本发明涉及一种过表达脑源性神经营养因子(bdnf)的重组病毒的医药用途，主要涉及在制备增加血浆bdnf水平的基因药物中的应用或在制备减缓动脉粥样硬化的基因药物中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
心血管疾病是目前严重影响人类健康，引起死亡的主要原因之一。根据《2016年中国卫生和计划生育统计年鉴》，我国心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段。推算心血管病现患人数2.9亿，其中脑卒中1300万，冠心病1100万，心力衰竭450万，肺原性心脏病500万，风湿性心脏病250万，先天性心脏病200万，高血压2.7亿。心血管病死亡率居首位，高于肿瘤和其他疾病，占居民疾病死亡构成的40％以上。心脑血管病住院总费用也在快速增加，2004年至今，其年均增速远高于gdp增速。因此，开发新的更加有效的心血管疾病防治策略迫在眉睫。
脑源性神经营养因子(bdnf)在中枢和外周神经元的生存、生长和维持中发挥重要作用，但近年来的研究发现其也在血管内皮中表达和发挥作用。首先，bdnf在心血管发育中发挥重要作用，bdnf敲除导致血管内皮细胞缺陷，心肌内血管减少，心肌内出血及早期出生后死亡。而且bdnf还能通过富集内皮细胞促进缺血组织内的血管新生。另外，我们以前的研究还发现不稳定心绞痛病人的血浆bdnf浓度显著低于对照组，血浆bdnf水平与血浆甘油三酯/低密度脂蛋白/血糖/年龄等心血管高危因素呈负相关，与高密度脂蛋白等成正相关，低的血浆bdnf浓度与心绞痛病人的远期不良预后相关。我们的这一结果引起美国心肺血研究所framingham心脏研究中心主任vasans.ramachandran的兴趣，于是他领导了大样本的孟德尔随机临床研究(kaessbm，etal.jamheartassoc.2015；4:e001544)，进一步证实了我们的结论，即血液bdnf水平与冠心病存在因果关系。之后其他研究者的大量研究也进一步证实血bdnf浓度与冠心病及其危险因素相关，并在冠心病的发生发展中起保护作用。因此持续稳定增加冠心病人血浆bdnf浓度为冠心病的预防和改善提供了新思路。
目前能够持续稳定增加血浆bdnf浓度的的方法尚未见报道。已有专利报道涉及编码bdnf的核酸序列以及用这些核酸顺序大量制得的bdnf蛋白及其片段和衍生物，还涉及bdnf蛋白质在制造治疗神经系统疾病或失调的药物中的用途，但存在着bdnf在血液循环过程中逐渐降解的问题，需要多次给药，花费较大。还有关于构建含有tat-bdnf的重组表达载体，为进一步表达融合蛋白及探讨tat携带bdnf穿透血脑屏障治疗中枢神经系统疾病奠定了基础，但该方法主要增加神经系统bdnf水平。目前尚没有涉及增加血浆bdnf浓度治疗心血管疾病的报道。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种过表达脑源性神经营养因子的重组病毒的医药新用途。
本发明提供了一种过表达脑源性神经营养因子的重组病毒在制备增加血浆bdnf水平的基因药物中的应用，通过增加血浆中bdnf的浓度，预防和治疗心血管疾病。
本发明还提供了一种过表达脑源性神经营养因子的重组病毒在制备减缓动脉粥样硬化的基因药物中的应用。
本发明还提供了包括过表达脑源性神经营养因子的重组病毒的基因药物组合物。
发明概述：
本发明利用9型腺相关病毒能够在体内高效感染主动脉内皮和能整合到基因组持续表达的特点，通过让血管内皮细胞持续表达分泌bdnf，增加血浆bdnf水平，减缓动脉粥样硬化的发展。
发明详述：
本发明的技术方案如下：
一种过表达脑源性神经营养因子的重组病毒的医药用途，包括在制备增加血浆bdnf水平的基因药物中的应用或在制备减缓动脉粥样硬化的基因药物中的应用。
