组合物及其在保护被一水草酸钙损伤的HK-2细胞中的应用的制作方法

本发明涉及药物领域，具体而言，涉及一种组合物及其在保护被一水草酸钙损伤的hk-2细胞中的应用。

背景技术

广金钱草为豆科山蚂蝗属植物广金钱草desmodiumstyracifolium(osb.)merr.的干燥地上部分，药用名称源于《岭南草药志》。性微寒，味甘、淡，归膀胱、肝、胆、肾经，具有利尿通淋，清热除湿，排石的功效。临床主要用于泌尿系感染、泌尿系结石、胆石症、急性黄疸型肝炎等，具有很好的疗效。目前，对广金钱草的研究仅限于总黄酮基础的药效作用研究，对药效成分的研究目前尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种组合物以及其在保护hk-2细胞中的应用，其旨在提供一种组合物，保护hk-2细胞的活性成分的。

本发明提供一种技术方案：

一种组合物，组合物主要包括按质量百分数计的以下组分：

5-11％维采宁-1、8-15％维采宁-2、8-15％维采宁-3、15-60％夏佛塔苷、23-45％异夏佛塔苷。

在本发明的其他实施例中，上述组合物选自于广金钱草总黄酮经ods柱层析洗脱得到的25％洗脱部位或/和85％洗脱部位。

在本发明的其他实施例中，上述组合物主要通过以下步骤制得：广金钱草醇提物经大孔树脂联合聚酰胺分离纯化得到所述广金钱草总黄酮；将所述广金钱草总黄酮与ods混合，采用甲醇-水溶剂梯度洗脱，分离出25％洗脱部位、85％洗脱部位。

在本发明的其他实施例中，上述广金钱草醇提物主要通过以下方法制得：

采用45-55vol％的乙醇浸泡广金钱草30-40min后，回流提取2-3次，将提取液减压浓缩至无醇味。

本发明还提供一种技术方案：

上述的组合物在保护被一水草酸钙损伤的hk-2细胞中的应用。

在本发明的其他实施例中，上述组合物应用于减少所述hk-2细胞氧化代谢产物的积累、促进抗氧化产生，减少所述hk-2细胞的脂质过氧化损伤。

在本发明的其他实施例中，上述组合物应用于促进所述hk-2细胞膜上的occludin蛋白、zo-1蛋白的表达。

在本发明的其他实施例中，上述组合物应用于上调所述hk-2细胞的线粒体膜电位，减少所述hk-2细胞活性氧含量。

在本发明的其他实施例中，上述组合物加入细胞培养液，对被一水草酸钙损伤的hk-2细胞进行培养。

上述的组合物于制备治疗或/和预防肾结石药物中的应用。

本发明实施例提供的组合物以及其在保护hk-2细胞中的应用的有益效果是：

本发明实施例提供的组合物经过五个化合物的协同协作，保护被一水草酸钙损伤的hk-2细胞，进一步能够用于制备治疗肾结石的药物。组合物可与hk-2细胞上的特异位点结合，是发挥药效的有效成分。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1示出了mtt法评价tfds及不同部位对hk-2的毒性作用；

图2示出了mtt法评价tfds及不同部位对com损伤hk-2的保护作用；

图3示出了tfds及不同部位对com损伤hk-2细胞的影响；

图4示出了tfds及不同部位对com损伤的hk-2细胞ros影响；

图5示出了tfds及不同部位对com导致hk-2细胞线粒体膜电位影响；

图6示出了tfds及不同部位对com导致hk-2细胞凋亡影响；

图7示出了tfds及不同部位对com黏附的hk-2细胞膜上occludin与zo-1蛋白表达影响。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的组合物在保护hk-2细胞中的应用进行具体说明。

一种组合物，组合物主要包括按质量百分数计的一下组分：

5-11％维采宁-1、8-15％维采宁-2、8-15％维采宁-3、15-60％夏佛塔苷、23-45％异夏佛塔苷。

在本实施例中，上述组合物选自于广金钱草总黄酮经ods柱层析洗脱得到的25％洗脱部位或/和85％洗脱部位。

详细地，上述的洗脱部位通过以下步骤制得：广金钱草醇提物经大孔树脂联合聚酰胺分离纯化得到所述广金钱草总黄酮；将所述广金钱草总黄酮与ods混合，采用甲醇-水溶剂梯度洗脱，分离出25％洗脱部位、85％洗脱部位，再次分离得到组合物。

进一步地，上述广金钱草醇提物主要通过以下方法制得：

采用45-55vol％的乙醇浸泡广金钱草30-40min后，回流提取2-3次，将提取液减压浓缩至无醇味。

本发明实施例提供的组合物经过五个化合物的协同能够保护被一水草酸钙损伤的hk-2细胞，进一步能够用于制备治疗肾结石的药物。组合物可与hk-2细胞上的特异位点结合，是发挥药效的有效成分。

