本发明属于纳米生物医药领域，具体涉及一种聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒及其制备方法与应用。
背景技术：
疫苗已在传染性疾病的预防中取得了巨大的成功，在肿瘤的治疗中表现出巨大的潜力。但是抗原肽疫苗普遍存在分子小、免疫原性弱、难以诱导机体产生有效免疫应答等不足，从而需要某种物质来增强其免疫作用。免疫佐剂是泛指一类能非特异性地通过上调免疫细胞表面分子、促进固有免疫应答等方式增强特异性免疫的物质。因此，免疫佐剂成为了疫苗不可或缺的组成部分，在产生持久保护性免疫中发挥着重要作用。有效的免疫佐剂可极大地提高疫苗的抗原呈递效率、抗原免疫原性和抗原诱导的免疫效应，在传染性疾病的预防和肿瘤的治疗中至关重要。但是，现有的免疫佐剂存在数量少、效应差、易产生局部敏感等缺陷，阻碍了疫苗的发展，且很难实现免疫佐剂与抗原的共传输。
多孔二氧化硅材料作为药物载体和免疫佐剂，在新型纳米载药体系、疫苗的设计和构建中发挥着重要的作用。一方面，多孔二氧化硅材料具有优异的物理和化学稳定性、良好的生物相容性、可调的粒径、易于被修饰、制备简单和成本可控等优良的性能；另一方面，多孔二氧化硅可实现抗原的交叉提呈，诱导γ干扰素的分泌，使淋巴细胞趋向于辅助性t细胞1介导的细胞免疫反应。其中，介孔二氧化硅纳米颗粒的免疫佐剂效应已被报道，尤其是中空介孔二氧化硅纳米颗粒，其中空结构能显著提高其免疫佐剂效应。
虽然多孔二氧化硅材料作为药物载体和免疫佐剂在生物医药方面取得了一定的进展，但是现有技术制备的二氧化硅材料，单分散性差，其载药量低，难以实现持续的抗原释放，而且溶酶体逃逸能力较弱难以实现抗原的交叉提呈，极大地降低了其载药性能和免疫佐剂效应，无法满足实际应用中的需求。这些不足与缺陷极大地限制了二氧化硅材料在实际应用中的价值。
技术实现要素：
本发明解决了现有技术中二氧化硅纳米材料应用于药物载体和免疫佐剂时单分散性差、载药量低、抗原无法持续释放，以及溶酶体逃逸能力弱致使难以实现抗原的交叉呈递的技术问题，提供了一种聚电解质杂化中空二氧化硅纳米颗粒及其制备方法与应用。
按照本发明的第一方面，提供了一种聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒，所述聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒内部为中空结构，外部壳层为聚电解质与二氧化硅的杂化结构；所述聚电解质与二氧化硅通过静电和氢键相互作用形成所述杂化结构；所述壳层分布有介孔。
优选地，所述聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的直径为20nm-1000nm；所述壳层的厚度为2nm-250nm；所述介孔的直径为0.5nm-50nm；所述聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的聚电解质的重量百分比为0.1wt％-50wt％。
优选地，所述聚电解质为聚乙烯亚胺及其衍生物、聚赖氨酸及其衍生物、聚二烯丙基二甲基氯化铵及其衍生物、二乙氨乙基葡聚糖及其衍生物、聚乙烯胺及其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、聚烯丙基胺及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、聚(β-氨基酯)及其衍生物或聚乙烯吡啶及其衍生物。
按照本发明的另一方面，提供给了一种聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法，包含以下步骤：
(1)硅源发生水解缩聚反应，所得产物与表面活性剂在实心二氧化硅纳米颗粒表面自组装形成壳层结构，得到具有核壳结构的二氧化硅纳米颗粒；
(2)将步骤(1)得到的核壳结构的二氧化硅纳米颗粒分散于碱性溶液中，在20℃-80℃条件下搅拌，所述核壳结构的二氧化硅纳米颗粒内核的实心二氧化硅部分水解，形成多孔二氧化硅；离心后取沉淀，洗去所述壳层结构的表面活性剂，得到具有核壳结构的介孔二氧化硅纳米颗粒；
(3)向步骤(2)得到的具有核壳结构的介孔二氧化硅纳米颗粒中加入聚电解质，使聚电解质与所述具有核壳结构的介孔二氧化硅纳米颗粒充分混匀；然后在25℃-98℃条件下刻蚀0.1h-72h，即得到聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒。
优选地，步骤(3)所述聚电解质为聚乙烯亚胺及其衍生物、聚赖氨酸及其衍生物、聚二烯丙基二甲基氯化铵及其衍生物、二乙氨乙基葡聚糖及其衍生物、聚乙烯胺及其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、聚烯丙基胺及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、聚(β-氨基酯)及其衍生物或聚乙烯吡啶及其衍生物。
