长非编码RNAlinc00637的应用的制作方法

本发明涉及linc00637的新应用。

背景技术：

缺氧是肿瘤微环境的重要特性之一，核转录因子hif-1a是肿瘤细胞发生缺氧耐受反应的核心信号分子，

hif-1a通过结合位于基因启动子区的缺氧反应元件，激活靶基因的表达，导致肿瘤的适应性生存和肿瘤血管生成等生物学效应。研究表明，缺氧/hif-1a与肿瘤的发生和发展密切相关。该结果提示hif-1a为肿瘤治疗的潜在靶点。

虽然大量体外实验以及临床前实验数据均显示抑制hif-1a表达或活性可产生明显的抑瘤效果，但是，目前临床上尚无高效安全的hif-1a抑制剂。高效，安全的hif-1a抑制剂的挖掘依赖于对hif-1a调控机制的深入理解。然而，调控hif-1a降解的机制较为清楚，但是在转录以及翻译水平调控hif-1a的分子机制却知之甚少。无疑，新的hif-1a调控机制的研究可以成为肿瘤在缺氧环境下的治疗提供全新的靶点。

技术实现要素：

本发明提供了长非编码rnalinc00637的应用。

本发明长非编码rnalinc00637在制备抗肿瘤的靶向药物中的应用。

本发明从缺氧诱导基因hif-1a在肿瘤中表达角度出发，分析linc00637是否可以通过降低hif-1a的表达情况抑制肿瘤的发生和血管生成。研究发现linc00637可以通过结合prc2复合体抑制hif-1amrna表达，通过结合yb-1进而抑制yb-1与hif-1a5’-utr区的结合，抑制hif-1a翻译活性的调控作用，linc00637与两者结合可以高效特异地抑制hif-1a的表达。在裸鼠体内实验中进一步证实linc00637可以抑制hif-1a的表达从而发挥抑制肿瘤发生，血管生成和肿瘤转移的作用。在hct116对照组和过表达linc00637异种模型中，检测1至四周肿瘤的体积、肿瘤重量、血管数量和和血管内腔尺寸，过表达linc00637异种模型中肿瘤体积小93％，重量轻86％，血管数量减少57％和和血管内腔尺寸减小68％。

本发明首次发现，功能未知基因linc00637在hif-1a生物合成和转录水平上具有重要的抑制作用。linc00637可以成为潜在高效，安全的hif-1a抑制剂，该研究成果为靶向hif-1a提供了新的途径。

附图说明

图1为linc00637基因特征分析；

图2为linc00637在46对大肠癌、6对宫颈癌和17对肾癌组织中表达情况分析；

图3为3’和5’race实验图；

图4为linc00637在正常大肠组织和大肠癌组织中的长度和表达情况图；

图5为gapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)在正常大肠组织和大肠癌组织中的长度和表达情况图；

图6为在hct116细胞中linc00637核质分离实验图；其中a为细胞核，b为细胞质；

图7为在hela细胞中linc00637核质分离实验图；其中a为细胞核，b为细胞质；

图8为体外转录翻译实验图；

图9为hct116细胞中hif-1a和hif-2a在缺氧条件0、12和24小时下蛋白表达情况检测图；

图10为hela细胞中hif-1a和hif-2a在缺氧条件0、12和24小时下蛋白表达情况检测图；

图11为hct116细胞中linc00637在缺氧条件0、12和24小时下表达情况检测；

图12为hela细胞中linc00637在缺氧条件0、12和24小时下表达情况检测；

图13为hct116细胞中hif-1a和hif-2a在氧气浓度为百分之20、5和2的条件下蛋白表达情况检测图；

图14为hela细胞中hif-1a和hif-2a在氧气浓度为百分之20、5和2的条件下蛋白表达情况检测图；

图15为hct116细胞中linc00637在氧气浓度为百分之20、5和2的条件下表达情况检测图；

图16为hela细胞中linc00637在氧气浓度为百分之20、5和2的条件下表达情况检测图；

图17为hct116在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后hif-1amrna水平的变化情况；其中c为对照，d为linc00637；

图18为hela在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后hif-1amrna水平的变化情况；其中c为对照，d为linc00637；

图19为hct116和hela在缺氧条件下过表达linc00637后hif-1a蛋白水平的变化情况；

图20为hct116在缺氧条件下过表达空载(对照)、linc00637和共转linc00637与hif-1a后hif-1a下游靶基因hre转录活性；其中c为对照，d为linc00637，e为linc00637+hif-1a；