本发明还提供一种技术方案：

上述的组合物在保护被一水草酸钙损伤的hk-2细胞中的应用。

在本发明的其他实施例中，上述组合物应用于减少所述hk-2细胞氧化代谢产物的积累、促进抗氧化产生，减少所述hk-2细胞的脂质过氧化损伤。

在本发明的其他实施例中，上述组合物应用于促进所述hk-2细胞膜上的occludin蛋白、zo-1蛋白的表达。

组合物应用于保护被一水草酸钙损伤的hk-2细胞。该组合物对一水草酸钙(calciumoxalate.简称com)黏附的hk-2细胞膜具有保护作用。

紧密连接(tj)是指上皮细胞顶端侧面质膜中的封闭蛋白和密封蛋白在细胞间构成的密封连接，由跨膜蛋白和膜周蛋白组成，跨膜蛋白包括occludin、claudins、连接粘附分子(junctionaladhesionmolecules，jam)；膜周蛋白包括zonulaoccludens(zo-1，zo-2，zo-3)。

在本发明的其他实施例中，上述组合物应用于上调所述hk-2细胞的线粒体膜电位，减少所述hk-2细胞活性氧含量。有效降低com刺激hk-2细胞产生的线粒体膜电位损伤，具有保护线粒体的功能，减少细胞的损伤及凋亡。

在本发明的其他实施例中，上述组合物加入细胞培养液，对被一水草酸钙损伤的hk-2细胞进行培养。

上述的组合物于制备治疗或/和预防肾结石药物中的应用。

组合物对被一水草酸钙损伤的hk-2细胞具有保护作用，因此对肾结石的治疗具有积极作用，可以用于制备治疗或/和预防肾结石药物。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

试验例

广金钱草总黄酮各洗脱部位的制备：

称取广金钱草药材适量，用50％的乙醇按液料比(30:1)浸泡30min后，回流提取2次，每次1.5h，提取液减压浓缩至无醇味制得广金钱草总黄酮(tfds)。

采用大孔树脂联合聚酰胺的方法纯化tfds。将提取的广金钱草浓缩液调节至适量浓度，利用dm-130大孔树脂进行纯化，再利用60-100目的聚酰胺进一步纯化,得到tfds。紫外可见分光光度法进行含量检测，得到tfds含量达75％。

将制备得到的tfds用ods进行洗脱。取30gods粉末，用纯甲醇浸泡过夜后，湿法装柱，用洗脱的起始浓度5％甲醇水平衡ods柱20min。将称量好的样品用洗脱的起始溶剂溶解后，加入ods粉末进行拌样，当药粉和ods混合至流沙样时，干法上样。用不同梯度的甲醇-水溶剂系统进行洗脱，摸索其洗脱条件，注入高效液相色谱仪进行分析，分离出5％洗脱部位、25％洗脱部位、85％洗脱部位、100％洗脱部位，低温烘干成粉末。

tfds25％、85％不同洗脱部位对com损伤细胞的保护作用的验证

建立com损伤hk-2细胞模型

配制10mm氯化钙和10mm草酸钠，混合均匀，放在4℃冰箱静置三天后，3000转离心10min，无菌水洗涤三次，在真空干燥器中60℃干燥，放于紫外灯下过夜，即获得com晶体粉末。精密称取已制备好的com粉末3mg，放置紫外灯下灭菌30min后，用空白培养基配制100μg/ml浓度的com混悬液，加入细胞已贴壁24小时的6孔板中，孵育24h，com对细胞有明显的黏附作用，损伤细胞膜结构，并影响了细胞的活性和形态，细胞由铺路形变为长梭形。

mtt法测定tfds及不同部位对com损伤细胞的保护作用

将细胞消化收集、离心后重悬，以8×10³个/孔的密度接种于96孔板中，培养至细胞融合达80％。小心吸去完全培养基，正常组加入空白培养基，模型组加入com混悬液100μg/ml,给药组除加入com混悬液100μg/ml外，分别加入不同浓度梯度的tfds及不同部位药物。孵育24h后进行mtt活力检测。

mda、gsh、sod的测定

设置空白组(c)，模型组(m)100μg/ml，tfds治疗组：50μg/ml(tfds-l)、100μg/ml(tfds-m)、200μg/ml(tfds-h)，25％洗脱部位治疗组：50μg/ml(p1-l)、100μg/ml(p1-m)、200μg/ml(p1-h)，85％洗脱部位治疗组：50μg/ml(p2-l)、100μg/ml(p2-m)、200μg/ml(p2-h))和溶剂对照组。取对数生长期的hk-2细胞，以细胞数3×10⁶个/孔的数目接种于6孔板中，培养24h，按分组给药后置培养箱中培养24h后，弃去细胞上清液，用胰酶收集细胞，预冷pbs清洗2次，1000r/min离心收集各组细胞后，用等体积的pbs重悬细胞，超声破碎裂解细胞。按照mda(丙二醛)、gsh(谷胱甘肽)、sod(超氧化物歧化酶)说明书要求测定并计算细胞中的gsh、sod、mda含量。

ldh(乳酸脱氢酶)的测定

将hk-2细胞接种于24孔板中，密度为4×10⁴个/孔，体积为500μl，于37℃、5％co2培养箱条件下培养24h，按2.5.2分组给药后，培养箱中培养24h后，收集各组细胞上清液，加入0.1％tritionx-100裂解液裂解贴壁细胞，收集细胞裂解液，测定ldh泄漏率。

