本发明属于中药炮制
技术领域：
，具体涉及一种巴戟天的炮制品及炮制方法与应用。
背景技术：
：巴戟天为双子叶植物茜草科rubiaceae巴戟天morindaofficinalishow.的干燥根。巴戟天味辛、甘，性微温，归肾、肝经，含蒽醌、黄酮类化合物。巴戟天具有补肾助阳、祛风除湿、强筋健骨功效，主治阳痿遗精、宫冷不孕、月经不调、少腹冷痛、风湿痹痛、筋骨痿软。巴戟天自古就有不同的炮制方法：南北朝刘宋时代有枸杞、酒、菊花制(《雷公》)法。宋代有酒煮(《博济》)、糯米同炒(《衍义》)、酒焙(《总录》)、面炒、盐汤浸(《局方》)等方法。元代有酒炒(《瑞竹》)法。明代增加了酒浸、油炒、火炮(《普济方》)、炒制(《医学》)、盐水煮(《入门》)、甘草汤浸、枸杞汤浸(《仁术》)、盐水泡(《保元》)、甘草汤炒(《景岳》)、甘草汁煮(《醒斋》)等方法。清代又增加了酒洗(《说约》)、酒浸蒸(《玉楸》)、并有“助阳杞子汁浸蒸，去风湿好酒拌炒，摄精金樱子汁拌炒，理肾气菊花同煮”的记述(《得配》)等多种炮制方法。在现代临床上巴戟天也有不同的炮制品种，如巴戟天(巴戟肉)、盐巴戟天、制巴戟天等。(1)巴戟天(巴戟肉)为取厚药材，除去杂质，洗净，置蒸制容器内蒸透，趁热除去木心，或用水润透后除去木心，切段，干燥，筛去碎屑。巴戟天肉为空心扁圆形节段，或不规则小块，切面淡紫色，周边栓皮灰黄色，质韧，肉厚。味甘而微涩。(2)盐巴戟为取净巴戟段，用盐水拌匀，待盐水被吸尽后，置炒制容器内，用文火炒干，或取净巴戟，用盐水拌匀，蒸软，除去木心，切段，干燥，筛去碎屑。其中巴戟天每100kg用食盐2kg。盐巴戟天质较软韧，眯片微带成味。(3)制巴戟为取净甘草捣碎，加水(约1:5量)煎汤两次，去渣，合并两次煎液；取甘草煎液与净巴戟天，同置锅内，用文火煮透并使甘草液基本煮干为度，取出，趁热抽去木心，切段，干燥，筛去碎屑。其中巴戟天每100kg用甘草6kg，煎汤约50kg。制巴戟天表面微黄色，味甜。不同炮制方法有效成分含量不同，功效不同，适应症较为单一。如巴戟天(巴戟肉)味辛而温，以补肝肾祛风湿力胜，适用于肾虚而兼有风湿之证，多用于风冷腰痛，步行艰难，脚气水肿，肌肉萎缩无力等证。盐制后专功人肾，且温而不燥，增强补肾助阳的作用，久服无伤阴之弊，常用于肾中元阳不足，阳痿早泄，腰膝酸软无力，宫冷不孕，小便频数等。甘草制后味甘，增强补益作用，多用于补肾助阳，益气养血方中，如用于脾肾亏损，胸中短气，腰脚疼痛，身重无力等方面。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种新的巴戟天的炮制品及炮制方法，所述的巴戟天炮制方法操作简单，生产周期短，生产效率高，适合大规模工业化生产，能够最大限度的保证巴戟天的有效成分。制得的巴戟天炮制品补肾壮阳的有效成分(蒽醌类、环烯醚萜苷类)含量高，可以用于制备具有肾细胞损伤作用或抗炎作用的药物。本发明所述巴戟天炮制品，由如下重量份原料制得：食盐1-5份，甘草3-10份，巴戟天100份。本发明还提供了一种巴戟天的炮制方法，将1-5重量份食盐溶解在3-10重量份甘草汁中，然后将100重量份巴戟天肉浸泡其中，闷润、常压蒸制，待甘草汁被巴戟肉吸尽后低温干燥。本发明采用将食盐溶解于甘草汁中，加入巴戟肉后，闷润，常压蒸制，低温干燥的特殊方式得到巴戟天炮制产品，有效解决了现有炮制技术中，采用单一辅料食盐或者甘草汁制备得到巴戟天炮制品，有效成分含量低，适应症较为单一的问题。本发明巴戟天的炮制方法操作简单，生产周期短，生产效率高，适合大规模工业化生产，能够最大限度的保证巴戟天有效成分，扩大了巴戟天炮制品的临床适用症范围。其中，所述甘草汁为甘草饮片煎煮液，由甘草饮片加水煎煮得到。