本发明属于尿素清除剂
技术领域：
，具体涉及一种用作尿素清除剂的脲酶凝胶微球的制备方法和用途。
背景技术：
慢性肾衰竭是一种肾脏不能实现血液净化的综合症。这种综合症会导致尿毒素的积累，危害人体健康。根据2012年美国肾脏数据库(usrds)的数据显示，在2010年，几乎有600000美国人接受了肾脏移植的手术，400000患者接受透析治疗。由于肾衰竭患者数量的不断增加，对于肾脏的治疗的需求也在增加。肾脏移植或许是肾衰竭的最终治疗方法，但是受到供体短缺，免疫排斥反应，治疗费用昂贵等因素的限制。血液透析和血液灌流是常用的清除尿毒素的方法。尿素是一种主要的尿毒素，是机体蛋白代谢的主要产物，其代谢产物为氰酸盐，有很强的细胞毒性，当肾衰竭时，肾脏失去了有效清除尿素和其代谢产物氰酸盐的能力，使其在体内积累，造成蛋白的合成障碍和组织器官相关功能障碍。清除肾衰竭病人血液中多余的尿素是很有必要的。尿素几乎不能通过活性炭颗粒、离子交换树脂或者反渗透膜从水溶液中除去。脲酶是一种含有镍的金属酶，可以特异性的催化尿素分解。但是直接使用的酶，容易失活，通常要将其固定在一定的基体上以维持较长时间的活性。目前的文献报道中，天然高分子例如壳聚糖、甲壳素、海藻酸钠、明胶、淀粉，合成高分子如聚丙烯、环氧树脂等被用于脲酶的固定。另外一些无机材料如二氧化钛、二氧化硅等也被应用于脲酶的固定化。然而，对于脲酶固定化的研究大多集中在固定化脲酶的催化活性，将其应用于血液灌流中尿素的清除鲜有报道。技术实现要素：为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种用作尿素清除剂的脲酶凝胶微球的制备方法和用途,并将其应用于血液灌流中尿素的清除。本发明所采用的技术方案为：一种用作尿素清除剂的脲酶凝胶微球的制备方法，所述制备方法由以下步骤组成：a、制备聚合物溶液：以丙烯酸和n-乙烯基吡咯烷酮为单体，与聚醚砜进行原位交联制备出聚合物溶液；b、制备凝胶微球：将所述聚合物溶液喷入非溶剂中发生相转变，形成凝胶微球；c、制备脲酶凝胶微球：将脲酶以化学接枝的方式固定在所述凝胶微球上，得到脲酶凝胶微球。本发明的制备方法的优点在于，制备出的脲酶凝胶微球在分解尿素的同时具有良好的血液相容性。发明人认为制备凝胶微球的基材会对材料是否具有良好的血液相容性造成影响，从而影响其在血液灌流中的应用。经过筛选，发明人发现选用聚醚砜最终制备的材料不会引起凝血、溶血等其他免疫反应。从而制备出的脲酶凝胶微球在分解尿素的同时具有良好的血液相容性。进一步的，所述步骤a中制备聚合物溶液的原料由如下重量份数的组分组成：聚醚砜6~12份；丙烯酸2份；n-乙烯基吡咯烷酮0.3份；引发剂0.02份；交联剂0.2份和溶剂86~92份。进一步的，所述步骤a的具体步骤为：a1、将聚醚砜溶解于溶剂中，然后将丙烯酸、n-乙烯基吡咯烷酮、引发剂和交联剂加入到上述聚醚砜溶液中，形成反应原料液；a2、将所述反应原料液置于氮气氛围下，油浴恒温反应后，得到反应液；a3、将所述反应液置于空气中终止反应，得到聚合物溶液。进一步的，所述油浴恒温的温度为70℃，所述油浴恒温的时间为24h。进一步的，所述步骤b的具体步骤为：用静电喷球装置将所述步骤a的聚合物溶液在高电压作用下喷入超纯水中，聚合物溶液在超纯水中发生相转变，形成凝胶微球。进一步的，所述步骤c的具体步骤为：c1、将所述步骤b的凝胶微球加入到含有1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-琥珀酰亚胺的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，得到混合液；c2、将脲酶加入到所述混合物液中，搅拌反应后，得到脲酶凝胶微球。进一步的，所述步骤c2中搅拌反应的温度为室温，所述步骤c2中搅拌反应的时间为12~24h。进一步的，还包括步骤d、清洗：将所述脲酶凝胶微球用超纯水冲洗多次后浸泡在超纯水中，并在-4℃下存储。脲酶凝胶微球用作尿素清除剂的用途。本发明的有益效果为：1、本发明采用了具有良好血液相容性的聚醚砜作为原料，制备的凝胶微球不会引起凝血反应，溶血率也远低于国际标准5%（astmf-756-08standard），且不会引起其他免疫反应，从而本发明具有良好的安全性。