图21为hela在缺氧条件下过表达空载(对照)、linc00637和共转linc00637与hif-1a后hif-1a下游靶基因hre转录活性；其中c为对照，d为linc00637，e为linc00637+hif-1a；

图22为hct116在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后hif-1a下游靶基因vegf、agn1和mmp2的mrna表达水平；其中c为对照，d为linc00637；

图23为hela在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后hif-1a下游靶基因vegf、agn1和mmp2的mrna表达水平；其中c为对照，d为linc00637；

图24为hct116在缺氧条件下过表达表达空载(对照)和linc00637后hif-1a启动子荧光素酶活性，其中c为对照，d为linc00637；

图25为hela在缺氧条件下过表达表达空载(对照)和linc00637后hif-1a启动子荧光素酶活性，其中c为对照，d为linc00637；

图26为hct116和hela在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后下调ezh2后hif-1a和ezh2的蛋白水平；

图27为hct116在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后下调ezh2后hif-1a的mrna水平；其中c为对照，d为linc00637，f为linc00637+siezh2；

图28为hela在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后下调ezh2后hif-1a的mrna水平；其中c为对照，d为linc00637，f为linc00637+siezh2；

图29为hct116在缺氧条件下过表达表达空载(对照)和linc00637后hif-1a启动子与ezh2和igg的结合情况；其中g为常氧，h为缺氧，i为缺氧+linc00637；

图30为hela在缺氧条件下过表达表达空载(对照)和linc00637后hif-1a启动子与ezh2和igg的结合情况；其中g为常氧，h为缺氧，i为缺氧+linc00637；

图31为hct116在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后hif-1a启动子与h3k27me3和igg的结合情况；其中g为常氧，h为缺氧，i为缺氧+linc00637；

图32为hela在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后hif-1a启动子与h3k27me3和igg的结合情况；其中g为常氧，h为缺氧，i为缺氧+linc00637；

图33为rna体外免疫共沉淀实验；

图34为hct116在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后在体内linc00637与ezh2和suz12结合情况，其中c为对照，d为linc00637；

图35为hela在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后在体内linc00637与ezh2和suz12结合情况，其中c为对照，d为linc00637；

图36为hct116和hela在缺氧条件下加入actd，过表达linc00637或下调yb-1检测hif-1a和yb-1蛋白表达水平；

图37为hct116在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后在体内yb-1与linc00637和hif-1a5’-utr结合情况；其中g为常氧，h为缺氧，i为缺氧+linc00637；

图38为hela在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后在体内yb-1与linc00637和hif-1a5’-utr结合情况；中g为常氧，h为缺氧，i为缺氧+linc00637；

图39为hct116在缺氧条件下过表达linc00637、下调yb-1或者两者共同处理下hif-1a5’-utr荧光素酶活性；其中c为对照，d为linc00637；j为si-yb-1；k为si-yb-1+linc00637；

图40为hela在缺氧条件下过表达linc00637、下调yb-1或者两者共同处理下hif-1a5’-utr荧光素酶活性；其中c为对照，d为linc00637；j为si-yb-1；k为si-yb-1+linc00637；

图41为在hct116对照组和过表达linc00637异种模型中一至四周肿瘤的体积；其中c为对照，d为linc00637；

图42为在hct116对照组和过表达linc00637异种模型中一至四周肿瘤的重量；其中c为对照，d为linc00637；

图43为解剖后瘤体照片；

图44为在hct116对照组和过表达linc00637异种模型中cd31表达情况分析；

图45为在hct116对照组和过表达linc00637异种模型中ki-67表达情况分析；

图46为在hct116对照组和过表达linc00637异种模型中血管数量；其中c为对照，d为linc00637；

图47为在hct116对照组和过表达linc00637异种模型中血管内腔尺寸；其中c为对照，d为linc00637；

图48为在hct116对照组和过表达linc00637异种模型中ki-67相对值，p＝0.04；其中c为对照，d为linc00637；

图49为在三对异种模型标本中(t1、t2和t3)过表达空载(对照)和linc00637后linc00637的表达水平；其中c为对照，d为linc00637；

图50为在三对异种模型标本中(t1、t2和t3)过表达空载(对照)和linc00637，检测hif-1amrna的表达水平；其中c为对照，d为linc00637；

图51为在三对异种模型标本中(t1、t2和t3)过表达空载(对照)和linc00637，检测vegfmrna的表达水平；其中c为对照，d为linc00637；

图52为在三对异种模型标本中(t1、t2和t3)hif-1a和vegf蛋白的表达水平。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式长非编码rnalinc00637在制备抗肿瘤的靶向药物中的应用。