在一些实施方案中，所述甘草饮片加水煎煮的加水量为甘草饮片质量的5-15倍。优选为甘草饮片质量的15倍；在一些实施方案中，所述甘草饮片加水煎煮中的煎煮为煎煮1-2次，每次1-2h。煎煮的总时间为2-4h。优选为2.5-3.5h，进一步优选为3h。如煎煮两次每次1.5小时。作为优选，本发明所述炮制方法中，所述食盐与甘草饮片的质量比为1:(2-6)。优选为1:3-5，进一步优选为1:3。作为优选，本发明所述炮制方法中，所述食用盐与巴戟肉的质量比为(1-3):100，优选为(1.5-2.5):100，进一步优选为1.5:100。本发明所述炮制方法中，所述闷润的时间为1-5h。优选地，所述闷润时间为5h。本发明所述炮制方法中，所述蒸制的时间为2-8h。进一步优选地，所述的常压蒸制时间为3-6h。更进一步优选地，所述常压蒸制时间为4h。作为优选，本发明所述炮制方法中，所述低温干燥为40℃烘箱中烘制24h。本发明还提供了上述方法制得的巴戟天炮制品。经该方法炮制后的巴戟天，有效的缓和了巴戟天的辛辣味。实验表明本发明所述的巴戟天炮制品有效成分含量高，具有良好的修复受损肾细胞作用及抗炎作用，效果优于盐巴戟天和制巴戟天，可用于制备具有肾细胞损伤作用或抗炎作用的药物，进而用于制备具有补肾壮阳作用的药物或保健品。由上述技术方案可知，本发明提供了一种新的巴戟天的炮制品及炮制方法。本发明所述巴戟天炮制品，由如下重量份原料制得：食盐1-5份，甘草3-10份，巴戟天100份。本发明所述巴戟天的炮制方法，将食盐溶解在甘草汁中，然后将巴戟天肉浸泡其中，闷润、常压蒸制，待甘草汁被巴戟肉吸尽后低温干燥。本发明所述炮制方法操作简单，生产周期短，生产效率高，适合工业大规模生产。制得巴戟天炮制品有效的缓和了巴戟天的辛辣味，有效成分含量显著增加，其对受损肾细胞的修复作用和细胞吞噬作用大大增强；最大限度的保留了巴戟天的有效成分，药用价值确切，有效解决了巴戟天炮制后有效成分含量降低、适应症较为单一的问题。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示h2o2损伤时间对肾细胞的影响；图2示不同工艺制备的巴戟天炮制品对肾细胞增殖率的影响；图3示巴戟天不同炮制品对raw264.7增殖率的影响图，系列1为细胞相对存活率。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。实施例1、甘草汁的提取称取甘草100g，加1500ml水浸泡30min，煮沸1.5h，滤过，药渣再加1500ml水煮沸1.5h，滤过，合并滤液，浓缩至2500ml，即得甘草汁。其中lml甘草汁相当于0.04g甘草药材。实施例2、巴戟天的制备取巴戟天药材切断1～1.5cm，洗净，即得。实施例3、巴戟肉的制备净制后的巴戟天药材加1.0倍量水，50℃闷润9h，去除其木心，50℃烘干即得实施例4、盐巴戟天的制备取巴戟肉100g，加入1.5％盐水溶液100ml，闷润5h，常压隔水蒸制4h，取出，50℃干燥24h，即得盐巴戟天。实施例5、制巴戟天的制备取巴戟肉100g，加入甘草汁150ml浸泡，闷润5h，不时翻动，文火煮制，待甘草汁被巴戟肉吸尽后，取出，于40℃烘箱中烘制24h，即得制巴戟天。实施例6、巴戟天炮制品的制备(盐润草蒸组)取巴戟肉100g，加入1.5％盐水溶液100ml，闷润5h后，加入甘草汁150ml，常压隔水蒸制4h，待甘草汁完全被巴戟肉吸尽后，取出，50℃干燥24h，即得本发明巴戟天炮制品。实施例7、巴戟天炮制品的制备(盐润草煮组)取巴戟肉100g，加入1.5％盐水溶液100ml，闷润5h后，加入甘草汁150ml，文火煮至甘草汁被巴戟肉吸尽后，取出，50℃干燥24h，即得本发明巴戟天炮制品。