异黄菲灵下调FoxM1基因的用途及在肿瘤治疗方面的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，尤其涉及异黄菲灵下调foxm1基因的用途及在肿瘤治疗方面的应用。

背景技术：

叉头盆蛋白质m1(forkheadboxproteinm1，foxm1)是forkhead家族的一个致瘤转录因子，已被证实在多种肿瘤细胞增殖和周期进展中发挥至关重要的作用。foxm1在超过20种人类肿瘤中过表达，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、抗凋亡和化疗耐药等过程。越来越多的证据表明，foxm1在肿瘤细胞增殖与代谢之间发挥信使作用，使肿瘤细胞的增殖与代谢相适应(foxm1与肿瘤代谢关系的研究进展，中国肿瘤临床2015年第42卷第22期)。

异黄菲灵为存在于石莲等植物中的化合物，cas登录号为85734-02-7，化学结构式如下：

现有技术未见异黄菲灵用于抑制foxm1基因表达的报道。

技术实现要素：

本发明旨在提供异黄菲灵下调foxm1基因的用途及在肿瘤治疗方面的应用。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

异黄菲灵用作foxm1基因表达抑制剂的用途。

一种foxm1基因表达抑制药物，活性成分为异黄菲灵。

异黄菲灵用于治疗肿瘤的医药用途。

优选地，所述肿瘤包括宫颈癌、乳腺癌和肺癌。

一种肿瘤治疗药物，活性成分为异黄菲灵。

优选地，所述肿瘤包括宫颈癌、乳腺癌和肺癌。

有益效果：

本发明发现异黄菲灵可以下调多种肿瘤细胞中foxm1基因的表达，而本领域技术人员知道foxm1基因与多种肿瘤的发生、发展有关(下调foxm1基因表达对宫颈癌细胞侵袭能力的影响，武汉大学学报2015年第36卷第2期；紫花牡荆素抑制foxm1诱导乳腺癌细胞凋亡的研究，中国癌症杂志2012年第22卷第12期；foxm1对肺癌中mmp-2、mmp-9和迁移侵袭的影响，现代肿瘤医学2014年第22卷第8期)，因此，异黄菲灵可以用于制备成foxm1基因表达抑制剂对肿瘤进行治疗。

附图说明

图1为异黄菲灵对宫颈癌细胞、乳腺癌细胞和肺癌细胞中foxm1基因表达的影响；5μm异黄菲灵作用24h可以显著抑制人宫颈癌hela细胞、人乳腺癌mda-mb-231细胞和肺癌h1299细胞中foxm1基因的表达(p<0.05)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

实施例1：异黄菲灵对宫颈癌细胞中foxm1基因表达的影响

一、实验材料

异黄菲灵自制，纯度不低于95％。人宫颈癌hela细胞购自atcc细胞库。rpmi1640培养基购自gibco公司，胎牛血清购自hyclone公司。bca蛋白分析试剂盒购自美国pierce公司。兔抗人的foxm1多克隆抗体及内参gapdh抗体均购于santacruz公司；辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗兔二抗为上海申能博彩生物科技有限公司产品。trizol试剂购于美国invitrogen公司。rt-pcr试剂盒购自takara公司；引物购自上海生工生物工程服务技术有限公司；rt-pcr测定试剂盒购自日本takara公司。

二、实验方法

1、细胞培养

hela细胞常规培养于含10％胎牛血清的rpmi1640培养基中，置于37℃5％co2饱和湿度培养箱内，每2d换液1次，每3-4d传代1次，取对数生长期的细胞进行后续实验。

2、细胞分组和给药培养

实验分为对照组和给药组。将对数生长期的细胞接种在6孔板中，每孔约1×10⁴个细胞，继续培养24h当细胞密度达到70％～80％时候，给药组加入5μm异黄菲灵，对照组添加等体积溶媒dmso，24h后，0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞，pbs漂洗2遍，待测。

