本发明属于软骨组织修复领域，具体涉及一种多功能分层关节软骨支架的制备方法。
背景技术：
关节软骨几乎没有自我修复的能力，软骨损伤往往是不可逆的，常会引起骨性关节炎，甚至危及生命。关节部位骨软骨复合组织缺损已经成为肢体残障的主要原因之一。
目前主要采用植入替代物的方式治疗关节软骨病损，替代物主要包括自体或异体组织、人工软骨等等。其中自体或者异体组织存在来源受限、外形匹配困难等难题，而人工软骨由于其原料来源广，生物适应性好，有着广泛的发展空间。人工软骨有仿生材料和组织工程等制备方法，组织工程以其生物适应性好、可发育、可个性化定制等特点，代表了骨软骨修复未来的方向。
在组织工程领域，人工软骨的制备已经有了广泛的研究。关节软骨生理结构特殊，由软骨层，软骨下骨层及其之间的钙化层三部分构成。软骨下骨层氧和营养含量丰富，而软骨层无血管、神经及淋巴，仅包含单一软骨细胞，并且处于低氧和低营养环境，其微环境的维持与他们之间致密的钙化层有关。钙化层厚度极薄，结构连接较紧密，组织致密，在软骨层和软骨下骨层之间起到了连接和缓冲作用。在钙化层和血管抑制因子的双重阻隔下，血管难以入侵软骨层，有效的防止了软骨内骨化。
目前有多种方法用于人工软骨的制备，比较常用的是使用“支架+细胞”的方法制备出软骨支架，然后使用机械连接的方法将其固定到待修复部位。
公开号为cn104399119a的专利公布了一种使用软骨干细胞和支架材料打印软骨组织的方法，该方法主要使用pcl作为支架材料，将含软骨干细胞凝胶的打印到pcl支架上，该方法可以实现细胞在软骨组织中的梯度分布，有较好的力学性能。但是该方法制备的软骨组织缺乏与硬骨组织的之间的过渡层，在软骨和硬骨的结合面产生了结构的突变，导致所制备的人工软骨难以同硬骨紧密的生长连接到一起；其次该方法制备的软骨组织采用单一干细胞分化发育的方式，同时由于缺乏与硬骨之间的过渡层，植入体内后，软骨层难以缺乏阻挡来自硬骨的血管入侵，血管的入侵会诱导骨髓间充质干细胞往硬骨的方向分化，导致软骨内骨化，丧失其功能。
公开号为cn105435311a的专利公布了一种组织工程软骨复合支架及其制备方法。该方法使用可降解生物材料作为支架材料，并按照关节软骨的结构，制备出了多功能的分层人工软骨支架。该方法首先将支架材料和细胞混合，形成凝胶，然后将凝胶注入四氟乙烯模具，制备出具备特定形状的人工软骨。通过将不同的原料依次注入四氟乙烯模具，可制备出具有分层结构的人工软骨。该方法简单易行，在一定程度上实现了软骨的结构仿生。但是由于采用的是原料混合之后再浇铸成型的方法，导致支架中各层的成分分布均一，不能实现人工软骨中细胞密度的仿生分布。
组织结构是发挥组织功能的基础，人工软骨不仅要能够模拟天然软骨的分层结构和内部细胞分布，还要能够在植入生物体后同周围的组织融合、生长到一起。这就要求所制备的软骨在结构上具有高的精度，在成分上具备高的仿生度。3d打印技术能够精准的复制天然软骨的结构，在人工软骨的制备上具备独天得厚的优势。
技术实现要素：
为了克服现有技术制备的关节软骨难以同时具备精准的空间结构和生物性能的缺陷，本发明提出一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，以水凝胶为支架材料，以骨髓间充质干细胞、软骨细胞和成骨细胞为诱导、发育对象，采用3d打印技术来制备模拟天然软骨生物性能和机械性能的多功能分层关节软骨支架。
本发明的技术方案为：
所述一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：获取待打印软骨组织的三维模型，并分离出软骨层、钙化层、软骨下骨层的三维模型；分别对软骨层、钙化层、软骨下骨层的三维模型进行分层切片处理，其中软骨层分为n1层，钙化层分为n2层，软骨下骨层分为n3层，获取分层截面数据。
步骤2：培养软骨细胞，获取细胞密度为5×106cells/ml～7×106cells/ml的软骨细胞悬液；培养骨髓间充质干细胞，制备细胞密度为4×106cells/ml～7×106cells/ml的骨髓间充质干细胞悬液；培养成骨细胞，获取细胞密度为3×106cells/ml～6×106cells/ml的成骨细胞悬液。
这里控制悬液细胞密度为对应生物组织中细胞密度的110％-140％。申请人发现，如果简单的按照生物组织中细胞密度直接配置相应密度的细胞悬液，则会在打印过程中，因为需要打印大量的细胞悬浮液而增加打印时间，减小细胞存活率；所以需要在生物组织中细胞密度的基础上，提高一定密度来配置细胞悬液，但细胞密度又不能过高，实验发现，密度过高会增加细胞培养的难度，同时打印过程中造成一个液滴中含有多个细胞等问题，影响打印精度。