所述的过表达脑源性神经营养因子的重组病毒可按照现有技术构建，包括含有目的基因的质粒载体的构建以及病毒的包装。
根据本发明优选的，所述过表达脑源性神经营养因子的重组病毒的构建方法如下：
(1)限制性内切酶ecori和kpni酶切含bdnfcdna的t载体和腺相关病毒质粒载体paav，分别纯化回收bdnfcdna酶切产物和paav酶切产物；
(2)将步骤(1)的bdnfcdna酶切产物和paav酶切产物连接，连接产物转化感受态细胞，筛选鉴定阳性克隆，抽提阳性质粒paav-bdnf；
(3)复苏hek293细胞，将步骤(2)的阳性质粒paav-bdnf和辅助质粒paav9、phelper共同转染复苏的hek293细胞，转染后收集上清，浓缩纯化，获得过表达脑源性神经营养因子的重组病毒。
根据本发明优选的，上述步骤(1)中的酶切体系为：质粒载体paav或含bdnfcdna的t载体2.5μg，10×buffer5μl，10×bsa5μl，ecori2.5μl，kpni2.5μl，ddh2o补足至50μl，酶切反应条件：37℃水浴反应4h。
根据本发明优选的，上述步骤(2)中连接时bdnfcdna酶切产物与paav酶切产物的质量比为1:2。
根据本发明优选的，上述步骤(2)中的连接体系为：paav酶切产物2μl，bdnfcdna酶切产物2μl，10×dnaligasebuffer2μl，t4dnaligase2μl，ddh2o补足至20μl，连接反应条件：37℃水浴反应过夜。
根据本发明优选的，上述步骤(3)中阳性质粒paav-bdnf、辅助质粒paav9、辅助质粒phelper的质量比为1:1:1。
根据本发明优选的，上述步骤(3)中hek293细胞的转染包括以下步骤：应用hetkit转染hek293细胞，转染7～9h后换液，换液48～50h后，用吸管将细胞从培养皿中吹下来收集到离心管中，置于-80℃和37℃水浴锅中反复冻融三次，3000～4000rpm离心10～15min，收集上清。
根据本发明，一种增加血浆bdnf水平的基因药物，包括本发明所述的过表达脑源性神经营养因子的重组病毒，和医学上可接受的辅剂和/或载体。进一步优选的，增加血浆bdnf水平的基因药物为注射剂。
根据本发明，一种减缓动脉粥样硬化的基因药物，包括本发明所述的过表达脑源性神经营养因子的重组病毒，和医学上可接受的辅剂和/或载体。进一步优选的，减缓动脉粥样硬化的基因药物为注射剂。
有益效果：
1、本发明利用9型腺相关病毒能够在体内高效感染主动脉内皮的特点，通过让血管内皮细胞持续表达分泌bdnf，增加血浆bdnf水平。
2、本发明所述重组病毒能减缓动脉粥样硬化的发展，可用于制备治疗动脉粥样硬化相关疾病的基因药物。
附图说明
图1为病毒载体携带的报告基因在主动脉内皮的表达；
图2为不同重组病毒感染后血浆bdnf浓度；
图3为不同重组病毒感染后主动脉的斑块面积。
具体实施方式
下面结合实施例和说明书附图对本发明的技术方案进行进一步说明，其中采用的实验方法若无特殊说明均为常规方法。
实施例中使用的试剂均为普通市售产品。其中，琼脂糖凝胶回收试剂盒，货号：d2500(omega)；cyclepure回收试剂盒，货号：d6492(omega)；限制性内切酶ecori和kpni(美国neb公司)；t4dnaligase，货号：m0202l(美国neb公司)；qiagen质粒抽提试剂盒(德国qiagen公司)；hetkit，货号：bw11002(深圳百恩维公司)；apo-/-e，c57小鼠及饲料(北京联通利华公司)；血浆bdnf检测试剂盒(美国promega公司)；zsgreen抗体(美国bd公司)。
实施例1：构建一种过表达脑源性神经营养因子的重组病毒
1、限制性内切酶ecori和kpni酶切含bdnfcdna的t载体质粒和腺相关病毒质粒载体paav，酶切反应在37℃水浴反应4h，酶切体系如下：