优选地，所述聚乙烯亚胺为支链聚乙烯亚胺或直链聚乙烯亚胺；所述聚乙烯亚胺的分子量为0.2kda-200kda；所述聚乙烯亚胺的浓度为0.01mg/ml-30mg/ml。
优选地，步骤(1)中所述硅源为正硅酸乙酯、正硅酸甲酯、三甲基乙氧基硅烷或硅酸钠；步骤(2)中所述碱性溶液的浓度为0.1mol/l-0.8mol/l，搅拌的时间为0.1h-24h。
优选地，其特征在于，步骤(3)中所述刻蚀之后，还包括离心并洗去游离的聚电解质的步骤。
按照本发明的另一方面，提供了所述聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的应用，所述聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒应用于药物载体；
优选地，所述药物为基因、带负电的分子药物、带负电的多肽或带负电的蛋白质。
按照本发明的另一方面，提供了所述聚电解质中空介孔二氧化硅纳米颗粒的应用，所述聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒应用于抗病毒或抗肿瘤疫苗的免疫佐剂。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)本发明使用一定分子量的聚电解质，通过选择性刻蚀法，形成的聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒具有良好的单分散性、较好的生物相容性、较大的比表面积及孔体积，能形成较大的空腔，可提高纳米颗粒对药物的载药量，可作为药物载体用于生物医药领域，可高效装载基因、带负电的分子药物、带负电的多肽或带负电的蛋白质。
(2)由于聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒自身带正电，使得包载的药物，尤其是带负电的药物持续缓慢释放。此外，聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒不仅可提高对药物的包覆，还可提高细胞对纳米颗粒的吞噬效率，这些特性使其在药物装载与呈递等生物医药领域具有较好的应用前景。
(3)本发明提供的聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒不仅可提升对抗原多肽的负载和缓释能力，提高抗原呈递细胞对纳米颗粒的吞噬效率，还具有溶酶体逃逸和促进抗原的交叉提呈的能力，从而具有较强的免疫佐剂效应。聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒负载抗原后形成的疫苗，能激活机体增强的免疫响应，从而实现增强的抗病毒或抗肿瘤效应，可应用于抗病毒和抗肿瘤等生物医药领域。
(4)本发明提供的聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒与病毒抗原形成的疫苗可有效地杀伤病毒，在抗病毒等生物医药领域具有良好的应用前景。
(5)本发明提供的聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒与肿瘤抗原形成的疫苗可有效地杀伤肿瘤细胞，从而可有效地抑制肿瘤的生长；在抗肿瘤及肿瘤免疫治疗等生物医药领域具有良好的应用前景。
(6)本发明提供的聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法，聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的中空空腔尺寸、壳层分布介孔的孔径、壳层的厚度和颗粒直径可以调节；可通过调节刻蚀时间、聚电解质的浓度，调节聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒中聚电解质的含量。
(7)本发明提供的聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法，制备时间短、操作简单、可重复性强，便于大规模制备。
附图说明
图1(a)是实施例2制得的聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的透射电镜图；图1(b)是实施例5制得的聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的透射电镜图。
图2是聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的傅里叶变换红外光谱图。
图3是黑素瘤抗原trp2的体外释放曲线。
图4是聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的合成过程示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒thmsns的制备方法，图4是合成过程示意图，具体包含以下步骤：