步骤3：制备水凝胶支架基体材料h1组和h2组；基体材料包括去离子水、海藻酸钠、明胶；h1组中海藻酸钠质量分数为2.5％～3.5％，明胶质量分数为0.8％～1.1％；h2组中海藻酸钠质量分数为4.5％～5.5％，明胶质量分数为1.1％～1.5％；并在水凝胶支架基体材料中加入质量分数为0.8％～1.2％的抗生素。
这里对海藻酸钠的质量分数有特定的要求，其中海藻酸钠质量分数过高会造成溶液流动性差，难以挤压打印，还会缩小凝胶微孔直径，不利于细胞生存；海藻酸钠质量分数过低会造成打印的组织的强度低，弹性差，不满足软骨组织力学性能要求。当然，由于h1组和h2组分别用于制备不同的软骨结构，所以h1组和h2组中的海藻酸钠质量分数不同，但h1组和h2组中海藻酸钠质量分数不能超出各自限定的范围。
步骤4：取h1组水凝胶支架基体材料，加入血管抑制因子，得到软骨层水凝胶支架材料，控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，逐层打印软骨层：
步骤4.1：按照软骨层的分层截面数据打印一层软骨层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的氯化钙进行固化；
步骤4.2：将步骤2中制备的软骨细胞悬液按照软骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨层水凝胶支架上；
步骤4.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液按照软骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨层水凝胶支架上；
步骤4.4：重复步骤4.1～步骤4.3，直到软骨层打印完毕。
步骤5：取h2组水凝胶支架基体材料作为钙化层水凝胶支架材料；采用二氯甲烷与乙醇做溶剂，配置质量分数为3.5％～4.5％的pcl溶液作为静电纺丝材料；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，在步骤4打印完毕的软骨层上逐层打印钙化层；
步骤5.1：按照钙化层的分层截面数据打印一层钙化层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的氯化钙进行固化；
步骤5.2：采用静电纺丝材料在固化后的钙化层水凝胶支架上制备一层纳米纤维层；
步骤5.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液打印到纳米纤维层上；
步骤5.4：重复步骤5.1～步骤5.3，直到钙化层打印完毕。
步骤6：取h1组水凝胶支架基体材料，加入质量分数为2.5％～3.5％的纳米羟基磷灰石，加入血管内皮生长因子a、促进骨生成蛋白生长因子，得到软骨下骨层水凝胶支架材料；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，在步骤5打印完毕的钙化层上逐层打印软骨下骨层：
步骤6.1：按照软骨下骨层的分层截面数据打印一层软骨下骨层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的氯化钙进行固化；
步骤6.2：将步骤2中制备的成骨细胞悬液按照软骨下骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨下骨层水凝胶支架上；
步骤6.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液按照软骨下骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨下骨层水凝胶支架上；
步骤6.4：重复步骤6.1～步骤6.3，直到软骨下骨层打印完毕。
在步骤4～步骤6中均采用了质量分数3％～5％的氯化钙对水凝胶进行固化，这里氯化钙的质量分数不能超出限定范围，主要因为氯化钙浓度过高会造成软骨支架脱水率增加，不利于细胞生存，氯化钙浓度过低会导致软骨支架交联反应不完全，造成软骨组织机械强度过低。
步骤7：将打印完成的软骨组织放入9.5％～10.5％fbs高糖培养基，移入36.8℃～37.2℃，6.8％～7.2％o2，4.9％～5.1％co2的细胞培养箱中培养。
进一步的优选方案，所述一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，其特征在于：步骤3中制备水凝胶支架基体材料h1组和h2组后，放入45℃恒温环境中保存。