3、rt-pcr法测定foxm1mrna表达水平

按照说明书使用trizol试剂提取细胞中的总rna，紫外分光光度计上测定260nm和280nm处的a值，如a260/a280＞1.8，证明纯度较高。计算核酸浓度，并将提取的总rna溶于depc水中。根据rt-pcr试剂盒说明书，对各组细胞中的foxm1进行rt-pcr反应，以gapdh为内参。rt反应条件如下：30℃10min，然后42℃30min，99℃5min，5℃5min。pcr反应条件如下：94℃2min，然后94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环。rt-pcr产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳并鉴定。使用图像分析软件进行分析。

rt-pcr引物序列如下：

foxm1正向引物：5’-agcgacaggttaaggttgag-3’

foxm1反向引物：5’-gtgctgttgatggcgaattg-3’

gapdh正向引物：5’-acggatttggtcgtattgggcg-3’

gapdh反向引物：5’-ctcctggaagatggtgatgg-3’。

4、westernblot法测定foxm1蛋白表达水平

用细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白，将提取的总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，取下凝胶，将电泳产物电转移至pvdf膜上，以含5％脱脂奶粉的tbst液封闭2h。按说明书加入一抗，包括foxm1(1:500)，4℃摇床孵育过夜。加入二抗，室温孵育1h。将pvdf膜置于增强化学发光试剂中反应2分钟，于暗室中利用x射线曝光，显影、定影。蛋白表达的灰度值利用quantityone软件进行分析。

5、数据处理

实验数据用x±s表示，采用spss17.0统计软件行onewayanova方差分析，两两比较用student’st检验，p<0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果

与对照组相比，给药组细胞中foxm1mrna表达水平和foxm1蛋白表达水平均显著下调(p<0.05)，结果如表1和图1所示。可见异黄菲灵可以有效抑制人宫颈癌hela细胞中foxm1基因的表达。

表1异黄菲灵对肿瘤细胞中foxm1基因表达的影响

实施例2：异黄菲灵对乳腺癌细胞中foxm1基因表达的影响

一、实验材料

异黄菲灵自制，纯度不低于95％。人乳腺癌mda-mb-231细胞购自atcc细胞库。dmem培养液购自美国invitrogen公司，胎牛血清购自hyclone公司。bca蛋白分析试剂盒购自美国pierce公司。兔抗人的foxm1多克隆抗体及内参gapdh抗体均购于santacruz公司；辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗兔二抗为上海申能博彩生物科技有限公司产品。trizol试剂购于美国invitrogen公司。rt-pcr试剂盒购自takara公司；引物购自上海生工生物工程服务技术有限公司；rt-pcr测定试剂盒购自日本takara公司。

二、实验方法

1、细胞培养

mda-mb-231细胞常规培养于含10％胎牛血清的dmem培养液中，置于37℃5％co2饱和湿度培养箱内，每2d换液1次，每3-4d传代1次，取对数生长期的细胞进行后续实验。

2、细胞分组和给药培养

实验分为对照组和给药组。将对数生长期的细胞接种在6孔板中，每孔约1×10⁴个细胞，继续培养24h当细胞密度达到70％～80％时候，给药组加入5μm异黄菲灵，对照组添加等体积溶媒dmso，24h后，0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞，pbs漂洗2遍，待测。

3、rt-pcr法测定foxm1mrna表达水平

按照说明书使用trizol试剂提取细胞中的总rna，紫外分光光度计上测定260nm和280nm处的a值，如a260/a280＞1.8，证明纯度较高。计算核酸浓度，并将提取的总rna溶于depc水中。根据rt-pcr试剂盒说明书，对各组细胞中的foxm1进行rt-pcr反应，以gapdh为内参。rt反应条件如下：30℃10min，然后42℃30min，99℃5min，5℃5min。pcr反应条件如下：94℃2min，然后94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环。rt-pcr产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳并鉴定。使用图像分析软件进行分析。

rt-pcr引物序列如下：

foxm1正向引物：5’-agcgacaggttaaggttgag-3’

foxm1反向引物：5’-gtgctgttgatggcgaattg-3’

gapdh正向引物：5’-acggatttggtcgtattgggcg-3’

gapdh反向引物：5’-ctcctggaagatggtgatgg-3’。

4、westernblot法测定foxm1蛋白表达水平

用细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白，将提取的总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，取下凝胶，将电泳产物电转移至pvdf膜上，以含5％脱脂奶粉的tbst液封闭2h。按说明书加入一抗，包括foxm1(1:500)，4℃摇床孵育过夜。加入二抗，室温孵育1h。将pvdf膜置于增强化学发光试剂中反应2分钟，于暗室中利用x射线曝光，显影、定影。蛋白表达的灰度值利用quantityone软件进行分析。