细胞内ros(活性氧)的含量测定

细胞以3×10⁶个/孔的数目接种于6孔板中，培养24h，按2.5.2分组给药，置培养箱中24h后，用pbs清洗未黏附细胞的游离com，清洗2-3次。将用空白培养基配制的终浓度为10μm的分子探针2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐(h2dcfda)溶液加入细胞中，37℃、5％co2培养箱中孵育20min，小心吸去探针溶液，用空白培养基润洗细胞，除去未与细胞结合的探针，减少背景干扰。然后每孔加入500μl空白培养基，incucytezoom长时间细胞成像仪观察及功能分析系统(channelgreen)实时拍摄，并计算细胞ros荧光值。

细胞内mmp的检测

细胞培养至对数期后，收集细胞，将细胞以6×10³个/孔接种于96孔板中，贴壁24h后，按2.5.2分组给药；弃去培养基后，用pbs洗涤细胞，除去未与细胞结合的com,加入100μl细胞培养液，再加入100μljc-1染色工作液，充分混匀后置于细胞培养箱中孵育20min；弃去工作液，用预冷的jc-1染色缓冲液洗涤两次，弃去染色缓冲液，加入100μl细胞培养液后，incucytezoom长时间细胞成像仪观察及功能分析系统(channelgreen/red)实时拍摄荧光，检测jc-1聚合物，并计算细胞荧光密度。

annexinv-fitc/pi双染流式细胞术检测细胞凋亡

取对数生长期hk-2,以细胞数目3×10⁵个/孔接种于6孔板中，培养24h后，分别加入相同浓度的com(100μg/ml)混悬液造模，再加入不同浓度的给药作为治疗组，同时设置空白组和模型组；37℃、5％co2相对湿度95％条件下培养孵育24h后，收集细胞上清液，胰酶消化，800rpm离心5min收集细胞，过300目尼龙网除去消化后游离的com，离心，预冷pbs清洗3次后，用1×bindingbuffer缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml,吸取400μl细胞混悬液于流式管中，加入5μlannexinv。室温孵育10-15min后，用缓冲液洗涤细胞，并重悬细胞；往细胞重悬液中加入5μlpi，轻轻吹打均匀后置2-8℃环境中避光孵育15min,再加入10μlpi染色液后轻轻混匀2-8℃避光条件下孵育5min,立即经流式细胞仪在激发波长488nm,发射波长530nm处检测细胞的凋亡。

westernblot法检测tfds及不同部位对com黏附的hk-2细胞膜上zo-1与occludin蛋白表达

细胞总蛋白的制备

取对数生长期hk-2,以细胞数目3×10⁵个/孔接种于6孔板中，培养24h后，别加入相同浓度的com(100μg/ml)混悬液造模，再加入不同浓度的给药作为治疗组，同时设置空白组和模型组；培养24h后，弃去上清液，用pbs润洗细胞1-2遍后，加入100μl蛋白裂解液(含pmsf),冰上裂解30min后，收集细胞裂解液，4℃，12000r/min离心5min，吸取上清液测其蛋白浓度，分装后放于超低温冰箱内保存。

蛋白浓度的测定

采用bca试剂盒测定蛋白浓度测定，按试剂盒说明书要求采用pbs稀释bsa标准品，将蛋白标准液配置成0、0.0626、0.125、0.25、0.5、1、2μg/μl浓度梯度建立bsa蛋白标准曲线，将提取所得的各组总蛋白稀释10倍后检测，利用标准曲线计算出各组样品的蛋白浓度。

sds-page电泳

利用pbs将蛋白样品稀释至相同浓度，以保证蛋白上样量一致。取稀释后的蛋白样品100μl，与4倍体积的5×loadingbuffer缓冲液100μl混匀后，100℃煮沸10min，冷水预冷，10000r离心5min，取上清液，分装即得蛋白上样样品。制备10％分离胶和5％浓缩胶，制胶完毕后，放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，加样，每个样本蛋白上样量为20μg，加样体积一致。加样完毕后进行sds-page电泳，浓缩胶电压为60v，当溴酚蓝电泳至分离胶与浓缩胶交界处时，更换恒压110v电泳，当染料到达凝胶底部边缘时即停止电泳。