本实施方式从缺氧诱导基因hif-1a在肿瘤中表达角度出发，分析linc00637是否可以通过降低hif-1a的表达情况抑制肿瘤的发生和血管生成。研究发现linc00637可以通过结合prc2复合体抑制hif-1amrna表达，通过结合yb-1进而抑制yb-1与hif-1a5’-utr区的结合，抑制hif-1a翻译活性的调控作用，linc00637与两者结合可以高效特异地抑制hif-1a的表达。在裸鼠体内实验中进一步证实linc00637可以抑制hif-1a的表达从而发挥抑制肿瘤发生，血管生成和肿瘤转移的作用。在hct116对照组和过表达linc00637异种模型中，检测一至四周肿瘤的体积、肿瘤重量、血管数量和和血管内腔尺寸，过表达linc00637异种模型中肿瘤体积小93％，重量轻86％，血管数量减少57％和和血管内腔尺寸减小68％。

本实施方式首次发现，功能未知基因linc00637在hif-1a生物合成和转录水平上具有重要的抑制作用。linc00637可以成为潜在高效，安全的hif-1a抑制剂，该研究成果为靶向hif-1a提供了新的途径。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的抗肿瘤为抑制肿瘤生长、肿瘤血管生成和肿瘤转移。其他与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：抑制肿瘤生长是抑制肿瘤的体积和重量。与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：肿瘤为大肠癌、肾癌或宫颈癌。其他与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：长非编码rnalinc00637抑制hif-la的表达。其他与具体实施方式一至四之一相同。

通过以下实验验证本发明的效果：

实施例1：

一、linc00637的分子特征分析：查找ucsc网站对linc00637的分子特征进行分析，结果如图1所示，linc00637位于染色体14q32(图1)，该基因含有3个外显子，全长2056nt，在细胞浆和细胞核中均有分布。图3为3’和5’race实验，从图中可以得出相应linc00637的3’和5’条带。确定linc00637的3’和5’序列。图4和5为northernblot实验，检测linc00637和gapdh在正常大肠组织和大肠癌组织中的长度和表达情况。从图中可见linc00637在2000bp处出现条带，并且linc00637在大肠癌组织中表达下降，从图中可以得出linc00637的长度，race和northernblot实验共同确定linc00637的长度为2050，相比网站ucsc上的序列缺少前六个碱基。

northernblot实验方法为：

1ug线性化质粒dna用于地高辛标记的rna探针合成，根据罗氏试剂盒digrnalabelingmix提供的实验步骤合成地高辛标记的rna探针。用trizol的方法提取大肠癌病人组织rna。根据试剂盒northernmaxkit提供的步骤，30ugrna样品在含有百分之一甲醛的琼脂糖凝胶电泳，电压80v，电泳后将rna转移到尼龙膜上，紫外交联后的尼龙膜孵育地高辛标记的rna探针65度过夜。第二天用罗氏anti-digoxigenin-apfabfragments和nbt/bcipstocksolution试剂盒检测目标条带。将反义linc00637序列构建到pcdna3.1载体中

race实验方法为：

linc006373’和5’race实验使用testismarathon-readycdna和firstchoice^tmrlm-racekitwithmanual试剂盒共同完成。实验步骤参照试剂盒。

以linc00637-f和linc00637-r为引物，采用实时定量pcr对linc00637在46对大肠癌、6对宫颈癌和17对肾癌组织中表达情况分析，结果见图2,由图2可知，linc00637在大肠癌、肾癌以及宫颈癌中的表达明显下调。

图6和图7为linc00637核质分离实验，以linc00637-f和linc00637-r为引物，gapdh为细胞质标志物；以malat1-f和malat1-r为引物，malat1为细胞核标志物，从图中可见linc00637在细胞核和细胞质中均有分布在hct116(结肠癌细胞)和hela(子宫颈癌细胞)细胞中。

图8为体外转录翻译实验，iaspp作为阳性对照，从图中可知，linc00637组无任何条带，说明linc00637不具备编码蛋白的能力。

二、linc00637调控hif-1a表达及活性的研究：

采用westernblot方法对hif-1a(缺氧诱导因子1a)和hif-2a(缺氧诱导因子2a)在缺氧条件0、12和24小时下蛋白表达情况检测，由图9和10可见，hif-1a和hif-2a在缺氧条件下可检测到，说明缺氧条件成立。