实施例8、巴戟天炮制品的制备(盐蒸草煮组)取巴戟肉100g，加入1.5％盐水溶液100ml，闷润5h，常压隔水蒸制3h后，再加入甘草汁150ml，文火煮至干，取出，50℃干燥24h，即得本发明巴戟天炮制品。实施例9、本发明所述巴戟天炮制品的制备(盐草蒸组)取食用盐1.5g溶解于甘草汁2500ml中，加入巴戟肉100g，浸泡，闷润5h，不时翻动，上锅常压隔水蒸制5h，待甘草汁被巴戟肉吸尽后，取出，于40℃烘箱中烘制24h，即得本发明巴戟天炮制品。实施例10、巴戟天炮制品的制备(盐草煮组)取食用盐1.5g溶解于甘草汁2500ml中，加入巴戟肉100g，浸泡，闷润5h，不时翻动，文火煮制，待甘草汁被巴戟肉吸尽后，取出，于40℃烘箱中烘制24h，即得本发明巴戟天炮制品。实施例11、巴戟天炮制品的制备(草煮盐蒸组)取巴戟肉100g，加入甘草汁150ml，文火煮制，待甘草汁完全被巴戟肉吸尽后，加入1.5％盐水溶液，闷润5h，常压隔水蒸制3h，取出，50℃干燥24h，即得本发明巴戟天炮制品。以下通过实验例的方式来说明本发明巴戟天炮制品的功效：实验例1、巴戟天炮制品对受损肾细胞的修复作用及抗炎作用研究1.实验材料1.1仪器超净工作台(上海智城zhjh-c1112b)，倒置显微镜(宁波永新nib-100)，co2培养箱(日本三洋mco-15ac)，微量移液器，multiskanmk3酶标仪(thermo公司)，细胞培养用具等。1.2实验药物不同工艺制备巴戟天炮制品样品，1640高糖培养基、dmem高糖培养基(thermo公司)，新生胎牛血清(thermo公司)，青链霉素双抗液(gibco公司)，cck-8试剂盒(上海生博生物医药科技有限公司)，胰酶(reanta公司)，dmso为acs级，75％医用消毒酒精，脂多糖(lps)(sigma公司)，小鼠raw264.7单核巨噬细胞株(中国科学院上海细胞库)，无水乙醇(分析纯)，水为纯净水。2.实验方法及结果2.2lps诱导液的配制精密称取lps5mg，用无血清dmem高糖培养基稀释至5ml，充分搅拌溶解制成浓度为1mg·ml-1的原液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌待用，-20℃保存备用。2.30.1％中性红溶液的配制精密称取中性红0.03g，用pbs溶液稀释至30ml，充分溶解制成浓度为0.1％的中性红溶液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌待用，-20℃保存备用。2.4供试药物溶液的配制配制成含生药浓度为5、10、50、100、200、400、800、1600mg·l-1的药液，-20℃备用。2.5对肾细胞增殖率的影响肾细胞以胰酶消化后，调整细胞密度4×104个·ml-1，接种到96孔板上，每孔100μl细胞悬液。贴壁后弃掉上清，给药组加入100μl浓度为5、10、50、100、200、400、800、1600mg·l-1的不同样品和对照品，对照孔加入100μl的1640培养基，每组6个复孔。放入培养箱培养24h后，每孔加入10μlcck-8溶液，继续培养1h，450nm测定od值，计算增殖率。结果见图2增殖率＝(给药孔od值-对照孔od值)/对照孔od值×100％。图2结果显示不同工艺制备的巴戟天炮制品对肾细胞增殖率的影响。在给药浓度为50μg/ml时，各组细胞增值率均最高，优选最佳给药浓度为50μg/ml，且该浓度下双辅料组细胞增值率略高于其他组。2.6h2o2损伤时间对肾细胞的影响肾细胞以胰酶消化后，调整细胞密度4×104个·ml-1，接种到96孔板上，每孔100μl细胞悬液。