这里对温度做进一步的限定，主要是申请人在研究过程发现，明胶具有温敏性，高于40℃时候，整个溶液粘度较低，利于挤压打印，而低于40℃便形成粘度较大的胶体；所以，选择恰当的保存温度，既可以提高固化后的强度，同时会加快固化速度。此外，对于明胶质量分数进行的限定，主要因为当明胶量低于限定范围时，难以促进软骨支架快速固化，而明胶量高于限定范围时，也会缩小软骨支架微孔直径，不利于细胞生存。
进一步的优选方案，所述一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，其特征在于：三维成型设备具有压电打印喷头和挤压打印喷头，其中水凝胶支架材料采用挤压打印喷头打印，细胞悬液采用压电打印喷头打印。
进一步的优选方案，所述一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，其特征在于：步骤4.1、步骤5.1以及步骤6.1中采用挤压打印喷头打印水凝胶支架材料前，先将挤压打印喷头喷嘴处的低温水凝胶排出后，再进行打印；步骤4.2、步骤4.3、步骤5.3、步骤6.2、步骤6.3中采用压电打印喷头打印细胞悬液前的空闲期间，保持细胞悬液低频振荡，且每隔30s～40s将压电打印喷头喷嘴处的细胞悬液排出至废液槽。
这里进行进一步限定的主要原因是，申请人在实际使用过程中发现，如果仅仅是简单的一层水凝胶一层细胞往复打印，由于挤压喷头和压电喷头处于交替工作状态，在挤压打印空闲期，喷嘴冷却导致喷嘴处水凝胶固化，再次打印时难以同之前打印的组织结合；在细胞打印空闲期：细胞悬液停止运动造成细胞沉降，不仅导致细胞悬液内细胞分布不均匀，还容易造成细胞堆积堵塞压电喷头；为解决上述问题，提出了上述限定特征。
进一步的优选方案，所述一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，其特征在于：血管抑制因子为软骨调节素-i。
进一步的优选方案，所述一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，其特征在于：步骤4.2中，通过控制三维成型设备压电打印喷头的打印频率，实现软骨层同一分层截面中不同区域软骨细胞密度分布；步骤6.2中，通过控制三维成型设备压电喷头的打印频率，实现软骨下骨层同一分层截面中不同区域成骨细胞密度分布。
进一步的优选方案，所述一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，其特征在于：三维成型设备压电打印喷头的打印频率不超过3khz。
这里对打印频率进行进一步限定的主要原因是，过高的打印频率会导致喷头堵塞。
进一步的优选方案，所述一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，其特征在于：采用质量分数3％～5％的氯化钙进行喷雾固化时，氯化钙溶液温度1℃～10℃。
通过控制氯化钙雾化量，可以控制软骨支架的强度，实现软骨支架力学梯度分布。氯化钙使水凝胶发生交联反应，提高组织强度。而且喷洒氯化钙降温会加快水凝胶固化过程，将温度快速降低到适合细胞打印的范围。
进一步的优选方案，所述一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，其特征在于：pcl溶液中二氯甲烷与乙醇的比例是6:3～8:3。
进一步的优选方案，所述一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，其特征在于：步骤5.2制备的纳米纤维层厚度为5-10微米。
有益效果
与现有技术相比，本发明具有显著的优点：
(1)本发明制备的人工软骨具有多层结构，结合3d打印技术，可以精确模拟天然软骨各个分层的内部组织形态和外形轮廓，实现不同的分层具有不同的力学和生物特性。所制备的人工软骨支架细胞来源于患者，支架为可降解水凝胶材料，大大减少了植入之后的排异反应。各种营养物质和生长因子混合在水凝胶支架中，还可以起到缓释的作用，实现对人工软骨生长发育的调控。
(2)软骨层以软骨细胞为主，骨髓间充质干细胞为辅的结构，相比单纯的干细胞培养模式，减少了细胞分化，加快了软骨支架的培养速度，同时还减少了软骨支架培育中诱导分化的难度和分化过程中的不确定因素。同时添加少量的骨髓间充质干细胞，并且添加血管抑制因子，可以阻止血管入侵软骨层，防止软骨内骨化，还可以诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞，补充在后期培养和植入过程中损失的软骨细胞。