以linc00637-f和linc00637-r为引物，采用实时定量pcr对linc00637在缺氧条件0,、12和24小时下表达情况检测。从图11和12中可以得出linc00637在缺氧条件表达下调，并且随着缺氧时间的增加逐渐下调。

采用westernblot方法对hif-1a和hif-2a在氧气浓度为百分之20、5和2的条件下蛋白表达情况进行检测。从图13和14中可以得出hif-1a和hif-2a在缺氧条件下可检测到，说明缺氧条件成立。

以linc00637-f和linc00637-r为引物，采用实时定量pcr对linc00637在氧气浓度为百分之20、5和2的条件下表达情况进行检测。从图15和16中可以得出的结论是linc00637在缺氧条件表达下调，并且随着缺氧浓度的减少逐渐下调。图9-16可知，linc00637在缺氧条件下表达下调。

hct116和hela缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后，将linc00637序列构建到plnc载体中，以hif-1α-f和hif-1α-r为引物，采用实时定量pcr检测hif-1amrna水平的变化情况，结果如图17和18所示hif-1a在缺氧条件下mrna水平表达增高，在缺氧条件下过表达linc00637后，hif-1a的mrna表达水平显著下降，说明linc00637可以减少hif-1amrna表达水平。

将linc00637序列构建到plnc载体中，hct116和hela在缺氧条件下过表达linc00637后，采用westernblot方法检测hif-1a蛋白水平的变化情况。从图19中可以得出的结论是hif-1a在缺氧条件下蛋白水平表达增高，在缺氧条件下过表达linc00637后，hif-1a的蛋白表达水平显著下降，说明linc00637可以减少hif-1a蛋白水平表达。α-tublin为内参。

将linc00637序列构建到plnc载体中，hct116和hela在缺氧条件下过表达空载(对照)、linc00637和共转linc00637与hif-1a后，将hre序列构建到pgl3载体中，采用荧光素酶报告基因的方法检测hif-1a下游靶基因hre转录活性。从图20和21中可以看出hif-1a下游靶基因hre转录活性在缺氧条件下增高，在过表达linc00637后下降，在共转linc00637与hif-1a后消除了linc00637对hif-1a下游靶基因hre转录活性的影响，说明linc00637可以调控hif-1a下游靶基因转录。

hct116和hela在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后，将linc00637序列构建到plnc载体中，以vegf-f和vegf-r、agn1-f和agn1-r、mmp2-f和mmp2-r为引物，采用实时定量pcr检测hif-1a下游靶基因vegf(血管生长因子)、agn1(血管生成素1)和mmp2(基质金属蛋白酶2)的mrna表达水平。从图中22和23可以看出缺氧条件下vegf、agn1和mmp2的mrna表达增高，在缺氧条件下过表达linc00637后vegf、agn1和mmp2的mrna表达明显减少，说明linc00637可以抑制hif-1a下游靶基因的表达。

恢复linc00637的表达完全消除了缺氧诱导的hif-1amrna以及蛋白(图17-19)，提示linc00637水平的降低是缺氧诱导的hif-1a表达和活化的必要因素。另外，伴随着hif-1a表达水平的改变，linc00637有效调控hif-1a的转录活性及其下游靶基因的表达(图20-23)。

三、linc00637调控hif-1a表达及活性的分子机制：

将linc00637序列构建到plnc载体中，hct116和hela在缺氧条件下过表达表达空载(对照)和linc00637后，采用荧光素酶报告基因的方法检测hif-1a启动子荧光素酶活性，从图24和25中可以得出的结论是在缺氧条件下hif-1a启动子荧光素酶活性增高，在缺氧条件下过表达linc00637后其荧光活性降低，说明linc00637可以通过转录水平影响hif-1a表达。hif-1a启动子荧光素酶载体购买于addgene。

将linc00637序列构建到plnc载体中，hct116和hela在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后下调ezh2(zeste基因增强子同源物2)，采用westernblot方法检测hif-1a和ezh2的蛋白水平。从图26中可以得出的结论是在缺氧条件下过表达linc00637后hif-1a蛋白表达量下降，ezh2蛋白表达水平不发生变化，在过表达linc00637后下调ezh2后，hif-1a表达水平有所恢复，说明linc00737在转录水平调控hif-1a是通过ezh2。

将linc00637序列构建到plnc载体中，hct116和hela在缺氧条件下过表达表达空载(对照)和linc00637后下调ezh2，以hif-1α-f和hif-1α-r为引物，采用实时定量pcr检测hif-1a的mrna水平，从图27和28中可以得出的结论是在缺氧条件下过表达linc00637后hif-1amrna表达量下降，在过表达linc00637后下调ezh2后，hif-1a表达水平有所恢复，说明linc00637在转录水平调控hif-1a是通过ezh2。