转膜

将滤纸、海绵垫放置转膜液中预先浸泡30min，同时剪取与分离胶大小相同的pvdf膜。将pvdf膜用甲醇浸泡30s，然后放置于转移液中浸泡。将电泳完成的胶取下，切去浓缩胶部分，转移至已铺有海绵垫和滤纸上，再放置pvdf膜，同时排尽空气，顺序依次为海绵垫-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵垫，并将黑白板夹紧放于垂直转印槽，注意正负极对准。使用bio-rad湿式转膜装置转膜90min，转膜电流为150ma。转膜完毕后，用tbst洗印迹膜3次，每次5min。

封闭

用tbst配制5％脱脂牛奶作为封闭液，将膜放入封闭液中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭120min。封闭后用tbst润洗3次，每次5min。根据预染蛋白的位置剪取目标蛋白和内参蛋白相应的pvdf膜，分别进行相应抗体的孵育。

抗体封闭

tbst洗涤条带3次，每次5min后，用牛奶封闭液配制抗体。抗体的稀释比例：zo-1一抗的稀释比例：1/3000，分子量：182kda；occludin一抗的稀释比例：1/5000，分子量：80kda；β-actin一抗稀释比例：1/1000，分子量：42kda；二抗的稀释比例：1/3000。4℃孵育过夜，回收一抗体后用tbst洗涤，在摇床上缓慢摇动5min，共洗涤3次。洗涤完毕后加入已用牛奶配置好的二抗，摇床缓慢摇动孵育2h。回收二抗，0.1％tbst洗涤10min，共洗涤3次。

显色

配制显影液a液与b液等体积混合。将洗涤好的条带用镊子取出，用吸水纸吸去过多的液体后，放入暗盒中，加入已配置好的显影液，使显影液覆盖在条带上，放置1-2min后，取膜，将膜放置到化学成像仪内，拍照。

灰度测定

image-proplus6.0对蛋白条带进行灰度分析。将zo-1与occludin条带与β-actin条带的灰度比值作为目的蛋白的相对表达水平，计算并比较模型组和给药组的灰度值。

数据处理

细胞实验均重复2-3次，各组数据以均数±标准差表示，应用graphpadprism5.0软件制图，spss20.0统计软件进行统计分析，组间差异比较采用单因素方差分析(annova)；当p＜0.05时认为差异具有统计学意义.

mtt法测定tfds及不同洗脱部位对细胞活性影响

实验利用mtt法测定tfds、p1、p2对细胞的作用。图1示出了mtt法评价tfds及不同部位对hk-2的毒性作用(n＝6)，其中，a图代表tfds；b图代表p1；图c代表p2。

如图1-a可知，当tfds浓度在0-500μg/ml时，细胞的活力为107.30％，与正常细胞相比无显著性差异。故tfds浓度选择应该在0-500μg/ml内；从图1-b中可知，p1在0-500μg/ml时，细胞的活力为99.78％，说明在此浓度范围下，药物对正常细胞无明显抑制作用；而p2在0-250μg/ml时，细胞的活力为97.98％，说明在低浓度范围下，药物对正常细胞无抑制作用。

因此，当tfds、p1在0-500μg/ml浓度范围，p2在0-250μg/ml浓度范围，对细胞没有影响。但随着浓度的增加，逐渐对细胞呈现抑制作用。tfds、p1、p2的半数抑制浓度分别为：18.90±0.63mg/ml、22.67±0.58mg/ml、6.059±0.29mg/ml。为不影响后期评价tfds、p1、p2对com损伤细胞的作用，应采用低浓度给药。

tfds及不同部位对com损伤hk-2细胞的保护作用

com黏附hk-2细胞，导致细胞活力降低，为研究tfds及不同部位对com黏附hk-2细胞的保护作用，实验利用mtt法检测tfds及不同部位对细胞活力影响。

图2示出了mtt法评价tfds及不同部位对com损伤hk-2的保护作用(n＝6)，其中a图代表tfds；b图代表p1；图c代表p2。图中，p^###表示正常组与模型组相比较p<0.001；p^*表示给药组与模型组相比较，p^*<0.05，p^**<0.01，p^***<0.001。

从图2可知，在com损伤hk-2细胞模型中，细胞的活力均降低，达到70％左右，当tfds、p1、p2给药浓度在25μg/ml时，与模型细胞相比无明显的差异；当给药浓度从50μg/ml时，细胞的活力开始增强，具有显著性差异，当给药浓度达到200μg/ml时，细胞的活力趋于正常。因此确定药物的起效浓度为50μg/ml，给药范围50～200μg/ml。

tfds及不同部位对com损伤hk-2细胞mda、gsh、sod影响

为进一步研究tfds及不同部位对com损伤的影响，实验利用mda、gsh、sod三个脂质过氧化指标评价药物对损伤的细胞的作用。

图3示出了tfds及不同部位对com损伤hk-2细胞的影响，图中，a图代表mda；b图代表gsh；c图代表sod；d图代表ldh。表1示出了tfds及不同部位对com损伤hk-2细胞的影响。

