一种具有RNA干扰功能的微生物纤维素复合敷料及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医学工程技术领域，更具体地，涉及一种具有rna干扰功能、用于治疗糖尿病足溃疡的微生物纤维素复合敷料及其制备方法和应用。

背景技术

微生物纤维素是由醋酸菌属、土壤杆菌属和八叠球菌属等微生物通过葡萄糖单元聚合而成的纤维素（wojciechk.c.,etal.biomacromoleculse,2007,8,1-12;hanifu.,etal.carbohydratepolymers,2016,150,330-352），其高度多孔结构和高度持水能力使其能为伤口创造一个湿润的环境并吸收渗出液而被用作伤口敷料（klemm,d.,etal.progressinpolymerscience,2001,26,1561-1603）。

糖尿病患者皮肤易损，且一旦出现伤口很难愈合，其中一个原因是伤口微观的改变，即过量的基质金属蛋白酶9（mmp-9）分泌和生长因子缺乏等（liuy.etal.diabetescare,2009,32,117-119;lobmannr.,etal.diabetescare,2005,28,461-471）。有研究发现，在糖尿病足患者中，单纯应用生长因子并不能够达到加快溃疡的愈合，因为mmp-9的升高可以降解生长因子、生长因子受体等，可加重局部伤口炎症反应及减慢伤口的愈合。因此抑制伤口局部的mmp-9表达是促进糖尿病足伤口愈合的方法之一（wus.c.,etal.vascularhealth&riskmanagement,2007,3,65-76）。但到目前为止尚无mmp-9特异性抑制剂，而通过rna干扰可实现对mmp-9的特异性抑制。我们曾经报道一种β-cd-（d3）7/mmp-9sirna复合物能改善糖尿病大鼠的伤口愈合过程（lin.,etal.acsappliedmaterials&interfaces,2017,9,17417-17426）。然而，单一的rna干扰纳米粒在伤口处容易流失且分布不均匀，如何提高其在皮肤慢性溃疡局部的附着能力，使具有rna干扰功能的纳米粒实现可控释放、延长其作用时间，仍然存在较大困难。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种具有rna干扰功能的微生物纤维素复合敷料。

本发明的第二个目的是提供所述具有rna干扰功能的微生物纤维素复合敷料的制备方法。

本发明的第三个目的是提供所述具有rna干扰功能的微生物纤维素复合敷料的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种具有rna干扰功能的微生物纤维素复合敷料的制备方法，将阳离子超支化多糖衍生物与负电性的sirna通过静电相互作用形成复合物纳米粒溶液，再将其负载到微生物纤维素上，制备得到具有rna干扰功能的微生物纤维素复合敷料。

本发明通过将带负电荷的sirna与阳离子超支化多糖衍生物通过静电相互作用先制备得到阳离子超支化多糖衍生物//sirna复合物纳米粒溶液，然后再将得到的复合物纳米粒溶液负载到微生物纤维素，利用微生物纤维素高度多孔结构有利于负载阳离子超支化多糖衍生物/sirna复合物纳米粒复合敷料的优点，将阳离子多糖衍生物/sirna复合物纳米粒均匀分布在微生物纤维素孔洞中并黏连在纤维束上，从而实现具有rna干扰功能的纳米粒针对作用靶标的延长释放的作用，同时微生物纤维素高度持水能力有利于为创口提供一个湿润的环境并吸收过量渗出液，从而更好促进伤口愈合，从而更好地去治疗可通过rna干扰作用进行诊治的创口疾病。

优选地，所述阳离子超支化多糖衍生物中的多糖为糖原或支链淀粉。

优选地，所述阳离子超支化多糖衍生物中的阳离子取代基为乙二胺基、二乙烯三胺基、3-二甲胺基丙胺基、三乙烯四胺基、n-氨乙基哌嗪基或第四代聚酰胺-胺树枝状聚合物；阳离子取代基的取代度为0.1～3.0。

优选地，所述sirna为mmp-9sirna，可抑制mmp-9的表达；即所述阳离子超支化多糖衍生物/sirna复合物纳米粒为含有阳离子超支化多糖衍生物及mmp-9sirna的纳米粒。