2、本发明的脲酶凝胶微球可以特异性的催化尿素分解，具有分解量高的特点，另外，本发明的脲酶凝胶微球有一定的储存稳定性，有良好的重复使用性。3、本发明使用静电喷球装置制备凝胶微球，操作简便，效率高，使最终得到的脲酶凝胶微球尺寸更为均匀。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。一种用作尿素清除剂的脲酶凝胶微球的制备方法，所述制备方法由以下步骤组成：a、制备聚合物溶液：以丙烯酸和n-乙烯基吡咯烷酮为单体，与聚醚砜进行原位交联制备出聚合物溶液；b、制备凝胶微球：将所述聚合物溶液喷入非溶剂中发生相转变，形成凝胶微球；c、制备脲酶凝胶微球：将脲酶以化学接枝的方式固定在所述凝胶微球上，得到脲酶凝胶微球。进一步的，所述步骤a中制备聚合物溶液的原料由如下重量份数的组分组成：聚醚砜6~12份；丙烯酸2份；n-乙烯基吡咯烷酮0.3份；引发剂0.02份；交联剂0.2份和溶剂86~92份。进一步的，所述步骤a的具体步骤为：a1、将聚醚砜溶解于溶剂中，然后将丙烯酸、n-乙烯基吡咯烷酮、引发剂和交联剂加入到上述聚醚砜溶液中，形成反应原料液；a2、将所述反应原料液置于氮气氛围下，油浴恒温反应后，得到反应液；a3、将所述反应液置于空气中终止反应，得到聚合物溶液。进一步的，所述油浴恒温的温度为70℃，所述油浴恒温的时间为24h。进一步的，所述步骤b的具体步骤为：用静电喷球装置将所述步骤a的聚合物溶液在高电压作用下喷入超纯水中，聚合物溶液在超纯水中发生相转变，形成凝胶微球。进一步的，所述步骤c的具体步骤为：c1、将所述步骤b的凝胶微球加入到含有1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-琥珀酰亚胺的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，得到混合物；c2、将脲酶加入到所述混合物中，搅拌反应后，得到脲酶凝胶微球。进一步的，所述步骤c2中搅拌反应的温度为室温，所述步骤c2中搅拌反应的时间为12~24h。进一步的，还包括步骤d、清洗：将所述脲酶凝胶微球用超纯水冲洗多次后浸泡在超纯水中，并在-4℃下存储。脲酶凝胶微球用作尿素清除剂的用途。实施例1一种用作尿素清除剂的脲酶凝胶微球的制备方法,由如下步骤组成：1.取聚醚砜9份和n,n-二甲基乙酰胺90份混合后机械搅拌，直到聚醚砜完全溶解后得到混合液，向上述混合液中加入2份丙烯酸，0.15份n-乙烯基吡咯烷酮，0.03份引发剂偶氮二异丁腈(aibn)，0.2份交联剂n,n'-亚甲基双丙烯酰胺(mba)，得到混合物；将上述混合物在氮气氛围下排氧30min；再将其置于70℃的油浴中，氮气氛围下，连续机械搅拌，反应24h，之后将其暴露在空气中终止反应，最终得到澄清略带黄色的聚合物溶液。2.将上述制备的聚合物溶液转移到10ml注射器中，安装好静电喷球装置，通过电压作用，使聚合物溶液以一定的速度进入超纯水中发生液-固相转变，制备出尺寸为200-800µm左右大小的凝胶微球。通过静电喷球装置制备的凝胶微球表面的功能基团(羧基)的量以及微球本身的比表面积会影响脲酶的接枝量，最终会影响其分解尿素的效果，因此需要根据实际的需要控制凝胶微球的尺寸大小在200-800µm以保证对尿素的分解效果。3.将1.95g2-吗啉乙磺酸加入到100ml超纯水中，搅拌溶解,使ph在6-6.5之间,然后再分别加入1.95g1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc•hcl)和0.2gn-琥珀酰亚胺（nhs），搅拌使其完全溶解。再加入3g上述制备好的凝胶微球，机械搅拌1h；然后称取0.1g洋刀豆脲酶加入到上述混合物中，常温下，机械搅拌反应12h，得到脲酶凝胶微球；将制备好的脲酶凝胶微球，用超纯水洗涤3-5次，之后浸泡在超纯水中并储存在-4℃的冰箱中备用。实施例2一种用作尿素清除剂的脲酶凝胶微球的制备方法，所述制备方法由以下步骤组成：a、制备聚合物溶液：以丙烯酸和n-乙烯基吡咯烷酮为单体，与聚醚砜进行原位交联制备出聚合物溶液；所述步骤a中制备聚合物溶液的原料由如下重量份数的组分组成：聚醚砜6份；丙烯酸2份；n-乙烯基吡咯烷酮0.3份；引发剂0.02份；交联剂0.2份和溶剂86份；所述步骤a的具体步骤为：a1、将聚醚砜溶解于溶剂中，然后将丙烯酸、n-乙烯基吡咯烷酮、引发剂和交联剂加入到上述聚醚砜溶液中，形成反应原料液；a2、将所述反应原料液置于氮气氛围下，油浴恒温70℃反应24h后，得到反应液；a3、将所述反应液置于空气中终止反应，得到聚合物溶液。