由图3-a可知，tfds及不同部位中所显示的效果不同。丙二醛(mda)作为测量细胞脂质过氧化物指标，可通过测定细胞内的脂质过氧化程度，间接的反映出细胞的损伤程度。在mda指标当中，tfds低中高剂量所表现的效果较好，与模型组相比较，具极其显著性差异(p<0.001)；从表1中可发现，低剂量下的tfds已经能够明显减少mda的产生。而p1与模型组相比较，在中高剂量具有明显差异性(p<0.01)。p2三个剂量中，均能减少细胞内mda的产生，尤其在高的剂量效果，与模型组组比较，极具显著性差异(p<0.001)。

在由图3-b及表1中观察gsh指标，发现高剂量的tfds对com损伤细胞的保护作用强(p<0.001)，说明tfds中的某些成分对gsh的产生具有促进作用，增强了机体的抗脂质化能力。而p1、p2两个部位也均能够促进gsh的产生。从产生gsh的含量看，p2的效果强于p1。

sod活力的高低间接的反映了机体清除氧自由基的能力，也反映了细胞的生理状态。图3-c及表1中的细胞sod指标测定结果得到：p2部位给药后，sod的活力显著升高，尤其在中高剂量(p<0.001)，效果最佳。

tfds及不同部位对com损伤hk-2细胞中ldh泄露率影响

如图3及表1所示，模型组与空白组相比较，模型组的细胞ldh泄漏率明显上升(p<0.001)，泄露率达到40％以上。与模型组相比较，三个给药组的ldh泄漏率明显降低，具有显著性差异(p<0.001)，其中在低剂量下p2对ldh泄漏率的降低作用强于相同浓度的tfds、p1组。

表1tfds及不同部位对com损伤hk-2细胞的影响

注：#表示m组与c组相比较，^##p<0.01，^###p<0.001；*表示给药组与m组相比较，^*p<0.05,^**p<0.01，^***p<0.001

tfds及不同部位对com损伤hk-2细胞内ros影响

为进一步探讨tfds及不同部位成分对com损伤hk-2细胞的作用，实验采用活性氧的测定进一步探究活性氧在给药后的com损伤hk-2细胞模型中的变化。实验采用荧光探针dcfh-da对细胞内的ros活性氧含量进行测定。图4示出了tfds及不同部位对com损伤的hk-2细胞ros影响。

图4结果显示：与正常细胞相比较，模型细胞中的活性氧含量远高于空白组，达到3.40倍左右，具有显著的统计学意义(p<0.001)，说明com造模后，导致细胞氧化损伤，引起了细胞内活性氧的大量产生和积累。当给予三组药物进行干预时，tfds及不同部位成分能有效下调细胞ros水平。其中，p2-l(50μg/ml)组与模型组比较，无差异性，但p1-m(100μg/ml)、p1-h(200μg/ml)的活性氧含量达到：2.6倍、1.9倍，与模型组相比较，分别下调了：0.8倍、1.5倍；p2-l(50μg/ml)、p2-m(100μg/ml)、p2-h(200μg/ml)的活性氧含量达到：3.3倍、2.5倍、1.6倍，分别与模型组相比较，下调了细胞内的ros水平:0.1倍、0.9倍、1.8倍；tfds-l(50μg/ml)、tfds-m(100μg/ml)、tfds-h(200μg/ml)的活性氧含量为：2.7倍、1.6倍、1.1倍；分别与模型组相比较，分别下调了细胞内的ros水平：0.7倍、1.8倍、2.3倍。

结果说明tfds能够明显减少活性氧产生，保护com黏附hk-2引起的细胞损伤所引起的氧化损伤。与模型组相比较，tfds从低浓度开始就具有显著性差异(p<0.05)，中高剂量下，极具显著性差异(p<0.001)；部位p1、p2在低浓度(50μg/ml)下对活性氧的作用，与模型组比较无明显差异，当达到高剂量时，具有显著性差异(p<0.001)，极具显著性差异。因此，在tfds及不同部位对com黏附的hk-2细胞内活性氧的降低作用中，tfds的效果最佳。而p1与p2相比较，在中高剂量下，p2对活性氧的调节作用强于p1。