(3)钙化层采用强度更高的水凝胶基体材料，并且加入纳米纤维层，一方面能够大大提高钙化层的密度，使软骨支架结合更为紧密，提高力学强度；另一方面能够阻碍钙化层两侧的细胞和营养物质的流动，为软骨层和软骨下骨层分别构建不同的生物微环境。
(4)纳米羟基磷灰石具有促骨活化，诱导骨细胞生长的功效。而血管内皮生长因子能够诱导骨髓间充质干细胞支架往血管化和骨化方向分化。软骨下骨层中加入纳米羟基磷灰石和血管内皮生长因子，能够促进软骨支架同周围硬骨的融合。
(5)采用低浓度氧气培育细胞，能够有效的促进细胞的增殖，缩短软骨支架的培养时间。
(6)相比于细胞密度均一的细胞水凝胶混合基质浇注成型的方法，本方法能够通过控制压电喷头的打印频率，进一步实现在同一分层截面中不同位置上细胞密度的梯度可控分布。
(7)本发明在制备细胞悬液时，控制悬液细胞密度为对应生物组织中细胞密度的110％-140％。这样选择的优点在于：若细胞密度过低，则需要打印大量的细胞悬浮液，增加打印时间，减小细胞存活率；而细胞密度过高，会增加细胞培养的难度，同时打印过程中造成一个液滴中含有多个细胞等问题，影响打印精度。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施实例1：
本实施实例采用鼠膝关节人工软骨的制备，来描述一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1、获取待打印软骨组织的三维模型，使用计算机处理，分离出软骨层、钙化层、软骨下骨层的三维模型。分别对软骨层、钙化层、软骨下骨层的三维模型进行分层切片处理，层厚为0.1mm，其中软骨层总共分为n1层，钙化层软骨层总共分为n2层，软骨下骨层总共分为n3层，获取分层截面数据。
步骤2：在高糖dmem培养液中培养软骨细胞，获取细胞密度为5×106cells/ml的软骨细胞悬液；在高糖dmem培养液中低氧(5％o2)培养骨髓间充质干细胞，制备细胞密度为7×106cells/ml的骨髓间充质干细胞悬液；在高糖dmem培养液中培养成骨细胞，获取细胞密度为5×106cells/ml的成骨细胞悬液。
步骤3：制备水凝胶支架基体材料h1组和h2组；基体材料包括去离子水、海藻酸钠、明胶；h1组中海藻酸钠质量分数为3％，明胶质量分数为1％；h2组中海藻酸钠质量分数为5％，明胶质量分数为1.2％；并在h1组，h2组水凝胶支架基体材料中加入质量分数为1％的庆大霉素，放入45℃恒温环境保存。
步骤4：取h1组水凝胶支架基体材料，加入血管抑制因子软骨调节素-i，质量分数为100ng/ml，得到软骨层水凝胶支架材料，将软骨层水凝胶支架材料装入挤压打印喷头的储液腔，温度为45℃，将软骨细胞悬液装入第一压电打印喷头储液腔，将骨髓间充质干细胞悬液装入第二压电打印喷头储液腔，温度为35℃；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，逐层打印软骨层。
步骤4.1：按照软骨层的分层截面数据打印一层软骨层水凝胶支架，然后采用质量分数4％的氯化钙进行固化，氯化钙溶液温度2℃；
步骤4.2：将步骤2中制备的软骨细胞悬液按照软骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨层水凝胶支架上；通过控制压电喷头的打印频率，能够实现软骨层同一分层截面中不同区域软骨细胞密度梯度分布。
步骤4.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液按照软骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨层水凝胶支架上；
步骤4.4：重复步骤4.1～步骤4.3，直到软骨层打印完毕。
步骤5：取h2组水凝胶支架基体材料作为钙化层水凝胶支架材料；采用7:3的二氯甲烷与乙醇做溶剂，配置质量分数为4％的pcl溶液作为静电纺丝材料；将钙化层水凝胶支架材料装入挤压打印喷头的储液腔，温度为45℃，将骨髓间充质干细胞悬液装入第一或第二压电打印喷头储液腔，温度为35℃；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，在步骤4打印完毕的软骨层上逐层打印钙化层；
步骤5.1：按照钙化层的分层截面数据打印一层钙化层水凝胶支架，然后采用质量分数4％的氯化钙进行固化；氯化钙溶液温度2℃；
步骤5.2：采用静电纺丝材料在固化后的钙化层水凝胶支架上制备一层纳米纤维层；纳米纤维层的厚度为5-10微米；