贴壁后每孔加入100μl1mmol/l的h2o2，损伤时间分别为0h、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h。达到损伤时间后弃去h2o2，用pbs清洗3次，加入100μl的1640培养基，每孔加入10μlcck-8溶液，继续培养1h，450nm测定od值，计算增殖率。结果见图1。图1结果显示，随着h2o2作用时间的延长，肾细胞增值率逐渐降低，作用2h后对细胞损伤效果基本不变。2.7elisa法测定肾细胞上清中pedf、bmp-7、hgf、vegf的含量肾细胞以胰酶消化后，调整细胞密度4×104个·ml-1，接种到96孔板上，每孔100μl细胞悬液。贴壁后弃掉上清，每孔加入100μl1mmol/l的h2o2，1h后弃去h2o2，用pbs清洗3次，给药组加入200μl50mg·l-1的不同样品药液、对照品，对照孔加入200μl的1640培养基，每组6个复孔。放入培养箱培养24h后，elisa法测定肾细胞上清中pedf、bmp-7、hgf、vegf的含量。结果见表1。表1巴戟天各工艺对nrk细胞分泌bmp-7、hgf、pege、vegf的影响注：与模型组比较*p<0.05，**p<0.01表1结果显示，与空白组相比，模型组的bmp-7、hgf、pege、vegf均显著下降(p<0.01)，与模型组相比，各给药组bmp-7、hgf、pege、vegf均有升高，其中盐草蒸组升高最为显著。说明各给药组均在不同程度上修复肾细胞损伤，盐草蒸组工艺效果最好。2.8对lps刺激的raw264.7细胞增殖的影响调整细胞密度为7.5×104个·ml-1，每孔100μl，接种于96孔培养板中，另留出1个孔，不加细胞悬液，加无血清培养基100μl作为空白对照组。37℃、5％co2条件下培养24h后，弃去原培养液，换无血清培养液，饥饿细胞24h，以使细胞周期同步化。弃去无血清培养液，给药组加入100μl浓度为5、10、50、100、200、400、800、1600mg·l-1的不同样品和对照品，对照孔加入100μl的1640培养基，每组6个复孔。药物作用3h后，除空白对照组外，每孔加入终浓度为5μg/ml的lps100μl刺激。在37℃、5％co2条件下培养箱培养20h后，每孔加入10μlcck-8溶液，37℃条件下继续培养1h，酶标仪于波长450nm处测定od值。并计算细胞相对存活率。细胞存活率(％)＝od实验组均值/od对照组均值×100％结果见图3。图3结果显示不同工艺制备的巴戟天炮制品对raw264.7细胞存活率的影响。在给药浓度为400μg/ml时，各组细胞存活率均最高，优选最佳给药浓度为400μg/ml，且该浓度下各组细胞存活率无显著差异。2.9巴戟天炮制品对lps刺激的raw264.7细胞吞噬活性的影响调整细胞密度至5×104个·ml-1，并接种于96孔培养板上，每孔体积100μl。置37℃，5％co2培养箱孵育24h后，弃上清液，换无血清培养液，饥饿细胞24h，以使细胞周期同步化。弃去无血清培养液，分组，空白对照组中加入含血清培养液200μl；模型对照组中加入10μg/ml的lps100μl，并以含血清培养液稀释至终体积为200μl；给药组分别加入100μl5、10、50、100、200、400、800、1600mg·l-1的不同样品和10μg/ml的lps100μl，每个浓度设6个复孔。37℃，5％co2培养箱中培养24h后，弃培养上清液后，加入0.1％中性红溶液200μl，37℃，5％co2孵育60min，弃中性红，pbs洗3遍，每次200μl，并甩干。加入醋酸-无水乙醇(1:1)细胞溶解液200μl/孔，4℃静置过夜，酶标仪570nm处测od值。并计算细胞相对吞噬率(rsr)。