b、制备凝胶微球：用静电喷球装置将所述步骤a的聚合物溶液在高电压作用下喷入超纯水中，聚合物溶液在超纯水中发生相转变，形成凝胶微球。c、制备脲酶凝胶微球：c1、将所述步骤b的凝胶微球加入到含有1-乙基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-琥珀酰亚胺的2-吗啉乙磺酸（mes）缓冲溶液中，得到混合物；c2、将脲酶加入到所述混合物液中，室温搅拌反应12~24h后，得到脲酶凝胶微球。d、清洗：将所述脲酶凝胶微球用超纯水冲洗3~5次后浸泡在超纯水中，并储存在-4℃的冰箱中备用。实施例3本实施例与实施例2的区别在于：所述步骤a中制备聚合物溶液的原料由如下重量份数的组分组成：聚醚砜12份；丙烯酸2份；n-乙烯基吡咯烷酮0.3份；引发剂0.02份；交联剂0.2份和溶剂92份；其余与实施例2相同。实施例4本实施例与实施例2的区别在于：所述步骤a中制备聚合物溶液的原料由如下重量份数的组分组成：聚醚砜9份；丙烯酸2份；n-乙烯基吡咯烷酮0.3份；引发剂0.02份；交联剂0.2份和溶剂90份；其余与实施例2相同。实施例5本实施例与实施例1的区别在于：取聚醚砜6份和n,n-二甲基乙酰胺86份混合后机械搅拌，直到聚醚砜完全溶解后得到混合液，向上述混合液中加入2份丙烯酸，0.1份n-乙烯基吡咯烷酮，0.02份引发剂偶氮二异丁腈(aibn)，0.2份交联剂n,n'-亚甲基双丙烯酰胺(mba)，得到混合物；将上述混合物在氮气氛围下排氧30mim；再将其置于70℃的油浴中，氮气氛围下，连续机械搅拌，反应24h，之后将其暴露在空气中终止反应，最终得到澄清略带黄色的聚合物溶液。其余与实施例1相同。实施例6本实施例与实施例1的区别在于：取聚醚砜12份和n,n-二甲基乙酰胺86-92份混合后机械搅拌，直到聚醚砜完全溶解后得到混合液，向上述混合液中加入2份丙烯酸，0.3份n-乙烯基吡咯烷酮，0.04份引发剂偶氮二异丁腈(aibn)，0.2份交联剂n,n'-亚甲基双丙烯酰胺(mba)，得到混合物；将上述混合物在氮气氛围下排氧120mim；再将其置于70℃的油浴中，氮气氛围下，连续机械搅拌，反应48h，之后将其暴露在空气中终止反应，最终得到澄清略带黄色的聚合物溶液。其余与实施例1相同。实施例7本实施例与实施例1的区别在于：取聚醚砜7份和n,n-二甲基乙酰胺88份混合后机械搅拌，直到聚醚砜完全溶解后得到混合液，向上述混合液中加入2份丙烯酸，0.15份n-乙烯基吡咯烷酮，0.025份引发剂偶氮二异丁腈(aibn)，0.2份交联剂n,n'-亚甲基双丙烯酰胺(mba)，得到混合物；将上述混合物在氮气氛围下排氧80mim；再将其置于70℃的油浴中，氮气氛围下，连续机械搅拌，反应32h，之后将其暴露在空气中终止反应，最终得到澄清略带黄色的聚合物溶液。其余与实施例1相同。验证例对实施例1制得的脲酶凝胶微球的消除尿素的效果进行验证将0.28g脲酶凝胶微球加入到不同浓度的尿素溶液中，在37℃下，震荡速率为200rpp的恒温孵化箱中孵化不同时间。使用尿素测试试剂盒（quantichromureaassaykits(diur-500,bioassaysystems,hayward,ca,usa)测试尿素的分解量，结果表明8h可以催化尿素分解的量为44-73mg/g，清除率为85%-97%。具有良好的储存稳定性，储存7天可以保持85%的相对活性，储存15天仍然可以保持68%的相对活性。1、本实施例选用了现有的专利技术的技术效果进行了对比，具体对比如下表1。表1本发明与现有技术的特点对比表
