本发明涉及天然药物化学技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤作用的忍冬藤菇有效部位及其制备方法和应用。
背景技术：
乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。女性乳腺是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的，乳腺癌中99％发生在女性，男性仅占1％。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题。因此，进一步开发一种具有治疗乳腺癌作用的药物，具有重要的意义。
忍冬藤菇为多孔菌科褐孔菌属真菌，学名为环棱褐孔菌，其拉丁名为xanthochrousnilgheriensis(mont.)teng，主要寄生于忍冬根茎部和雪柳阔叶树的腐木上，覆瓦状叠生，主要分布于山东省沂蒙山区，辽宁省、广东省、海南省等地。现有技术并未有忍冬藤菇有效部位具有治疗乳腺癌的报道。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供种具有抗肿瘤作用的忍冬藤菇有效部位的制备方法。由该方法制备得到的忍冬藤菇有效部位具有非常优异的抗乳腺癌作用。
本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
一种具有抗肿瘤作用的忍冬藤菇有效部位的制备方法，其包含如下步骤：
(1)取忍冬藤菇，用醇提取，浓缩提取液得忍冬藤菇醇提取物；
(2)将忍冬藤菇醇提取物进行大孔树脂柱层析，得大孔树脂柱层析有效部位；
其中，步骤(2)中进行大孔树脂柱层析的具体方法为：
将忍冬藤菇醇提取物上大孔树脂柱，先用1～3倍柱体积的体积分数为40～60％的乙醇水溶液洗脱除杂；再用1～5倍柱体积的体积分数为70～80％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为70～80％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析有效部位。
优选地，步骤(1)中，所述的醇为体积分数为70～100％的乙醇，醇的用量与忍冬藤菇的用量比为8～15ml：1g。
最优选地，步骤(1)中，所述的醇为体积分数为95％的乙醇，醇的用量与忍冬藤菇的用量比为10ml：1g。
优选地，步骤(1)中所述的提取为加热回流提取；提取时间为1～3h。
优选地，步骤(2)中进行大孔树脂柱层析的具体方法为：
将忍冬藤菇醇提取物上大孔树脂柱，先用1～2倍柱体积的体积分数为40～50％的乙醇水溶液洗脱除杂；再用3～5倍柱体积的体积分数为75～80％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为75～80％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析有效部位。
最优选地，步骤(2)中进行大孔树脂柱层析的具体方法为：
将忍冬藤菇醇提取物上大孔树脂柱，先用2倍柱体积的体积分数为50％的乙醇水溶液洗脱除杂；再用4倍柱体积的体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析有效部位。
优选地，所述的大孔树脂柱中填充有非极性大孔吸附树脂。
优选地，将步骤(2)制备得到大孔树脂柱层析有效部位进一步进行硅胶柱层析，得所述的忍冬藤菇有效部位；
所述的硅胶柱层析的具体方法为：将步骤(2)制备得到大孔树脂柱层析有效部位上硅胶柱，先用2～5倍柱体积的氯仿洗脱除杂；然后再用3～6倍柱体积的体积比为95:5～90:10的氯仿和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱并收集该洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的忍冬藤菇有效部位。
进一步优选地，所述的硅胶柱层析的具体方法为：将步骤(2)制备得到大孔树脂柱层析有效部位上硅胶柱，先用4～5倍柱体积的氯仿洗脱除杂；然后再用5～6倍柱体积的体积比为97:3的氯仿和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱并收集该洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的忍冬藤菇有效部位。
最优选地，所述的硅胶柱层析的具体方法为：将步骤(2)制备得到大孔树脂柱层析有效部位上硅胶柱，先用4倍柱体积的氯仿洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积比为97:3的氯仿和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱并收集该洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的忍冬藤菇有效部位。
优选地，所述的忍冬藤菇为环棱褐孔菌，其拉丁名为xanthochrousnilgheriensis(mont.)teng。
优选地，所述的肿瘤为乳腺癌。
本发明还提供一种由上述方法制备得到的具有抗肿瘤作用的忍冬藤菇有效部位。
本发明还提供一种忍冬藤菇有效部位在制备治疗癌症的药物中的应用，所述的忍冬藤菇有效部位通过上述方法制备得到。
优选地，所述的癌症为乳腺癌。
有益效果：(1)本发明首次提供了一种具有抗肿瘤作用的忍冬藤菇有效部位的制备方法；(2)通过该方法大孔树脂柱层析条件富集得到的忍冬藤菇有效部位具有很好的抗肿瘤作用；(3)进一步地，再在本发明所述硅胶柱层析条件下精制得到的忍冬藤菇有效部位，其抗肿瘤作用得到了大幅的提升，尤其是抗乳腺癌的下过最为明显，经硅胶柱层析进一步富集有效成分后，其抗乳腺癌的效果强于顺铂，效果非常显著。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
实施例1具有抗肿瘤作用的忍冬藤菇有效部位的制备方法
(1)取忍冬藤菇(采自山东临沂)，用体积分数为95％的乙醇进行加热回流提取2h得提取液，浓缩提取液得忍冬藤菇醇提取物；所述乙醇与忍冬藤菇的用量比为12ml：1g；
(2)将忍冬藤菇醇提取物进上d101大孔树脂柱，先用2倍柱体积的体积分数为50％的乙醇水溶液洗脱除杂；再用4倍柱体积的体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析有效部位，即所述的忍冬藤菇有效部位。
实施例2具有抗肿瘤作用的忍冬藤菇有效部位的制备方法