5、数据处理

实验数据用x±s表示，采用spss17.0统计软件行onewayanova方差分析，两两比较用student’st检验，p<0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果

与对照组相比，给药组细胞中foxm1mrna表达水平和foxm1蛋白表达水平均显著下调(p<0.05)，结果如表1和图1所示。可见异黄菲灵可以有效抑制人乳腺癌mda-mb-231细胞中foxm1基因的表达。

实施例3：异黄菲灵对肺癌细胞中foxm1基因表达的影响

一、实验材料

异黄菲灵自制，纯度不低于95％。肺癌h1299细胞购自atcc细胞库。rpmi1640培养基购自gibco公司，胎牛血清购自hyclone公司。bca蛋白分析试剂盒购自美国pierce公司。兔抗人的foxm1多克隆抗体及内参gapdh抗体均购于santacruz公司；辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗兔二抗为上海申能博彩生物科技有限公司产品。trizol试剂购于美国invitrogen公司。rt-pcr试剂盒购自takara公司；引物购自上海生工生物工程服务技术有限公司；rt-pcr测定试剂盒购自日本takara公司。

二、实验方法

1、细胞培养

h1299细胞常规培养于含10％胎牛血清的rpmi1640培养基中，置于37℃5％co2饱和湿度培养箱内，每2d换液1次，每3-4d传代1次，取对数生长期的细胞进行后续实验。

2、细胞分组和给药培养

实验分为对照组和给药组。将对数生长期的细胞接种在6孔板中，每孔约1×10⁴个细胞，继续培养24h当细胞密度达到70％～80％时候，给药组加入5μm异黄菲灵，对照组添加等体积溶媒dmso，24h后，0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞，pbs漂洗2遍，待测。

3、rt-pcr法测定foxm1mrna表达水平

按照说明书使用trizol试剂提取细胞中的总rna，紫外分光光度计上测定260nm和280nm处的a值，如a260/a280＞1.8，证明纯度较高。计算核酸浓度，并将提取的总rna溶于depc水中。根据rt-pcr试剂盒说明书，对各组细胞中的foxm1进行rt-pcr反应，以gapdh为内参。rt反应条件如下：30℃10min，然后42℃30min，99℃5min，5℃5min。pcr反应条件如下：94℃2min，然后94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环。rt-pcr产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳并鉴定。使用图像分析软件进行分析。

rt-pcr引物序列如下：

foxm1正向引物：5’-agcgacaggttaaggttgag-3’

foxm1反向引物：5’-gtgctgttgatggcgaattg-3’

gapdh正向引物：5’-acggatttggtcgtattgggcg-3’

gapdh反向引物：5’-ctcctggaagatggtgatgg-3’。

4、westernblot法测定foxm1蛋白表达水平

用细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白，将提取的总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，取下凝胶，将电泳产物电转移至pvdf膜上，以含5％脱脂奶粉的tbst液封闭2h。按说明书加入一抗，包括foxm1(1:500)，4℃摇床孵育过夜。加入二抗，室温孵育1h。将pvdf膜置于增强化学发光试剂中反应2分钟，于暗室中利用x射线曝光，显影、定影。蛋白表达的灰度值利用quantityone软件进行分析。

5、数据处理

实验数据用x±s表示，采用spss17.0统计软件行onewayanova方差分析，两两比较用student’st检验，p<0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果

与对照组相比，给药组细胞中foxm1mrna表达水平和foxm1蛋白表达水平均显著下调(p<0.05)，结果如表1和图1所示。可见异黄菲灵可以有效抑制肺癌h1299细胞中foxm1基因的表达。

本发明发现异黄菲灵可以下调多种肿瘤细胞中foxm1基因的表达，而本领域技术人员知道foxm1基因与多种肿瘤的发生、发展有关(下调foxm1基因表达对宫颈癌细胞侵袭能力的影响，武汉大学学报2015年第36卷第2期；紫花牡荆素抑制foxm1诱导乳腺癌细胞凋亡的研究，中国癌症杂志2012年第22卷第12期；foxm1对肺癌中mmp-2、mmp-9和迁移侵袭的影响，现代肿瘤医学2014年第22卷第8期)，因此，异黄菲灵可以用于制备成foxm1基因表达抑制剂对肿瘤进行治疗。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。