细胞相对吞噬率(％)＝(od实验组-od空白组)/(od对照组-od空白组)×100％。结果见表2。表2巴戟天炮制品对raw264.7细胞中性红吞噬作用组别给药浓度相对吞噬率％巴戟天400mg/ml54.36±5.20巴戟肉400mg/ml68.49±27.84盐巴戟400mg/ml10.38±8.36制巴戟400mg/ml43.82±7.83盐润草煮组(实施例6)400mg/ml46.96±9.68盐蒸草煮组(实施例7)400mg/ml23.23±15.80盐草蒸组(实施例8)400mg/ml48.51±12.51盐草煮组(实施例9)400mg/ml41.22±10.53草煮盐蒸组(实施例10)400mg/ml39.97±21.35盐润草煮组(实施例11)400mg/ml29.48±13.84从表2看出，盐草蒸组的相对吞噬率在各炮制品中为最高，显著高于单辅料盐制巴戟天的效果。2.10elisa法测定raw264.7细胞上清中no、tnf-α、il-6、il-2的含量细胞以胰酶消化后，调整细胞浓度1.9×105个·ml-1，接种到96孔板上，每孔100μl。步骤同2.8项下。elisa法测定细胞上清中no、tnf-α、il-6、il-2的含量。结果见表3。表3巴戟天各工艺对raw264.7细胞分泌no、tnf-α、il-2、il-6的影响注：与模型组比较*p<0.05，**p<0.01实验结果显示，与空白组相比，模型组的no、tnf-α、il-2、il-6释放增加。与模型组相比，各给药组均能抑制raw264.7细胞no、tnf-α、il-2、il-6的释放，表现较好的体外抗炎作用。实验例2炮制工艺参数对巴戟天中有效成分的影响巴戟天主要含有蒽醌、环烯醚萜苷、寡糖类等成分；甘草主要含有三萜皂苷、黄酮类等成分。前期实验结果表明，巴戟天炮制后，甲基异茜草素-1-甲醚、水晶兰苷、耐斯糖的含量均会发生不同程度的变化，基于以上研究成果，最终以甲基异茜草素-1-甲醚、水晶兰苷、耐斯糖作为指标成分考察炮制工艺。1.实验材料1.1实验仪器e2695-2998型高效液相色谱仪(美国waters公司)；fa1004电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；ae240型十万分之一电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；kq-250e型医用超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)。高效液相用乙腈(色谱纯，德国默克公司)；高效液相用甲醇(色谱纯，德国默克公司)；其余试剂均为分析纯。1.2药品巴戟天药材购自安徽亳州药材市场，经辽宁中医药大学中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为茜草科植物巴戟天morindaofficinalishow.的干燥根。水晶兰苷(供含量测定用，批号j0605as)；去乙酰基车叶草苷酸(供含量测定用，批号j0329as)、5-羟甲基糠醛(供含量测定用，批号j0501as)、甲基异茜草素1-甲醚(供含量测定用，批号j0307as)均购于美仑生物技术有限公司。2方法与结果2.1水晶兰苷、去乙酰车叶草苷酸、5-羟甲基糠醛的含量测定2.1.1对照品溶液的制备精密称取水晶兰苷3.16mg，去乙酰基车叶草苷酸1.5mg，5-羟甲基糠醛3.63mg置于同一10ml量瓶中，定容至刻度，即得，备用。2.1.2供试品溶液的制备取不同制备工艺得到的巴戟天炮制品，粉碎，过60目筛，精密称定1.0g，置于150ml的具塞锥形瓶中，加入80％甲醇100ml，常温下浸泡1h，超声(250w，40khz)1h，过滤，回收甲醇溶液，以80％甲醇定容至10ml量瓶。