步骤5.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液打印到纳米纤维层上；
步骤5.4：重复步骤5.1～步骤5.3，直到钙化层打印完毕。
步骤6：取h1组水凝胶支架基体材料，加入质量分数为3％的纳米羟基磷灰石，加入质量分数为50ng/ml的血管内皮生长因子a以及质量分数为5ng/ml的bmp-2促进骨生成蛋白生长因子，得到软骨下骨层水凝胶支架材料；将软骨下骨层水凝胶支架材料装入挤压打印喷头的储液腔，温度为45℃，将成骨细胞悬液装入第一压电打印喷头储液腔，将骨髓间充质干细胞悬液装入第二压电打印喷头储液腔，温度为35℃；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，在步骤5打印完毕的钙化层上逐层打印软骨下骨层：
步骤6.1：按照软骨下骨层的分层截面数据打印一层软骨下骨层水凝胶支架，然后采用质量分数4％的氯化钙进行固化，氯化钙溶液温度2℃；
步骤6.2：将步骤2中制备的成骨细胞悬液按照软骨下骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨下骨层水凝胶支架上；其中通过控制压电喷头的打印频率，实现软骨下骨层同一分层截面中不同区域成骨细胞密度分布；
步骤6.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液按照软骨下骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨下骨层水凝胶支架上；
步骤6.4：重复步骤6.1～步骤6.3，直到软骨下骨层打印完毕。
在上述步骤4、5、6中，由于挤压喷头和压电喷头处于交替工作状态，在挤压打印空闲期，喷嘴冷却导致喷嘴处水凝胶固化，再次打印时难以同之前打印的组织结合；在细胞打印空闲期：细胞悬液停止运动造成细胞沉降，不仅导致细胞悬液内细胞分布不均匀，还容易造成细胞堆积堵塞压电喷头；为了解决该问题，在步骤4.1、步骤5.1以及步骤6.1中采用挤压打印喷头打印水凝胶支架材料前，先将挤压打印喷头喷嘴处的低温水凝胶排出后，再进行打印；而在步骤4.2、步骤4.3、步骤5.3、步骤6.2、步骤6.3中采用压电打印喷头打印细胞悬液前的空闲期间，保持细胞悬液低频振荡，且每隔30s～40s将压电打印喷头喷嘴处的细胞悬液排出至废液槽。而且压电打印喷头的打印频率不超过3khz，以防止过高的打印频率导致喷头堵塞。
步骤7：将打印完成的软骨组织放入10％fbs高糖培养基，移入37℃，7％o2，5％co2的细胞培养箱中培养3周。
实施实例2：
本实施实例采用兔膝关节人工软骨的制备，来描述一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1、获取待打印软骨组织的三维模型，使用计算机处理，分离出软骨层、钙化层、软骨下骨层的三维模型。分别对软骨层、钙化层、软骨下骨层的三维模型进行分层切片处理，层厚为0.1mm，其中软骨层总共分为n1层，钙化层软骨层总共分为n2层，软骨下骨层总共分为n3层，获取分层截面数据。
步骤2：在高糖dmem培养液中培养软骨细胞，获取细胞密度为7×106cells/ml的软骨细胞悬液；在高糖dmem培养液中低氧(5％o2)培养骨髓间充质干细胞，制备细胞密度为7×106cells/ml的骨髓间充质干细胞悬液；在高糖dmem培养液中培养成骨细胞，获取细胞密度为6×106cells/ml的成骨细胞悬液。
步骤3：制备水凝胶支架基体材料h1组和h2组；基体材料包括去离子水、海藻酸钠、明胶；h1组中海藻酸钠质量分数为3.5％，明胶质量分数为1.2％；h2组中海藻酸钠质量分数为5.5％，明胶质量分数为1.5％；并在h1组，h2组水凝胶支架基体材料中加入质量分数为1％的庆大霉素，放入45℃恒温环境。
步骤4：取h1组水凝胶支架基体材料，加入血管抑制因子软骨调节素-i，质量分数为100ng/ml，得到软骨层水凝胶支架材料，将软骨层水凝胶支架材料装入挤压打印喷头的储液腔，温度为45℃，将软骨细胞悬液装入第一压电打印喷头储液腔，将骨髓间充质干细胞悬液装入第二压电打印喷头储液腔，温度为35℃；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，逐层打印软骨层。
步骤4.1：按照软骨层的分层截面数据打印一层软骨层水凝胶支架，然后采用质量分数3％的氯化钙进行固化，氯化钙溶液温度4℃；