优选地，所述含有正电性胺类基团的阳离子超支化多糖衍生物与负电性的sirna的质量比为0.1～50。

优选地，所述微生物纤维素来源于醋酸菌属、土壤杆菌属、八叠球菌属、根瘤菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、气杆菌属或固氮菌属，厚度为3mm、8mm或15mm。

具体地，所述制备方法具体包括如下步骤：

s1.将含有正电性胺类基团的阳离子超支化多糖衍生物水溶液与sirna水溶液以溶质的质量比为0.1～50混合，旋涡振荡5～30秒，静置10～30分钟，得到阳离子超支化多糖衍生物/sirna复合物纳米粒溶液；

s2.将微生物纤维素用水纯化1～7天，直至纯化用水的ph为7，冷冻干燥得到冻干的微生物纤维素；

s3.将s2冻干的微生物纤维素加入到s1制备得到的阳离子超支化多糖衍生物/sirna复合物纳米粒溶液中，振荡浸泡6～36小时，振荡速率为10～500rpm，温度为4～40℃；

s4.取出s3的微生物纤维素并加入到水中清洗，除去未被微生物纤维素负载的复合物纳米粒，振荡5～20秒，振荡速率为10～500rpm，温度为4～40℃，即得具有rna干扰功能的微生物纤维素复合敷料。

优选地，步骤s1、s4所述水为depc水或rnaase-free水，其目的是确保制备过程中sirna不被rna酶降解。

优选地，步骤s2所述水为去离子水、超纯水或蒸馏水。

优选地，步骤s1所述含有正电性胺类基团的阳离子超支化多糖衍生物水溶液与sirna水溶液的浓度为1～10mg/ml。

优选地，步骤s2所述冻干的微生物纤维素的质量为1～100mg，所述阳离子超支化多糖衍生物/sirna复合物纳米粒溶液中sirna浓度为0.05～0.5mg/ml。

优选地，步骤s2所述冻干的微生物纤维素与阳离子超支化多糖衍生物/sirna复合物纳米粒溶液的质量体积比为0.02～20mg/ml。

优选地，步骤s2所述冷冻干燥的冷冻温度为-20℃至-80℃，冷冻干燥时间为12～48小时，冷冻干燥的目的是使微生物纤维素形貌在干燥过程中的形态不发生改变。

本发明还请求保护上述任一项所述制备方法制备得到具有rna干扰功能的微生物纤维素复合敷料。

当sirna为mmp-9sirna时，本发明负载阳离子超支化多糖衍生物/sirna复合物的微生物纤维素复合敷料能抑制糖尿病伤口的mmp-9过量表达，有利于糖尿病足溃疡的愈合，同时微生物纤维素高度持水能力有利于为糖尿病足伤口提供一个湿润的环境并吸收过量渗出液从而更好促进糖尿病足溃疡的愈合。

因此，上面所述微生物纤维素复合敷料在制备治疗糖尿病足溃疡的药剂中的应用也在本发明保护范围内。

本发明所述微生物纤维素复合敷料制备工艺流程图如图1所示。与单纯使用具有rna干扰功能的纳米粒相比，具有rna干扰功能、用于治疗糖尿病足溃疡的微生物纤维素复合敷料具有以下特点：

（1）具有rna干扰功能、用于治疗糖尿病足溃疡的微生物纤维素复合敷料，可以缓慢释放sirna纳米粒，并显著延长sirna纳米粒的作用时间。

（2）微生物纤维素复合敷料为伤口提供一个湿润和透气的环境，促进糖尿病足溃疡的愈合。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明制备得到的阳离子超支化多糖衍生物/sirna复合物能抑制糖尿病伤口的mmp-9过量表达，有利于糖尿病足溃疡的愈合，因而在通过基因治疗法高效、安全治疗糖尿病足溃疡方面具有一定的应用前景。并利用微生物纤维素高度多孔结构有利于负载阳离子超支化多糖衍生物/sirna复合物纳米粒复合敷料的优点，将阳离子多糖衍生物/sirna复合物纳米粒均匀分布在微生物纤维素孔洞中并黏连在纤维束上，来实现具有rna干扰功能的纳米粒的延长释放并用于治疗糖尿病足溃疡；微生物纤维素高度持水能力有利于为糖尿病足伤口提供一个湿润的环境并吸收过量渗出液从而促进糖尿病足溃疡的愈合。而且，所述复合敷料制备条件温和，工艺简单，操作方便，有利于实现产业化生产。