tfds及不同部位对com黏附hk-2细胞mmp影响

实验采用细胞膜内线粒体膜电位(mmp)，通过jc-1荧光探针检测细胞膜电位的变化，作为检测指标检测tfds及不同部位对com损伤hk-2细胞线粒体膜电位影响。

实验结果如图5所示，与正常细胞组相比较，当给予com药物干预后，模型组细胞中的红绿荧光比值显著降低至0.68(p<0.001)，说明com能够显著降低细胞线粒体膜电位。当tfds及不同部位对com黏附的hk-2细胞模型进行干预时，细胞的线粒体膜电位发生了显著的变化。tfds中的三个浓度均能显著上调线粒体膜电位红绿荧光比值：1.06(p<0.05)、1.59(p<0.01)、2.52(p<0.001)；但给药组p2-h的线粒体膜电位红绿荧光比值高达2.65(p<0.001)，效果略优总黄酮的高剂量，能显著性(p<0.001)的调控线粒体膜电位红绿荧光比值水平。

annexinv-fitc/pi双染流式细胞术检测细胞凋亡影响

图6示出了tfds及不同部位对com导致hk-2细胞凋亡影响。

从图6细胞凋亡实验可发现，模型组的细胞凋亡达到14.0％，正常细胞组凋亡达到1.8％，模型组细胞凋亡显著性增加(p<0.001)。tfds及各洗脱部位给药可有效的抑制细胞凋亡，tfds的低中高剂量均使细胞的凋亡减少至8.4％(p<0.05)、3.7％(p<0.01)、3.7％(p<0.01)；而p1低中高剂量抑制细胞的凋亡率分别达到：7.0％(p<0.01)、5.9％(p<0.01)、2.8％(p<0.001)；低中高剂量的p2使细胞凋亡率降低3.5％、3.1％、2.4％，与模型组相比具有显著性差异(p<0.001)。由图5可明显看出tfds及不同部位给药均抑制细胞凋亡，且具有浓度依赖性。其中，p2的凋亡率在相同剂量下抑制凋亡作用优于tfds，其次为tfds。

westernblot法检测tfds及不同极性部位对com黏附的hk-2细胞膜上occludin与zo-1蛋白表达影响

图7示出了tfds及不同部位对com黏附的hk-2细胞膜上occludin与zo-1蛋白表达影响。a代表occludin蛋白表达；b代表zo-1蛋白表达。

如图7所示，与正常细胞相比，草酸钙com模型组细胞中的occludin与zo-1蛋白表达均显著下调，occludin蛋白下调到0.46(p<0.001)，zo-1蛋白下调到0.45(p<0.001)。在occludin蛋白实验中，给药组tfds浓度分别为50、200μg/ml，与模型组相比较，分别上调到：0.65(p<0.05)，1.21(p<0.01)；p1浓度分别为50、200μg/ml，与模型组相比较，分别上调到：0.79(p<0.001)0.90(p<0.05)；而在p2中，分别上调到：0.79(p<0.05)，1.23(p<0.01)。在zo-1蛋白实验中，给药组tfds浓度为50、200μg/ml，与模型组相比较，分别上调到：0.97(p<0.05)，1.45(p<0.001)；p1浓度为50、200μg/ml，与模型组相比较，分别上调到：1.02(p<0.001)，1.11(p<0.001)；而在p2中，分别上调到：1.29(p<0.001)，1.67(p<0.001)。

因此，在肾结石细胞模型实验中，com导致细胞膜上的occludin与zo-1蛋白下调，经过tfds及不同洗脱部位的处理，发现occludin与zo-1蛋白具有上调趋势，结果说明tfds及不同洗脱部位具有促进occludin与zo-1蛋白上调的作用，tfds治疗肾结石可能是通过调节occludin与zo-1达到疗效的。而在tfds及不同洗脱部位中，与其他两组比较。发现p2在高剂量(200μg/ml)对occludin蛋白的调节作用最强，而对zo-1调节作用中，低高剂量p2对occludin与zo-1蛋白的上调作用强。

通过上述可以证明，当hk-2细胞膜表面受到com的黏附时，细胞发生氧化损伤，刺激活性氧的产生，导致一系列过氧化代谢产物的产生，抗氧化剂的含量下降。从实验中可发现。tfds的85％洗脱部位(p2)能够降低com黏附hk-2细胞所引起的活性氧含量，下调能力强，而tfds也表现较强的下调作用，能够减少活性氧对细胞的损伤，保护细胞膜。而tfds的25％洗脱部位(p1)也能够一定程度上下调活性氧的含量，但下调能力弱于前两者。广金钱草总黄酮ods柱25％洗脱部位或/和广金钱草总黄酮ods柱85％洗脱部位具有保护hk-2细胞的作用。可以有效降低com刺激hk-2细胞产生的线粒体膜电位损伤，具有保护线粒体的功能；上调occludin，zo-1的蛋白量表达，调控tj的屏障功能和渗透压作用，减伤com对细胞膜的损伤。减少细胞的损伤及凋亡。