步骤4.2：将步骤2中制备的软骨细胞悬液按照软骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨层水凝胶支架上；通过控制压电喷头的打印频率，能够实现软骨层同一分层截面中不同区域软骨细胞密度梯度分布。
步骤4.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液按照软骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨层水凝胶支架上；
步骤4.4：重复步骤4.1～步骤4.3，直到软骨层打印完毕。
步骤5：取h2组水凝胶支架基体材料作为钙化层水凝胶支架材料；采用6:3的二氯甲烷与乙醇做溶剂，配置质量分数为4.5％的pcl溶液作为静电纺丝材料；将钙化层水凝胶支架材料装入挤压打印喷头的储液腔，温度为45℃，将骨髓间充质干细胞悬液装入第一或第二压电打印喷头储液腔，温度为35℃；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，在步骤4打印完毕的软骨层上逐层打印钙化层；
步骤5.1：按照钙化层的分层截面数据打印一层钙化层水凝胶支架，然后采用质量分数3％的氯化钙进行固化，氯化钙溶液温度4℃；
步骤5.2：采用静电纺丝材料在固化后的钙化层水凝胶支架上打印一层纳米纤维层；纳米纤维层的厚度为5-10微米；
步骤5.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液打印到纳米纤维层上；
步骤5.4：重复步骤5.1～步骤5.3，直到钙化层打印完毕。
步骤6：取h1组水凝胶支架基体材料，加入质量分数为3.5％的纳米羟基磷灰石，加入质量分数为60ng/ml的血管内皮生长因子a以及质量分数为7ng/ml的bmp-2促进骨生成蛋白生长因子，得到软骨下骨层水凝胶支架材料；将软骨下骨层水凝胶支架材料装入挤压打印喷头的储液腔，温度为45℃，将成骨细胞悬液装入第一压电打印喷头储液腔，将骨髓间充质干细胞悬液装入第二压电打印喷头储液腔，温度为35℃；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，在步骤5打印完毕的钙化层上逐层打印软骨下骨层：
步骤6.1：按照软骨下骨层的分层截面数据打印一层软骨下骨层水凝胶支架，然后采用质量分数3％的氯化钙进行固化，氯化钙溶液温度4℃；
步骤6.2：将步骤2中制备的成骨细胞悬液按照软骨下骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨下骨层水凝胶支架上；其中通过控制压电喷头的打印频率，实现软骨下骨层同一分层截面中不同区域成骨细胞密度分布；
步骤6.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液按照软骨下骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨下骨层水凝胶支架上；
步骤6.4：重复步骤6.1～步骤6.3，直到软骨下骨层打印完毕。
在上述步骤4、5、6中，由于挤压喷头和压电喷头处于交替工作状态，在挤压打印空闲期，喷嘴冷却导致喷嘴处水凝胶固化，再次打印时难以同之前打印的组织结合；在细胞打印空闲期：细胞悬液停止运动造成细胞沉降，不仅导致细胞悬液内细胞分布不均匀，还容易造成细胞堆积堵塞压电喷头；为了解决该问题，在步骤4.1、步骤5.1以及步骤6.1中采用挤压打印喷头打印水凝胶支架材料前，先将挤压打印喷头喷嘴处的低温水凝胶排出后，再进行打印；而在步骤4.2、步骤4.3、步骤5.3、步骤6.2、步骤6.3中采用压电打印喷头打印细胞悬液前的空闲期间，保持细胞悬液低频振荡，且每隔30s～40s将压电打印喷头喷嘴处的细胞悬液排出至废液槽。而且压电打印喷头的打印频率不超过3khz，以防止过高的打印频率导致喷头堵塞。
步骤7：将打印完成的软骨组织放入10％fbs高糖培养基，移入37℃，8％o2，5％co2的细胞培养箱中培养3周。
实施实例3：
本实施实例采用兔膝关节人工软骨的制备，来描述一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1、获取待打印软骨组织的三维模型，使用计算机处理，分离出软骨层、钙化层、软骨下骨层的三维模型。分别对软骨层、钙化层、软骨下骨层的三维模型进行分层切片处理，层厚为0.1mm，其中软骨层总共分为n1层，钙化层软骨层总共分为n2层，软骨下骨层总共分为n3层，获取分层截面数据。