附图说明

图1为本发明具有rna干扰功能、用于治疗糖尿病足溃疡的微生物纤维素复合敷料的制备工艺流程图。

图2为本发明制备的（a）含有3-二甲基丙胺基团的阳离子超支化糖原衍生物/mmp-9sirna和（b）含有第四代聚酰胺-胺基团的阳离子超支化糖原衍生物/mmp-9sirna在不同质量比下的复合物纳米粒凝胶电泳图（w/w表示阳离子超支化糖原衍生物与mmp-9sirna的质量比）。

图3为本发明制备的含有3-二甲基丙胺基团的阳离子超支化糖原衍生物/mmp-9sirna和含有第四代聚酰胺-胺基团的阳离子超支化糖原衍生物/mmp-9sirna在不同质量比下的复合物纳米粒的zeta电位图（w/w表示阳离子超支化糖原衍生物与mmp-9sirna的质量比）。

图4为本发明制备的含有3-二甲基丙胺基团的阳离子超支化糖原衍生物/mmp-9sirna和含有第四代聚酰胺-胺基团的阳离子超支化糖原衍生物/mmp-9sirna在不同质量比下的复合物纳米粒的粒径分析图（w/w表示阳离子超支化糖原衍生物与mmp-9sirna的质量比）。

图5为本发明制备的（a）含有3-二甲基丙胺基团的阳离子超支化糖原衍生物/mmp-9sirna复合物纳米粒和（b）含有第四代聚酰胺-胺基团的阳离子超支化糖原衍生物/mmp-9sirna复合物纳米粒（质量比均为10）的扫描电镜图。

图6为本发明中不同厚度的冻干微生物纤维素（a）吸水率以及（b）保水率随时间变化图。

图7为本发明制备的（a）冻干的微生物纤维素原料、（b）含有3-二甲基丙胺基团的阳离子超支化糖原衍生物/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料以及（c）含有第四代聚酰胺-胺基团的阳离子超支化糖原衍生物/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料的扫描电镜图。

图8为本发明制备的含3-二甲胺基丙胺基团的阳离子超支化糖原衍生物/fam-sirna/微生物纤维素复合敷料以及含第四代聚酰胺-胺基团的阳离子超支化糖原衍生物/fam-sirna/微生物纤维素复合敷料的sirna体外释放结果图。

图9为本发明制备的（a）含3-二甲胺基丙胺基团的阳离子超支化糖原衍生物/fam-sirna/微生物纤维素复合敷料以及（b）含第四代聚酰胺-胺基团的阳离子超支化糖原衍生物/fam-sirna/微生物纤维素复合敷料的第1、4和7天的体外释放液中sirna复合物纳米粒被人永生化表皮细胞内吞效率图。

图10为不同伤口处理方式的正常大鼠以及糖尿病大鼠伤口在第0、4、7天的伤口愈合图。

图11为不同伤口处理方式的正常大鼠以及糖尿病大鼠伤口在第7天的伤口愈合率图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1

1、具有rna干扰功能、用于治疗糖尿病足溃疡的微生物纤维素复合敷料的制备

（1）称取含有3-二甲胺基丙胺基团的阳离子超支化糖原衍生物（命名为gly-dmapa）0.1克溶解在33.3毫升depc水中，得到3mg/ml溶液，称取含有第四代聚酰胺-胺基团的阳离子超支化糖原衍生物（命名为gly-d4）0.1克溶解在33.3毫升depc水中，得到3mg/ml溶液；将10odmmp-9sirna溶解在0.12毫升dpec水中得到0.26mg/ml溶液，将gly-dmapa、gly-d4分别与mmp-9sirna以溶质的质量比为2.5：1混合，漩涡振荡30秒，静置30分钟，得到gly-dmapa/mmp-9sirna和gly-d4/mmp-9sirna复合物纳米粒溶液。