专利名称：专利号特点是否血液相容性氧化双醛纤维素固定化脲酶的制备方法cn201210237673.x主要比较固定化脲酶与纯脲酶的活性。测定固定化脲酶的最适温度ph值，得出固定化脲酶的温度难度耐受性和酸性条件下的ph耐受性提高。无，并且纤维素有引发补体激活的危险脲酶复合的尿素氮吸附剂及其制备方法cn200410093894.x尿素吸附剂的吸附能力为（时间为6-8h）20-30mg/g。无本发明的制备方法制备的脲酶凝胶微球尿素吸附剂的吸附能力为（时间为6-8h）44-73mg/g。有，安全性高2、尿素分解的测试将约0.28g脲酶凝胶微球分别加入到浓度为40、60、80mg/dl的尿素溶液中，37℃恒温震荡8h。利用quantichromtmureaassaykit(diur-500)尿素测试试剂盒与尿素发生特异性的显色反应来确定尿素的分解量。并利用酶标仪（thermomultiskanfc）在波长为520nm处分别测定分解前后的吸光度来计算尿素的分解量。在37℃下分解8h得到的如下结果：分解量分别为44mg/g、63mg/g、73mg/g。3、储存稳定性测试将制备好的脲酶凝胶微球浸泡在去离子水中，并储存于-4℃的条件下1天、7天、15天，再根据上述1中提到的方法测定固定化脲酶的活性。实验结果以储存1天时的活性为100%，储存7天、15天之后的相对活性分别为85%、68%。4、循环稳定性测试将0.28g脲酶凝胶微球加入到80mg/dl的尿素溶液中，37℃下振荡2h。将脲酶凝胶微球用去离子水洗涤至少三次，回收利用，重复上述操作5次。然后根据上述1所述方法测定固定化脲酶的活性。以第一次测定的活性为100%，后续用相对活性表示。最终结果显示，5次循环固定化脲酶的活性几乎没有变化。5、凝血反应血液灌流材料应该具有良好的血液相容性，否则会引起凝血反应，甚至血栓的形成。利用半自动凝血仪（sysmexcorporation,kobe,japan）测定活化部分凝血酶时间（aptt），凝血酶原时间（pt）和凝血酶时间（tt）。aptt的测试过程为：测试之前，脲酶凝胶微球在生理盐水中浸泡过夜并在37℃下孵化2h，之后，将生理盐水移除，再加入300µl新鲜的纯血浆，37℃下孵化30min。然后50μl经过孵化后的血浆转移到测试管，同样的，50μlaptt试剂（使用前孵化10min），之后再将50μl0.025mcacl2溶液。测定tt和pt时，则是分别将50μl纯血浆和凝血酶试剂和凝血酶原测试试剂加入到测试管中。最终得到的测试结果为脲酶凝胶微球的aptt、tt、pt分别为44.4s、20.9s、13.8s。纯血浆的aptt、tt、pt分别为44s、21.5s、14.1s。从实验结果可以得出，本发明制得的脲酶凝胶微球不会引起凝血反应。6、溶血率通过测定溶血率来确定材料的红细胞相容性。测试之前，脲酶凝胶微球在生理盐水中浸泡过夜，然后与1ml血红细胞在37℃下孵化3h。选用生理盐水和去离子水分别作为阴性和阳性对照。之后将血细胞悬浮液离心，取上层清液，利用紫外分光光度计（uv-1750,shimadzuco.,ltd,japan）在540nm处测定吸光度。溶血率通过如下公式计算：溶血率=×100其中as，an，ap，分别为血细胞悬浮液的吸光度，阴性和阳性对照的吸光度。最终得到的结果是溶血率为0.81%，远小于国际标准5%（astmf-756-08standard）。7、补体激活和接触激活补体激活，由局部炎症介质引起，被认为是宿主防御机制的一个触发器。当材料表面与血液接触时，可能会影响血液相容性。接触激活被认为是引起凝血的一个重要的原因，血小板激活可能会导致血小板聚集和凝血级联激活。通过利用酶联免疫吸附实验（elisa）测定c3a（人类补体片段3a），c5a（人类补体片段5a）的生成浓度来研究补体激活，pf4（血小板因子）反应血小板激活水平，tat反应凝血激活。最终得到的结果是本发明制得的脲酶凝胶微球与空白样相比，以上四种因子的浓度均没有明显变化。综上所述，本发明实施例1的制备方法制得的脲酶凝胶微球在37℃恒温条件下，8h可以催化尿素分解的量为44-73mg/g，清除率为85%-97%。具有良好的储存稳定性，储存7天可以保持85%的相对活性，储存15天仍然可以保持68%的相对活性。而且具有良好的血液相容性，不会引起凝血反应，溶血率远低于国际标准5%（astmf-756-08standard），且不会引起其他免疫反应，具有良好的安全性，从而本发明的制备方法制得的脲酶凝胶微球可以很好的用于血液灌流领域中的尿素清除用途。本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。当前第1页12