将上述反应后产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒，切胶回收bdnf酶切片段和paav酶切片段；
2、将步骤1的bdnfcdna酶切片段和paav酶切产物连接，bdnfcdna酶切片段和paav酶切产物的质量比为1：2，37℃水浴反应过夜，连接反应体系如下：
取10μl上述过夜连接产物转化100μljm109感受态细胞，ampicillin抗性培养后，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒paav-bdnf。
3、复苏hek293细胞，加入dmem培养基(含10％胎牛血清)培养，待细胞生长成均匀单层细胞并达95％以上聚集度时传代，传代2次后再行转染；用胰酶消化收集细胞，以完全培养基稀释细胞至2×106个/ml，接种10ml细胞稀释液至10cm培养皿，培养箱中孵育12h，转染前1h换液；
将步骤2中提取的阳性质粒paav-bdnf和辅助质粒paav9、辅助质粒phelper，三者的质量比为1:1:1,应用hetkit，共同转染hek293细胞；
转染6h后换液，换液48小时后，用吸管将细胞从培养皿中吹下来收集到离心管中，置于-80℃和37℃水浴锅中反复冻融三次，3000rpm离心10min，收集上清，浓缩，测定重组病毒的滴度，获得过表达脑源性神经营养因子的重组病毒，即raav9-bdnf重组病毒。
实施例2：验证重组病毒的体内感染效率及增加血浆bdnf水平的效果
选用8周龄的c57bl/6小鼠60只，分为2组，对照组用一次性注射器经小鼠尾静脉注射含有zsgreen报告基因(raav9-zsgreen)的重组病毒，实验组用一次性注射器经小鼠尾静脉注射实施例1构建的raav9-bdnf重组病毒，注射剂量为7×1010vg/g体重和20μl/g体重，普通饮食喂养16周；
小鼠腹主动脉取血：小鼠麻醉后，暴露腹腔，用抗凝剂湿润一次性注射器内壁，然后从腹主动脉慢慢抽取血液约1毫升。室温3000rpm水平离心10分钟，吸取上层血浆-80℃保存备用；
检测血浆bdnf水平：采用美国promega公司的elisa检测试剂盒，按照试剂盒说明书操作检测血浆bdnf水平；
取材小鼠主动脉制备冷冻切片，检测免疫荧光染色报告基因zsgreen的表达，验证感染效率：主动脉根的冷冻切片用4％多聚甲醛固定，pbs浸洗后，血清封闭，然后用zsgreen抗体孵育4℃过夜，浸洗后用fitc标记的荧光二抗孵育，浸洗，再用dapi染色5分钟，浸洗后封片，荧光显微镜下观察。
结果显示，对照组重组病毒携带的报告基因zsgreen在主动脉内皮高效表达(图1)；与对照组相比，在注射16周后，本发明所述重组病毒显著增加血浆bdnf水平(图2)。
实施例3：重组病毒在减缓动脉粥样硬化中的应用
建立动脉粥样硬化动物模型：选取8周龄apoe敲除小鼠60只，分为2组，高脂喂养16周；
小鼠在开始造模时，同时用一次性注射器经小鼠尾静脉注射重组病毒，对照组注射raav9-zsgreen病毒，实验组注射实施例1构建的raav9-bdnf病毒，注射剂量均为7×1010vg/g体重和20μl/g体重；
高脂喂养16周后，取材主动脉，大体油红o染色检测动脉粥样硬化斑块面积：先用4％多聚甲醛固定，pbs浸洗后，将主动脉纵向剪开固定于黑色表面，然后主动脉用油红o染色，pbs浸洗，显微镜下观察及拍照，斑块面积的定量计算应用imagepro-plus软件。
大体油红o染色显示，与对照组相比本发明所述重组病毒组斑块面积明显降低达50％(图3)。
本发明的应用结果表明所述重组病毒能增加血浆bdnf水平，减缓动脉粥样硬化的发展。本发明的raav9-bdnf病毒可成为治疗动脉粥样硬化相关疾病的基因药物。