（2）剪取厚度为15mm，面积为10×10厘米微生物纤维素浸泡到蒸馏水中纯化5天，直至纯化的蒸馏水ph为7，取出微生物纤维素在-20℃下进行冷冻，并冷冻干燥48小时，得到冻干的微生物纤维素。

（3）称取2块10毫克冻干的微生物纤维素分别浸泡到步骤（1）得到的gly-dmapa/mmp-9sirna和gly-d4/mmp-9sirna复合物溶液中，在4℃，50rpm振荡速率下振荡浸泡24小时。

（4）取出步骤（3）的微生物纤维素并加入到depc水中，在4℃，100rpm振荡速率下，振荡清洗20秒，取出得到的微生物纤维素为具有rna干扰功能、用于治疗糖尿病足溃疡的微生物纤维素复合敷料（命名为gly-dmapa/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料和gly-d4/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料）。

2、结果

（1）为证实（a）gly-dmapa和（b）gly-d4对mmp-9sirna的复合能力，用gly-dmapa和gly-d4与mmp-9sirna复合后进行琼脂糖凝胶电泳实验，所得琼脂糖凝胶电泳结果分别如图2-a和2-b所示。质量比（w/w）为阳离子超支化糖原衍生物与mmp-9sirna的质量比。可见当质量比为大于等于1的时候，gly-dmapa与mmp-9sirna完全复合，当质量比大于10的时候，gly-d4与mmp-9sirna完全复合。

（2）将所得的gly-dmapa和gly-d4与mmp-9sirna配成不同质量比的纳米复合物溶液后，用zeta电位仪测试纳米复合物的zeta电位，所得结果如图3所示。当gly-dmapa与mmp-9sirna的质量比大于等于1时，纳米复合物zeta电位为正值，而gly-d4与mmp-9sirna的质量比大于等于0.5时，纳米复合物zeta电位即为正值。

（3）将所得的gly-dmapa和gly-d4与mmp-9sirna配成不同质量比的纳米复合物溶液后，用动态光散射仪测试纳米复合物的流体力学直径，所得结果如图4所示。当gly-dmapa与mmp-9sirna的质量比大于等于2.5时，纳米复合物的动态力学直径在50～200nm范围内。当gly-d4与mmp-9sirna的质量比大于等于2.5时，纳米复合物的动态力学直径在125～200nm范围内。

（4）将所得的（a）gly-dmapa和（b）gly-d4与mmp-9sirna配成质量比为10的纳米复合物溶液后，取微量溶液滴加到铝箔上自然干燥后用扫描电子显微镜观察其形貌，所得结果分别如图5-a和5-b所示。gly-dmapa/sirna复合物通过静电相互作用形成球形复合物，直径在200nm左右，gly-d4/sirna复合物形貌为不规则球状，大小不一，粒径在150～350nm之间，扫描电镜观察结果与动态光散射测试结果基本相符合。

（5）将冻干后厚度分别为3mm、8mm以及15mm的微生物纤维素进行（a）吸水率和（b）保水率测试，所得结果分别如图6-a和6-b所示。3mm、8mm和15mm厚度的细微生物纤维素吸水率分别为56、61和70g/g，保水时间分别为8、14和16小时。

（6）将所得（a）纯化后的微生物纤维素原料及制备得到的（b）gly-dmapa/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料和（c）gly-d4/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料分别进行扫描电镜观察，所得结果分别如图7-a，7-b和7-c所示。可看出复合敷料中的阳离子多糖衍生物/sirna复合物纳米粒分布在微生物纤维素孔洞中并黏连在纤维束上。

（7）将所得的gly-dmapa/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料和gly-d4/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料通过荧光光谱法测试其体外释放的sirna浓度随时间变化，所得结果如图8所示。gly-dmapa/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料在7天里能缓慢释放sirna复合物，在第7天达到释放平衡，gly-d4/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料在释放初期出现暴释，在第3天开始缓慢释放sirna复合物，在第7天达到释放平衡。