(1)取忍冬藤菇(采自山东临沂)，用体积分数为80％的乙醇进行加热回流提取2h得提取液，浓缩提取液得忍冬藤菇醇提取物；所述乙醇与忍冬藤菇的用量比为15ml：1g；
(2)将忍冬藤菇醇提取物进上d101大孔树脂柱，先用3倍柱体积的体积分数为40％的乙醇水溶液洗脱除杂；再用3倍柱体积的体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析有效部位，即所述的忍冬藤菇有效部位。
实施例3具有抗肿瘤作用的忍冬藤菇有效部位的制备方法
(1)取忍冬藤菇(采自山东临沂)，用体积分数为70％的乙醇进行加热回流提取3h得提取液，浓缩提取液得忍冬藤菇醇提取物；所述乙醇与忍冬藤菇的用量比为15ml：1g；
(2)将忍冬藤菇醇提取物进上d101大孔树脂柱，先用1倍柱体积的体积分数为60％的乙醇水溶液洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为80％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为80％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析有效部位，即所述的忍冬藤菇有效部位。
实施例4具有抗肿瘤作用的忍冬藤菇有效部位的制备方法
(1)取忍冬藤菇(采自山东临沂)，用体积分数为95％的乙醇进行加热回流提取2h得提取液，浓缩提取液得忍冬藤菇醇提取物；所述乙醇与忍冬藤菇的用量比为12ml：1g；
(2)将忍冬藤菇醇提取物进上d101大孔树脂柱(硅胶柱中填充有300目硅胶)，先用2倍柱体积的体积分数为50％的乙醇水溶液洗脱除杂；再用4倍柱体积的体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析有效部位；
(3)将步骤(2)制备得到大孔树脂柱层析有效部位上硅胶柱，先用4倍柱体积的氯仿洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积比为97:3的氯仿和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱并收集该洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的忍冬藤菇有效部位。
实施例5具有抗肿瘤作用的忍冬藤菇有效部位的制备方法
(1)取忍冬藤菇(采自山东临沂)，用体积分数为80％的乙醇进行加热回流提取2h得提取液，浓缩提取液得忍冬藤菇醇提取物；所述乙醇与忍冬藤菇的用量比为15ml：1g；
(2)将忍冬藤菇醇提取物进上d101大孔树脂柱，先用3倍柱体积的体积分数为40％的乙醇水溶液洗脱除杂；再用3倍柱体积的体积分数为60％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为60％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析有效部位；
(3)将步骤(2)制备得到大孔树脂柱层析有效部位上硅胶柱(硅胶柱中填充有300目硅胶)，先用4倍柱体积的氯仿洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积比为97:3的氯仿和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱并收集该洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的忍冬藤菇有效部位。
实施例6具有抗肿瘤作用的忍冬藤菇有效部位的制备方法
(1)取忍冬藤菇(采自山东临沂)，用体积分数为70％的乙醇进行加热回流提取3h得提取液，浓缩提取液得忍冬藤菇醇提取物；所述乙醇与忍冬藤菇的用量比为15ml：1g；
(2)将忍冬藤菇醇提取物进上d101大孔树脂柱，先用1倍柱体积的体积分数为60％的乙醇水溶液洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为80％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为80％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析有效部位；
(3)将步骤(2)制备得到大孔树脂柱层析有效部位上硅胶柱(硅胶柱中填充有300目硅胶)，先用4倍柱体积的氯仿洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积比为97:3的氯仿和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱并收集该洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的忍冬藤菇有效部位。
实施例7忍冬藤菇有效部位抗肿瘤活性测试
取人乳腺癌细胞mda-mb231、人体宫颈癌细胞hela、人肝癌细胞bel-7404、置于培养基(rpmi1640培养基)中培养，癌细胞以10×103每孔加入96孔板中，在37℃含5％co2的培养箱中培养24小时后贴壁后吸去原来的培养基。然后空白组再加入含10％胎牛血清的rpmi1640培养基；实验组分别加入含有0.01～100μg/ml待测药物的rpmi1640培养基；继续培养48h后，再加入浓度5mg/ml的mtt，继续培养4h，吸去上清液，加入100μldmso，暗处放置10min，利用酶标仪(sunrise公司)在570nm下测定吸光值，并根据吸光值计算细胞存活情况，每个处理设6个重复孔。细胞存活率(％)＝δod药物处理组/δod空白组×100。再根据剂量效应曲线计算细胞半抑制浓度(ic50)，结果见表1，其中ic50值越小说明其抗肿瘤效果越好。
实验组的药物分别为实施例1～6制备得到的忍冬藤菇有效部位以及阳性对照药顺铂。
表1.忍冬藤菇提取物抗肿瘤活性测试结果表
从表1数据中可以看出，权利要求1～6制备得到的忍冬藤菇有效部位具有一定的抗乳腺癌、宫颈癌细胞以及肝癌作用，但其对抗宫颈癌细胞以及肝癌作用不明显，而抗乳腺癌作用十分显著。这说明，本发明所述方法制备得到的忍冬藤菇有效部位富集了大量的治疗乳腺癌的有效成分；对其他癌症虽然显示一定的效果，但效果不明显，该方法制备得到的忍冬藤菇有效部位治疗特异性强。
从表1数据中还可以看出，经大孔树脂柱层析，再经硅胶柱层析精制后得到的忍冬藤菇有效部位，其抗乳腺癌作用进一步增强，从ic50值可以看出，其ic50值要小于顺铂的ic50值，这说明经硅胶柱层析精制后得到的忍冬藤菇有效部位富集了大量的抗乳腺癌的成分，且抗乳腺癌的效果要优于顺铂。