(1)实心二氧化硅(ssio2)纳米颗粒的制备：用溶胶-凝胶法合成ssio2纳米颗粒，50ml乙醇、4ml去离子水和2ml浓氨水混合后加入0.3mlteos，在30℃水浴的条件下搅拌6h，即可得到ssio2纳米颗粒。
(2)具有核壳结构的二氧化硅(ssio2@msio2-micelle)纳米颗粒的制备：混合110ml去离子水、5ml乙醇和600mgctab，随后把上一步得到的ssio2纳米颗粒加入混合液中，搅拌30min后，加入0.1mlteos，在30℃水浴条件下过夜反应，即可得到ssio2@msio2-micelle纳米颗粒。
(3)具有核壳结构的介孔二氧化硅(msio2@msio2)纳米颗粒的制备：将上述溶液离心，分散到75ml浓度为0.4m的碳酸钠(na2co3)溶液中，在80℃条件下搅拌0.1h，结束后离心，在超声的协助下分别用盐酸/乙醇溶液和去离子水洗三次，即可得到msio2@msio2纳米颗粒。
(4)聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒(thmsns)的制备：取上述制备的msio2@msio2纳米颗粒，离心除去上清液，随后加入1ml浓度为1mg/ml的分子量为25kda的支链聚乙烯亚胺(pei)溶液，超声分散，在60℃条件下刻蚀1.0h。离心后，用去离子水洗三次，洗去游离的聚乙烯亚胺，即可获得聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒thmsns，其粒径为20nm，孔径为0.5nm，壁厚为2nm，pei的含量为12.8wt％。
实施例2
聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒thmsns的制备方法，包含以下步骤：
(1)实心二氧化硅(ssio2)纳米颗粒的制备：用溶胶-凝胶法合成ssio2纳米颗粒，100ml乙醇、8ml去离子水和4ml浓氨水混合后加入3mlteos，在30℃水浴条件下搅拌6h，即可得到ssio2纳米颗粒。
(2)具有核壳结构的二氧化硅(ssio2@msio2-micelle)纳米颗粒的制备：混合220ml去离子水、10ml乙醇和1200mgctab，随后把上一步得到的ssio2纳米颗粒加入混合液中，搅拌30min后，加入1.0mlteos，在30℃水浴条件下过夜反应，即可得到ssio2@msio2-micelle纳米颗粒。
(3)具有核壳结构的介孔二氧化硅(msio2@msio2)纳米颗粒的制备：将上述溶液离心，分散到150ml浓度为0.4m的na2co3溶液中，在50℃条件下预处理0.5h，预处理结束后离心，在超声的协助下分别用盐酸/乙醇溶液和去离子水洗三次，即可得到msio2@msio2纳米颗粒。
(4)聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒(thmsns)的制备：取上述制备的msio2@msio2纳米颗粒，离心除去上清液，随后加入1ml浓度为2mg/ml的分子量25kda的支链pei溶液，超声分散，在60℃条件下刻蚀2h。离心后，用去离子水洗三次，即可获得thmsns，其粒径为200nm，孔径为2.5nm壁厚为22nm，pei的含量为16.8wt％。图2是形成的thmsns的傅里叶变换红外光谱。在1449cm-1处是c-h的弯曲振动，说明有机官能团如pei的存在，1632和1554cm-1处的峰是n-h的弯曲振动，这说明pei存在于thmsns中。图1(a)是实施例2制得的聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的透射电镜图，从图1(a)中可以看出，得到的聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒分散性好，粒径均一，具有较大的中空空腔，壳层具有介孔。
实施例3
聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒thmsns的制备方法，包含以下步骤：
(1)实心二氧化硅(ssio2)纳米颗粒的制备：用溶胶-凝胶法合成ssio2纳米颗粒，100ml乙醇、8ml去离子水和4ml浓氨水混合后加入5mlteos，在30℃水浴条件下搅拌24h，即可得到ssio2纳米颗粒。
(2)具有核壳结构的二氧化硅(ssio2@msio2-micelle)纳米颗粒的制备：混合500ml去离子水、20ml乙醇和2500mgctab，随后把上一步得到的ssio2纳米颗粒加入混合液中，搅拌30min后，加入3.0mlteos，在30℃水浴条件下过夜反应，即可得到ssio2@msio2-micelle纳米颗粒。
(3)具有核壳结构的介孔二氧化硅(msio2@msio2)纳米颗粒的制备：将上述溶液离心，分散到550ml浓度为0.8m的na2co3溶液中，在50℃条件下预处理0.2h，预处理结束后离心，在超声的协助下分别用盐酸/乙醇溶液和去离子水洗三次，即可得到msio2@msio2纳米颗粒。