2.1.3色谱条件venusilmpc18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液梯度洗脱(0～25min，甲醇5％～28.8％)，检测波长：235nm，流速：0.8ml/min，柱温：25℃，进样量：2μl。2.4线性关系考察精密称取“2.1.1”项下的混合对照品溶液0.5、1、2、5、10μl，通过waters液相色谱仪，按“2.1.3”项下色谱条件进行检测，记录水晶兰苷，去乙酰基车叶草苷酸和5-羟甲基糠醛的色谱峰峰面积，以进样量x(μg)为横坐标，色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制三者的标准曲线。水晶兰苷的线性回归方程为y＝2000000x-4430，r2＝0.9999，其线性范围为：0.107μg-2.146μg；去乙酰基车叶草苷酸的线性回归方程为y＝2000000x+16844，r2＝0.9999，其线性范围为：0.034μg-0.677μg；5-羟甲基糠醛的线性回归方程为y＝1000000x-2401.3，r2＝0.9999，其线性范围为：0.028μg～0.558μg；2.2甲基异茜草素-1-甲醚含量测定2.2.1对照品溶液的制备精密称取甲基异茜草素-1-甲醚对照品2.93mg于5ml容量瓶中，甲醇定容，摇匀，作为对照品溶液，备用。2.2.2供试品溶液的制备称取不同炮制方法制备的巴戟天炮制品粉末(过60目筛)，精密称定2g，置于100ml圆底烧瓶中，再加入氯仿80ml回流提取两次，每次2h，合并滤液，回收氯仿。残渣以甲醇定容至10ml容量瓶中。取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得。2.2.3色谱条件ecosilc18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：乙腈-0.2％磷酸水溶液(20:80→42:58，15min，60:40→95:5，5min)梯度洗脱，检测波长277nm，流速1.0ml·min-1，柱温30℃，进样量20μl。2.2.4线性关系考察精密称取“2.2.1”项下的对照品溶液0.5、1、2、5、10μl，通过waters液相色谱仪，按“2.2.3”项下色谱条件进行检测，记录甲基异茜草素-1-甲醚的色谱峰峰面积，以进样量x(μg)为横坐标，色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，甲基异茜草素-1-甲醚的线性回归方程为y＝678582x-275722，r＝0.999。2.3不同工艺制备巴戟天炮制品的含量测定称取“2.1.2”“2.2.2”项下制备的不同工艺制备巴戟天炮制品的样品溶液，在上述色谱条件下，进样2μl、20μl，测定水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸和5-羟甲基糠醛、甲基异茜草素-1-甲醚的峰面积，根据标准曲线，测定不同制备工艺制得的巴戟天样品中水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸和5-羟甲基糠醛、甲基异茜草素-1-甲醚含量。表4不同制备工艺巴戟天炮制品中有效成分的测定结果实验结果：不同制备工艺得到巴戟天炮制品中水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸和5-羟甲基糠醛、甲基异茜草素-1-甲醚含量综合评分以盐草蒸组最高。当前第1页12