将linc00637序列构建到plnc载体中，hct116和hela在缺氧条件下过表达表达空载(对照)和linc00637后，以hif-1αpromoter-f和hif-1αpromoter–r为引物，采用实时定量pcr检测hif-1a启动子与ezh2和igg的结合情况。从图29和30中可以得出的结论是在缺氧条件下ezh2与hif-1a启动子结合减弱，在缺氧条件下过表达linc00637后ezh2与hif-1a启动子结合增强，与igg没有结合，说明linc00637在缺氧条件下促进ezh2与hif-1a启动子结合增强。

将linc00637序列构建到plnc载体中，hct116和hela在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后，以hif-1αpromoter-f和hif-1αpromoter–r为引物，采用实时定量pcr检测hif-1a启动子与h3k27me3(组蛋白h3第27位赖氨酸上三甲基化)和igg的结合情况。从图31和32中可以得出的结论是在缺氧条件下h3k27me3与hif-1a启动子结合减弱，在缺氧条件下过表达linc00637后h3k27me3与hif-1a启动子结合增强，与igg没有结合，说明linc00637在缺氧条件下促进h3k27me3与hif-1a启动子结合增强。

进行rna体外免疫共沉淀实验方法检测正义和反义linc00637与ezh2和suz12(zeste基因抑制子12)体外结合情况，从图33中可以得出的结论是，linc00637可以与ezh2和suz12体外结合。

将linc00637序列构建到plnc载体中，hct116和hela在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后，以linc00637-f和linc00637-r、gapdh-f和gapdh-r为引物，采用实时定量pcr在体内检测linc00637与ezh2和suz12结合情况，从图34和35中可以得出的结论是在缺氧条件下linc00637与ezh2结合减弱，过表达linc00637后结合增强，与suz12结合较弱。

将linc00637序列构建到plnc载体中，hct116和hela在缺氧条件下加入actd，过表达linc00637或下调yb-1检测hif-1a和yb-1(y盒结合蛋白1)蛋白表达水平。用westernblot方法检测，从图36中可以得出的结论是在过表达linc00637后hif-1a蛋白表达减少，yb-1蛋白表达水平不变，在下调yb-1后，hif-1a蛋白表达减少，在过表达linc00637下调yb-1后，hif-1a蛋白表达与单独下调yb-1一致，说明linc00637调控hif-1a蛋白翻译水平是通过yb-1。

将linc00637序列构建到plnc载体中，hct116和hela在缺氧条件下过表达空载(对照)和linc00637后，以linc00637-f和linc00637-r、gapdh-f和gapdh-r为引物，采用实时定量pcr在体内检测yb-1与linc00637和hif-1a5’-utr结合情况。从图37和38中可以看出是在缺氧条件下yb-1与hif-1amrna结合增强，与linc00637结合减弱，在缺氧下过表达linc00637后，yb-1与hif-1amrna结合减弱，与linc00637结合增强。gapdh为阴性对照。说明hif-1a与linc00637竞争性结合yb-1。

将linc00637序列构建到plnc载体中，hct116和hela在缺氧条件下过表达linc00637、下调yb-1或者两者共同处理下，采用荧光素酶报告基因的方法检测hif-1a5’-utr荧光素酶活性。其中荧光素酶载体是将hif-1α野生型(wt)5’-utr(1-256)，5’-utr(1-138,mt1)和5’-utr(139-256,mt2)构建到带有cmv启动子的pgl3载体中，从图39和40中可以得出的结论是在缺氧条件下wt、mt1和mt2荧光活性增强，在缺氧条件下过表达linc00637、下调yb-1或者两者共同处理下wt和mt2荧光活性减弱，mt1荧光活性不变，说明mt2是yb-1和linc00637影响hif-1a的主要区域。

从图24-35可知，linc00637可结合prc2发挥抑制hif-1amrna转录的作用，该作用的发挥对hif-1a蛋白水平具有一定的调控作用(图26)。从图37和38可知，linc00637可以与yb-1结合，进而抑制yb-1与hif-1a5’-utr区的结合，抑制yb-1对hif-1a表达水平的调控作用(图36-40)。