广金钱草总黄酮25％ods洗脱部位和85％ods洗脱部位活性成分的检测

细胞给药

将处于指数生长期的细胞消化制备成单细胞悬液后，以5×10⁵个/ml的密度接种于6孔板中，培养至指数生长期。称取适量的纯度为75％的tfds粉末，用dmem-f12培养基溶解成储备液，30mg/ml浓度药液加入细胞37℃、5％co2、相对湿度95％培养箱中培养2h后，显微镜观察细胞的生长状态。

tfds活性成分与hk-2细胞结合

将处于指数生长期的细胞消化制备成单细胞悬液后，接种入75cm²培养瓶中，将其分为空白对照组和tfds给药组。当细胞融合率90％时，用pbs润洗细胞表面少许的死细胞后，在tfds给药组中加入用dmem-f12培养液稀释好的tfds，终浓度为30mg/ml后，空白组只加入等体积的dmem-f12培养液，放置于细胞培养箱中培养4h，条件为37℃、5％co2、相对湿度95％。

tfds未结合成分的洗脱

2h后，将空白细胞空白培养液、给药细胞含tfds培养液弃去，加入5mlpbs缓冲液，洗涤细胞，弃去洗涤液，反复清洗，直至洗涤液无保留峰,收集最后的洗脱液。

配制枸橼酸缓冲盐溶液

甲液：精密称取枸橼酸21g,无菌水溶解定容至1000ml，4冰箱保存。乙液：称取磷酸氢二钠粉末71.63g,无菌水溶解定容至1000ml；取甲液61.45ml，乙液38.55ml混合均匀，用盐酸调节其ph值为4.0时，过0.22μm微孔滤膜过滤即得。

tfds与hk-2细胞结合成分的解离

洗脱后加入ph＝4的枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液，37℃、5％co2相对湿度95％培养箱中培养1h。酸性条件下与细胞结合的活性成分发生解离并释放至解离液中。解离后吹打细胞，收集细胞及解离液。

高效液相色谱法检测hk-2细胞结合成分

色谱柱phenomenexkinetexc18(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液为流动相a，以甲醇为流动相b，梯度洗脱：0-30min,74％a；30-60min,74-35％a；60-75min,35-5％a；20-25min,5％a；检测波长272nm；流速：1.0ml·min^-1；柱温：40℃；进样量10μl。

uplc-q-tof/ms鉴定hk-2细胞结合成分

液相条件：phenomenexkinetexc18column(100mm×2.1mm,1.7μm)；流动相：01％甲酸乙腈(a)-0.1％甲酸水(b)，梯度洗脱；洗脱条件：0-7min,10％-15％a；7-9min,15％-40％a；9-12min,40％-100％a；12-13min，100％a；13-14min，100％-10％a；14-18min,10％a。柱温35℃，进样量1μl,流速0.4ml/min。

质谱条件：数据采集模式采用5600+lc30+cds；扫描类型：tofms；扫描范围：100-1000；检测模式：negtive；雾化气：55psi；辅助气：55psi；气帘气：35psi；雾化温度：550℃；离子源：duospray电喷雾离子源；离子化电压：4500v；去簇电压：100v；碰撞能：45v；碰撞活化扫描：15v。

细胞破碎液检测

将细胞及细胞解离液,、细胞最后洗脱液置于氮吹仪37℃吹干后，用200μl的甲醇复溶，涡旋使成分充分溶解于甲醇中，高速冷冻离心机离心10000r/min，离心10min，取上清液注入hplc色谱仪和质谱仪检测，记录色谱峰。

hplc检测给药后hk-2细胞结合的活性成分

通过高效液相色谱法对所收集的洗脱液、空白细胞解离液、给药细胞解离液进行初步的检测，发现给药组最后洗脱液中已无特异性色谱峰，说明了最后的洗脱液已将未与细胞结合的tfds药液成分洗脱干净。检测了空白细胞解离液，排除空白细胞中成分的影响。说明了细胞膜能够与tfds中的成分发生特异性结合。这为下一步对细胞膜特异性结合成分的进一步鉴定提供依据。

鉴定tfds与hk-2细胞结合的活性成分

为鉴定细胞与广金钱草总黄酮的结合的活性成分，实验采用uplc-q-tof/ms方法对给药细胞裂解液、空白裂解液、最后一次洗脱液及药液进行分析对比，从总离子流图发现，空白细胞裂解液中没有存在特异性的色谱峰，给药后细胞裂解液的总离子流图现存在着特异性色谱峰。