步骤2：在高糖dmem培养液中培养软骨细胞，获取细胞密度为5×106cells/ml的软骨细胞悬液；在高糖dmem培养液中低氧(5％o2)培养骨髓间充质干细胞，制备细胞密度为4×106cells/ml的骨髓间充质干细胞悬液；在高糖dmem培养液中培养成骨细胞，获取细胞密度为3×106cells/ml的成骨细胞悬液。
步骤3：制备水凝胶支架基体材料h1组和h2组；基体材料包括去离子水、海藻酸钠、明胶；h1组中海藻酸钠质量分数为2.5％，明胶质量分数为0.8％；h2组中海藻酸钠质量分数为4.5％，明胶质量分数为1.1％；并在h1组，h2组水凝胶支架基体材料中加入质量分数为1％的庆大霉素，放入45℃恒温环境。
步骤4：取h1组水凝胶支架基体材料，加入血管抑制因子软骨调节素-i，质量分数为100ng/ml，得到软骨层水凝胶支架材料，将软骨层水凝胶支架材料装入挤压打印喷头的储液腔，温度为45℃，将软骨细胞悬液装入第一压电打印喷头储液腔，将骨髓间充质干细胞悬液装入第二压电打印喷头储液腔，温度为35℃；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，逐层打印软骨层。
步骤4.1：按照软骨层的分层截面数据打印一层软骨层水凝胶支架，然后采用质量分数5％的氯化钙进行固化，氯化钙溶液温度8℃；
步骤4.2：将步骤2中制备的软骨细胞悬液按照软骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨层水凝胶支架上；通过控制压电喷头的打印频率，能够实现软骨层同一分层截面中不同区域软骨细胞密度梯度分布。
步骤4.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液按照软骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨层水凝胶支架上；
步骤4.4：重复步骤4.1～步骤4.3，直到软骨层打印完毕。
步骤5：取h2组水凝胶支架基体材料作为钙化层水凝胶支架材料；采用8:3的二氯甲烷与乙醇做溶剂，配置质量分数为3.5％的pcl溶液作为静电纺丝材料；将钙化层水凝胶支架材料装入挤压打印喷头的储液腔，温度为45℃，将骨髓间充质干细胞悬液装入第一或第二压电打印喷头储液腔，温度为35℃；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，在步骤4打印完毕的软骨层上逐层打印钙化层；
步骤5.1：按照钙化层的分层截面数据打印一层钙化层水凝胶支架，然后采用质量分数5％的氯化钙进行固化，氯化钙溶液温度8℃；
步骤5.2：采用静电纺丝材料在固化后的钙化层水凝胶支架上打印一层纳米纤维层；纳米纤维层的厚度为5-10微米；
步骤5.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液打印到纳米纤维层上；
步骤5.4：重复步骤5.1～步骤5.3，直到钙化层打印完毕。
步骤6：取h1组水凝胶支架基体材料，加入质量分数为2.5％的纳米羟基磷灰石，加入质量分数为40ng/ml的血管内皮生长因子a以及质量分数为4ng/ml的bmp-2促进骨生成蛋白生长因子，得到软骨下骨层水凝胶支架材料；将软骨下骨层水凝胶支架材料装入挤压打印喷头的储液腔，温度为45℃，将成骨细胞悬液装入第一压电打印喷头储液腔，将骨髓间充质干细胞悬液装入第二压电打印喷头储液腔，温度为35℃；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，在步骤5打印完毕的钙化层上逐层打印软骨下骨层：
步骤6.1：按照软骨下骨层的分层截面数据打印一层软骨下骨层水凝胶支架，然后采用质量分数5％的氯化钙进行固化，氯化钙溶液温度8℃；
步骤6.2：将步骤2中制备的成骨细胞悬液按照软骨下骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨下骨层水凝胶支架上；其中通过控制压电喷头的打印频率，实现软骨下骨层同一分层截面中不同区域成骨细胞密度分布；
步骤6.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液按照软骨下骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨下骨层水凝胶支架上；
步骤6.4：重复步骤6.1～步骤6.3，直到软骨下骨层打印完毕。
步骤7：将打印完成的软骨组织放入10％fbs高糖培养基，移入37℃，7％o2，5％co2的细胞培养箱中培养3周。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。