四、linc00637表达对肿瘤生长的抑制作用：

在hct116对照组和过表达linc00637异种模型中，采用实时测量的方式检测1至四周肿瘤的体积，解剖后检测肿瘤重量，下面为解剖后瘤体照片。从图41-43中可以得出的结论是在过表达linc00637后肿瘤的体积和重量明显减少，说明linc00637抑制体内肿瘤的生长。过表达linc00637异种模型中是将linc00637序列构建到plnc载体中。

hct116对照组和过表达linc00637异种模型中，检测cd31和ki-67，并且统计血管数量和血管内腔尺寸。从图44-48中可以得出的结论是在过表达linc00637后cd31和ki-67表达减少，血管数量和和血管内腔尺寸减少，说明linc00637抑制肿瘤血管生成。过表达linc00637异种模型中是将linc00637序列构建到plnc载体中。

将linc00637序列构建到plnc载体中，在三对异种模型标本中(t1、t2和t3)过表达空载(对照)和linc00637，以linc00637-f和linc00637-r、hif-1α-f和hif-1α-r为引物、vegf-f和vegf-r为引物，采用实时定量pcr分别检测linc00637、hif-1a和vegfmrna的表达水平。从图49中可以得出的结论是linc00637过表达组过表达，在linc00637过表达组hif-1a(图50)和vegfmrna(图51)表达下降。

将linc00637序列构建到plnc载体中，在三对异种模型标本中(t1、t2和t3)，“+”表示过表达空载(对照)或linc00637，采用westernblot方法检测分别检hif-1a和vegf蛋白的表达水平。从图49-51中可以得出的结论是linc00637过表达组hif-1a和vegfmrna表达下降。

在三对异种模型标本中(t1、t2和t3)，“+”表示过表达空载(对照)或linc00637，分别检hif-1a和vegf蛋白的表达水平。从图52中可以得出的结论是linc00637过表达组hif-1a和vegf蛋白表达下降。

图41-52可知linc00637过表达可以抑制肿瘤在裸鼠内的成瘤体积和血管生成，并且该效应，同时伴有瘤体内hif-1amrna以及蛋白水平的改变，以及血管生成的改变。提示linc00637具有抑制肿瘤生长和血管生成的作用，而该作用的发挥是通过hif-1a信号通路实现的。

本实施例中所述的实时定量pcr方法为：从组织和细胞中用trizol提取rna，以rna为模板合成cdna,rna总量1μg。用takara的反转录试剂盒合成cdna，将试剂盒中的试剂放于冰上，让其融化。融化后按照以试剂盒给出体系配置。用takara荧光定量pcr试剂盒做全定量pcr，每个反应体系10μl。cdna浓度不小于100ng。

westernblot方法为：

蛋白测完浓度后，将各组蛋白浓度调平，在100℃金属浴中煮沸五分钟。根据需要配置sds-page蛋白胶，有上层胶和下层胶，上层为浓缩胶，下层为分离胶，按照规定比例配置蛋白胶。转膜结束后配置5％的牛奶封闭1小时。4℃一抗过夜。第二天取出一抗杂交的pvdf膜后，用tbst清洗5分钟，重复三次，二抗杂交1h后显影。

荧光素酶报告基因方法为：

3×10⁴个细胞种于24孔板内，用linpfectamin2000转染renila和相应荧光素酶报告基因载体，转染48小后，收集细胞后使用dualluciferasereporterassaysystem检测荧光活性。相应荧光素酶报告基因的活性用renilla的荧光素酶活性标准化。

rna体外免疫共沉淀实验方法为：

通过使用罗氏biotinrnalabelingmix试剂盒体外转录出生物素标记的rna探针后，经过95度2分钟，冰上孵育3分钟后使其恢复rna二级结构。恢复二级结构的rna探针与链霉亲和素琼脂糖珠子混合过夜。细胞裂解液与rna和柱子的结合物4度混合1小时后，带有混合物的珠子清洗5次后，加入sds上样缓冲液煮沸5分钟，最后通过westernblot方法检测与rna结合的蛋白条带。

本实施例所用引物序列见表1：

表1

由本实施例可知，linc00637通过降低hif-1a的表达情况抑制肿瘤的发生和血管生成。linc00637可以通过结合prc2复合体抑制hif-1amrna表达，通过结合yb-1进而抑制yb-1与hif-1a5’-utr区的结合，抑制hif-1a翻译活性的调控作用，linc00637与两者结合可以高效特异地抑制hif-1a的表达。在裸鼠体内实验中进一步证实linc00637可以抑制hif-1a的表达从而发挥抑制肿瘤发生，血管生成和肿瘤转移的作用。