使用peakview软件对空白细胞裂解液、tfds给药组裂解液、最后洗脱液及tfds药液进行分析，结合课题组前期对广金钱草化学成分的定性鉴定所得的数据库进行检索，确定tfds给药组中特有的分子量，并提取离子色谱图及其二级质谱图，并汇总为表2，通过给药组裂解液中的特异性成分的离子碎片信息与文献，及对照品的保留时间及碎片信息进行比对。初步确定了tfds给药组解离液中含有的化合物分别为：维采宁-2(p1)、维采宁-1(p2)、carlinoside(p3)、异夏佛塔苷(p5)、夏佛塔苷(p6)、异牡荆苷(p7)、紫云英苷(p9)、染料木素(p10)和香叶木素(p11)。由于裂解液还含有与夏佛塔苷相同分子量且裂解碎片相同，但保留时间不同的的化合物，因此无法准确定性其化合物结构，因此推测可能含有夏佛塔苷同分异构体ⅰ(p4)、夏佛塔苷同分异构体ⅱ(p8)。本章以色谱图中的p1-p9为例进行具体的结构解析。

p1:提取的色谱峰分子离子峰为m/z593.15[m-h]^-，对其二级图谱进行解析，得到离子碎片：295、297、383、473、593、575、591，与对照品比对，发现在保留时间及碎片裂解方式一致，因此确定p1为化合物维采宁-2。

p2:提取的色谱峰分子离子峰为m/z563.14[m-h]^-，对其二级图谱进行解析，得到离子碎片：296、297、325、353、383、395、443、473、563，与对照品比对，发现在保留时间及碎片裂解方式一致，因此确定p1为化合物维采宁-1。

p3:提取的色谱峰分子离子峰为m/z579.14[m-h]^-，对其二级图谱进行解析，得到离子碎片：203、298、327、339、369、399、429、471、489、519、531、561、579.与对照品比对，发现在保留时间及碎片裂解方式一致，因此确定p3为化合物carlinoside。

p4、p6与p8:三个色谱峰提取的色谱峰分子离子峰均为563.14[m-h]^-，从提取的二级离子碎片信息发现化合物的裂解碎片一致：296、297、325、353、383、395、443、473、563，说明其裂解方式相同；与对照品夏佛塔苷进行质谱数据比对，发现p6在保留时间及碎片离子与对照品夏佛塔苷相同，为对照品夏佛塔苷；p4与p8保留时间tr(min)为：4.30、7.58，与夏佛塔苷对照品的保留时间存在差异，推测为夏佛塔苷同分异构体，但由于缺乏对照品，未能准确鉴定结构，因此暂定p4与p8为：夏佛塔苷同分异构体ⅰ、夏佛塔苷同分异构体ⅱ。

p5:提取的色谱峰分子离子峰为m/z563.14[m-h]^-，对其二级图谱进行解析，得到离子碎片：296、297、325、353、383、395、443、473、563，与p6为同分异构体，但与p6的保留时间不同,tr(min)为4.79，通过对照品进行比对，发现p5与对照品色谱数据比对，因此确定p5为化合物异夏佛塔苷。

p7:提取的色谱峰分子离子峰为m/z431.10[m-h]^-，对其二级图谱进行解析，得到离子碎片：117、161、269、281、282、283、311、323、341、431，tr(min)为6.75，与对照品比对，发现在保留时间及碎片裂解方式一致，因此确定p7为化合物异牡荆苷。

p9:提取的色谱峰分子离子峰为m/z447.10[m-h]^-，对其二级图谱进行解析，得到离子碎片：127、183、225、227、255、284、285、329、447，保留时间tr(min)为8.67。结合文献报道，鉴定p9化合物可能为紫云英苷。

表2tfds细胞解离液中结合成分碎片离子信息

说明富集在tfds中p1洗脱部位与p2洗脱部位的主要包括维采宁-1、维采宁-2、维采宁-3、夏佛塔苷、异夏佛塔苷的组合物，能与hk-2细胞膜发生特异性结合，可以用于保护hk-2细胞，进一步地用于治疗肾结石。

为了便于对照，附上英文缩略词表如表3。

表3英文缩略词表

实施例1

本实施例提供一种组合物，组合物主要包括按质量百分数计的以下组分：

5％维采宁-1、8％维采宁-2、8％维采宁-3、15％夏佛塔苷、23％异夏佛塔苷以及余下的细胞培养液。

实施例2

本实施例提供一种组合物，组合物主要包括按质量百分数计的以下组分：

11％维采宁-1、15％维采宁-2、15％维采宁-3、30％夏佛塔苷、25％异夏佛塔苷以及余下的细胞培养液。

对实施例1与实施例2提供的组合物采用试验例提供方法对com损伤hk-2细胞进行培养，检测。发现实施例1与实施例2提供的组合物均能降低com刺激hk-2细胞产生的线粒体膜电位损伤，上调occludin，zo-1的蛋白量表达，减少细胞的损伤及凋亡。

说明实施例1与实施例2提供的组合物具有保护被一水草酸钙损伤的hk-2细胞的作用。

以上所述仅为发明的优选实施例而已，并不用于限制发明，对于本领域的技术人员来说，发明可以有各种更改和变化。凡在发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在发明的保护范围之内。