(4)聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒(thmsns)的制备：取上述制备的msio2@msio2纳米颗粒，离心除去上清液，随后加入1ml浓度为50mg/ml的分子量为0.2kda的支链pei溶液，超声分散，在25℃条件下刻蚀72h。离心后，用去离子水洗三次，即可获得thmsns，其粒径为600nm，孔径为10nm，壁厚为50nm，pei的含量为50wt％。
实施例4
聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒thmsns的制备方法，包含以下步骤：
(1)实心二氧化硅(ssio2)纳米颗粒的制备：用溶胶-凝胶法合成ssio2纳米颗粒，100ml乙醇、8ml去离子水和4ml浓氨水混合后加入3mlteos，在30℃水浴条件下搅拌6h，即可得到ssio2纳米颗粒。
(2)具有核壳结构的二氧化硅(ssio2@msio2-micelle)纳米颗粒的制备：混合220ml去离子水、10ml乙醇和1200mgctab，把上一步得到的ssio2纳米颗粒加入混合液中，搅拌30min后，加入1.0mlteos，在30℃水浴条件下过夜反应，即可得到ssio2@msio2-micelle纳米颗粒。
(3)具有核壳结构的介孔二氧化硅(msio2@msio2)纳米颗粒的制备：将上述溶液离心，分散到150ml浓度为0.1m的na2co3溶液中，在20℃条件下预处理24h，预处理结束后离心，在超声的协助下分别用盐酸/乙醇溶液和去离子水洗三次，即可得到msio2@msio2纳米颗粒。
(4)聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒(thmsns)的制备：取上述制备的msio2@msio2纳米颗粒，离心除去上清液，随后加入1ml浓度为3mg/ml的分子量为200kda的支链pei溶液，超声分散，在60℃条件下刻蚀6h。离心后，用去离子水洗三次，即可获得thmsns，其粒径为1000nm，孔径为20nm，壁厚为250nm，pei的含量为15wt％。
实施例5
聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒thmsns的制备方法，包含以下步骤：
(1)实心二氧化硅(ssio2)纳米颗粒的制备：用溶胶-凝胶法合成ssio2纳米颗粒，100ml乙醇、8ml去离子水和4ml浓氨水混合后加入3mlteos，在30℃水浴条件下搅拌6h，即可得到ssio2纳米颗粒。
(2)具有核壳结构的二氧化硅(ssio2@msio2-micelle)纳米颗粒的制备：混合220ml去离子水、10ml乙醇和1200mgctab，随后把上一步得到的ssio2纳米颗粒加入混合液中，搅拌30min后，加入3.0mlteos，在30℃水浴条件下过夜反应，即可得到ssio2@msio2-micelle纳米颗粒。
(3)具有核壳结构的介孔二氧化硅(msio2@msio2)纳米颗粒的制备：将上述溶液离心，然后分散到150ml浓度为0.4m的na2co3溶液中，在50℃条件下预处理0.5h，预处理结束后离心，在超声的协助下分别用盐酸/乙醇溶液和去离子水洗三次，即可得到msio2@msio2纳米颗粒。
(4)聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒(thmsns)的制备：取上述制备的msio2@msio2纳米颗粒，离心除去上清液，随后加入1ml浓度为0.01mg/ml的分子量为25kda的直链pei溶液，超声分散，在98℃条件下刻蚀6h。离心后，用去离子水洗三次，即可获得thmsns，其粒径为180nm，孔径为8nm，壁厚为45nm，pei的含量为0.1wt％。图1(b)是实施例5制得的聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的透射电镜图，得到的聚乙烯亚胺杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒分散性好，粒径均一，具有较大的中空空腔，壳层具有介孔。
实施例6
本发明所述的thmsns与模式抗原鸡卵白蛋白形成的疫苗及对其免疫效应的测试。
(1)本发明所述的thmsns与鸡卵白蛋白(ova)形成的疫苗(ova@thmsns疫苗)的制备：把ova溶于无菌水中，浓度为2mg/ml。取1ml加入thmsns，在4℃条件下孵育24h，即得到ova@thmsns疫苗。ova的载药量和包封率分别为85％和14.5％。
(2)对所述ova@thmsns疫苗的体外细胞吞噬研究：将ova@thmsns疫苗与未成熟的小鼠骨髓来源的树突状细胞孵育，孵育不同时间后分别进行处理，然后用流式细胞仪检测树突状细胞对其的体外吞噬情况。研究结果表明，ova@thmsns疫苗能有效地被树突状细胞吞噬，且吞噬量随着时间的增加而增加。
