基换成1ml/孔的sr离子dmem浸提液(1/8)和空白对照组培养基继续培养。到达预设时间3天后，采用sybrgreen荧光实时定量pcr来检测nrcms-huvecs共培养的成血管基因表达情况。
图12中，共培养体系vegf(a,b)和kdr(c)基因的表达结果显示，在sr离子的刺激下，共培养的nrcms和huvecs能够分别通过旁分泌和自分泌效应分泌vegf，并一步作用于huvecs，促进kdr的基因表达，进而促进成血管，且sr离子在浓度为20μgml-1处具有最佳的作用效果。