（8）将所得的（a）gly-dmapa/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料和（b）gly-d4/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料在无血清培养基中进行体外释放，并取其第1、4和7天的体外释放液通过流式细胞仪测试其中sirna复合物纳米粒被人永生化表皮细胞内吞的效率，所得结果如图9所示。（a）gly-dmapa/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料体外释放液中sirna复合物纳米粒在第1、4和7天的细胞内吞效率均高于95%，能较好地被人永生化表皮细胞内吞，而（b）gly-d4/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料体外释放液中sirna复合物纳米粒在第1、4和7天的细胞内吞效率均低于5%，可能与gly-d4/mmp-9sirna的稳定性较差有关。

（9）为证实gly-dmapa/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料能对糖尿病伤口愈合有促进作用，采用糖尿病大鼠伤口模型模拟糖尿病伤口，设置不同处理方式组别如下：对照组为（a）正常大鼠组（只包扎伤口）及（b）糖尿病大鼠组（只包扎伤口），实验组为（c）涂抹gly-dmapa/sirna溶液组、（d）微生物纤维素组以及（e）gly-dmapa/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料。所得结果如图10所示，其第7天伤口愈合率如图11所示。（b）糖尿病大鼠对照组的第7天伤口愈合率最小，仅为45%，（a）正常大鼠对照组伤口愈合率为64%，而（c）涂抹gly-dmapa/mmp-9sirna溶液组为57%，（d）微生物纤维素组为60%，（e）gly-dmapa/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料组为74%。结果证明gly-dmapa/mmp-9sirna及微生物纤维素对糖尿病大鼠伤口愈合有一定促进作用，而gly-dmapa/mmp-9sirna/微生物纤维素复合敷料能结合mmp-9sirna以及微生物纤维素的综合效果使糖尿病大鼠伤口愈合更快。

实施例2

1、具有rna干扰功能、用于治疗糖尿病足溃疡的微生物纤维素复合敷料的制备

（1）称取含有二乙烯三胺基团的阳离子超支化糖原衍生物（命名为gly-deta）0.1克溶解在100毫升depc水中，得到1mg/ml溶液，将10odmmp-9sirna溶解在0.12毫升dpec水中得到0.26mg/ml溶液，将gly-deta和mmp-9sirna以溶质的质量比为2.5：1混合，漩涡振荡60秒，静置10分钟，得到gly-deta/mmp-9sirna复合物纳米粒溶液。

（2）剪取厚度为3mm，面积为10×10厘米微生物纤维素浸泡到蒸馏水中纯化4天，直至纯化的蒸馏水ph为7，取出微生物纤维素在-80℃下进行冷冻，并冷冻干燥48小时，得到冻干的微生物纤维素。

（3）称取10毫克冻干的微生物纤维素浸泡到步骤（1）得到的gly-deta/mmp-9sirna复合物溶液中，在25℃，50rpm振荡速率下振荡浸泡36小时。

（4）取出步骤（3）的微生物纤维素并加入到depc水中，在25℃，100rpm振荡速率下，振荡清洗10秒，取出得到的微生物纤维素为具有rna干扰功能、用于治疗糖尿病足溃疡的微生物纤维素复合敷料。

实施例3

1、具有rna干扰功能、用于治疗糖尿病足溃疡的微生物纤维素复合敷料的制备

（1）称取含有3-二甲胺基丙胺基团的阳离子超支化支链淀粉衍生物（命名为amyp-dmapa）0.1克溶解在33.3毫升depc水中，得到3mg/ml溶液，将10odmmp-9sirna溶解在0.12毫升dpec水中得到0.26mg/ml溶液，将amyp-dmapa和mmp-9sirna以溶质的质量比为10：1混合，漩涡振荡20秒，静置20分钟，得到amyp-dmapa/mmp-9sirna复合物纳米粒溶液。

（2）剪取厚度为3mm，面积为10×10厘米微生物纤维素浸泡到蒸馏水中纯化3天，直至纯化的蒸馏水ph为7，取出微生物纤维素在-20℃下进行冷冻，并冷冻干燥24小时，得到冻干的微生物纤维素。

（3）称取10毫克冻干的微生物纤维素浸泡到步骤（1）得到的amyp-dmapa/mmp-9sirna复合物溶液中，在37℃，200rpm振荡速率下振荡浸泡24小时。

（4）取出步骤（3）的微生物纤维素并加入到depc水中，在37℃，100rpm振荡速率下，振荡清洗10秒，取出得到的微生物纤维素为具有rna干扰功能、用于治疗糖尿病足溃疡的微生物纤维素复合敷料。