(3)对所述ova@thmsns疫苗的体外诱导树突状细胞熟化研究：将ova@thmsns疫苗分别与未成熟树突状细胞孵育48h后，收集细胞，采用荧光抗体进行负染后，用流式细胞仪检测ova@thmsns疫苗在体外诱导树突状细胞的熟化情况。结果表明，与空白组相比，ova@thmsns对cd86的表达表现出较高的刺激效应。
(4)对所述ova@thmsns疫苗的体内免疫效应的研究：把小鼠随机分组，接种ova@thmsns疫苗，共免疫三次。随后检测体内淋巴细胞的增值和分化情况。结果表明，与空白组相比，ova@thmsns能有效的促进小鼠淋巴细胞的增值与分化。
实施例7
本发明所述thmsns与黑素瘤抗原trp2形成的肿瘤疫苗及其抗肿瘤效应。
(1)负载黑素瘤抗原多肽trp2的肿瘤疫苗(trp2@thmsns疫苗)的制备：将trp2溶于二甲亚砜中，浓度为5mg/ml。取上述trp2溶液加入到5mgthmsns中。然后，通过溶剂挥发法制备trp2@thmsns疫苗，trp2的包封率和载药量分别为95％和9.1％。
(2)对所述trp2@thmsns疫苗的体外释放效应的研究：如图4所示，在0.5h时，trp2累计释放量为12.5％；而在1h时，trp2累计释放量为35.8％。trp2可缓慢释放达到48h，累计释放率可达71.8％。图3是黑素瘤抗原trp2的体外释放曲线，从图3可以看出，trp2@thmsns疫苗具有较好的缓慢释放黑素瘤抗原trp2的能力。
(3)对所述trp2@thmsns疫苗的体外细胞吞噬：将trp2@thmsns疫苗与未成熟的小鼠骨髓来源的树突状细胞孵育，孵育不同时间后分别进行处理，然后用流式细胞仪检测树突状细胞对其的体外吞噬情况。研究结果表明，trp2@thmsns疫苗能有效地被树突状细胞吞噬，吞噬量随着时间的增加而增加。
(4)对所述trp2@thmsns疫苗的体外诱导树突状细胞熟化研究：分别与未成熟树突状细胞孵育48h后，收集细胞。采用荧光抗体进行负染后，用流式细胞仪进行检测trp2@thmsns疫苗的体外诱导树突状细胞的熟化情况。结果表明与空白组相比，trp2@thmsns疫苗对cd86的表达表现出较高的刺激效应，说明trp2@thmsns疫苗能有效地促进树突状细胞的熟化。
(5)对所述trp2@thmsns疫苗的体内抗肿瘤效应的研究：构建肿瘤挑战模型，把小鼠随机分组，接种trp2@thmsns疫苗，共免疫三次。免疫结束后第四天，植入黑素瘤细胞对小鼠进行挑战，观察肿瘤的生长情况并测量肿瘤的体积。在植瘤后第20天处死小鼠，收集肿瘤并称重。研究结果表明，与空白组对比，trp2@thmsns疫苗能有效地延缓肿瘤的发生，抑制肿瘤的生长和转移。
实施例8
一种聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒，所述聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒内部为中空结构，外部壳层为聚电解质与二氧化硅的杂化结构；所述聚电解质与二氧化硅通过静电和氢键相互作用形成所述杂化结构；所述壳层分布有介孔。所述聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的直径为20nm；所述壳层的厚度为2nm；所述介孔的直径为0.5nm。所述聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的聚电解质的重量百分比为0.1wt％。
实施例9
一种聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒，所述聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒内部为中空结构，外部壳层为聚电解质与二氧化硅的杂化结构；所述聚电解质与二氧化硅通过静电和氢键相互作用形成所述杂化结构；所述壳层分布有介孔。所述聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的直径为250nm；所述壳层的厚度为22nm；所述介孔的直径为2.5nm。所述聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的聚电解质的重量百分比为15wt％。
实施例10
一种聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒，所述聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒内部为中空结构，外部壳层为聚电解质与二氧化硅的杂化结构；所述聚电解质与二氧化硅通过静电和氢键相互作用形成所述杂化结构；所述壳层分布有介孔。所述聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的直径为1000nm；所述壳层的厚度为250nm；所述介孔的直径为50nm。所述聚电解质杂化中空介孔二氧化硅纳米颗粒的聚电解质的重量百分比为50wt％。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。