实施例4

1、具有rna干扰功能、用于治疗糖尿病足溃疡的微生物纤维素复合敷料的制备

（1）称取含有三乙烯四胺基团的阳离子超支化支链淀粉衍生物（命名为amyp-teta）0.1克溶解在100毫升depc水中，得到1mg/ml溶液，将10odmmp-9sirna溶解在0.12毫升dpec水中得到0.26mg/ml溶液，将amyp-teta和mmp-9sirna以溶质的质量比为10：1混合，漩涡振荡10秒，静置30分钟，得到amyp-teta/mmp-9sirna复合物纳米粒溶液。

（2）剪取厚度为8mm面积为10×10厘米微生物纤维素浸泡到去离子水中纯化7天，直至纯化的去离子水ph为7，取出微生物纤维素在-40℃下进行冷冻，并冷冻干燥48小时，得到冻干的微生物纤维素。

（3）称取10毫克冻干的微生物纤维素浸泡到步骤（1）得到的amyp-teta/mmp-9sirna复合物溶液中，在25℃，200rpm振荡速率下振荡浸泡24小时。

（4）取出步骤（3）的微生物纤维素并加入到depc水中，在25℃，100rpm振荡速率下，振荡清洗10秒，取出得到的微生物纤维素为具有rna干扰功能、用于治疗糖尿病足溃疡的微生物纤维素复合敷料。

实施例5

1、具有rna干扰功能、用于治疗糖尿病足溃疡的微生物纤维素复合敷料的制备

（1）称取含有第四代聚酰胺-胺树枝状聚合物的阳离子超支化支链淀粉衍生物（命名为amyp-d4）0.1克溶解在100毫升depc水中，得到1mg/ml溶液，将10odmmp-9sirna溶解在0.12毫升dpec水中得到0.26mg/ml溶液，将amyp-d4和mmp-9sirna以溶质的质量比为10：1混合，漩涡振荡20秒，静置30分钟，得到amyp-d4/mmp-9sirna复合物纳米粒溶液。

（2）剪取厚度为3mm，面积为10×10厘米微生物纤维素浸泡到去离子水中纯化7天，直至纯化的去离子水ph为7，取出微生物纤维素在-40℃下进行冷冻，并冷冻干燥48小时，得到冻干的微生物纤维素。

（3）称取10毫克冻干的微生物纤维素浸泡到步骤（1）得到的amyp-d4/mmp-9sirna复合物溶液中，在25℃，100rpm振荡速率下振荡浸泡24小时。

（4）取出步骤（3）的微生物纤维素并加入到depc水中，在25℃，100rpm振荡速率下，振荡清洗20秒，取出得到的微生物纤维素为具有rna干扰功能、用于治疗糖尿病足溃疡的微生物纤维素复合敷料。

实施例6

1、具有rna干扰功能、用于治疗糖尿病足溃疡的微生物纤维素复合敷料的制备

（1）称取含有乙二胺基团的阳离子超支化糖原衍生物（命名为gly-eda）0.1克溶解在100毫升depc水中，得到1mg/ml溶液，将10odmmp-9sirna溶解在0.12毫升dpec水中得到0.26mg/ml溶液，将gly-eda和mmp-9sirna以溶质的质量比为10：1混合，漩涡振荡5秒，静置15分钟，得到gly-eda/mmp-9sirna复合物纳米粒溶液。

（2）剪取厚度为15mm，面积为10×10厘米微生物纤维素浸泡到去离子水中纯化6天，直至纯化的去离子水ph为7，取出微生物纤维素在-40℃下进行冷冻，并冷冻干燥36小时，得到冻干的微生物纤维素。

（3）称取10毫克冻干的微生物纤维素浸泡到步骤（1）得到的gly-eda/mmp-9sirna复合物溶液中，在25℃，50rpm振荡速率下振荡浸泡6小时。

（4）取出步骤（3）的微生物纤维素并加入到depc水中，在25℃，50rpm振荡速率下，振荡清洗5秒，取出得到的微生物纤维素为具有rna干扰功能、用于治疗糖尿病足溃疡的微生物纤维素复合敷料。