作为免疫增强剂的精胺修饰的普鲁兰多糖的制作方法

本发明涉及一种精胺修饰的普鲁兰多糖，特别涉及其在制备肿瘤免疫增强剂(也称为免疫促进剂或免疫刺激剂)中的应用。
背景技术：
手术切除、化学药物治疗(化疗)及放射治疗(放疗)等传统肿瘤治疗方式以杀灭肿瘤细胞为主，肿瘤免疫治疗则通过对免疫细胞的作用而诱导机体产生针对肿瘤抗原的特异性细胞免疫反应，达到清除肿瘤的目的。由于大多数肿瘤细胞缺少特异性肿瘤抗原，而且在肿瘤微环境中免疫细胞的功能通常会被严重抑制，因此，利用体内多种肿瘤相关抗原(细胞、细胞碎片、细胞分泌的蛋白等)的免疫刺激治疗具有重要作用。对免疫细胞具有刺激作用的物质包括细菌内毒素(lps)、cpg、阳离子化合成高分子(如pei)、阳离子化多糖(如壳聚糖)、纳米颗粒、铝盐佐剂(氢氧化铝、磷酸铝)、mf59(一种包含1％的鲨烯,0.5％的tween80和0.5％的三油酸聚山梨脂的水包油乳液)、as03、as04，等。但现有免疫刺激剂仍存在较多不足，例如诱导细胞免疫应答能力较弱(如铝盐佐剂)，成分较复杂、质量难以控制(如黄芪多糖、人参多糖、灵芝多糖)等，虽然部分免疫增强剂作为疫苗佐剂获得了广泛应用，但在肿瘤免疫治疗领域中应用仍然很少。开发更安全高效的新型免疫增强剂是疫苗研发和肿瘤免疫治疗的迫切需求。普鲁兰多糖是一种从出芽短梗霉发酵产物中提取的多糖，其制备方法简便，生产工艺成熟，容易获取且成本低，生物相容性好，已广泛用于食品、医药等领域。精胺是生物体内天然存在的一种多氨基小分子，将其连接到普鲁兰多糖分子上可生成精胺修饰普鲁兰多糖(ps)。ps作为基因递送载体已有研究和报道，但作为免疫增强剂的相关应用尚未见公开报道。技术实现要素：本发明提供了一种免疫增强剂(也可称为免疫促进剂或免疫刺激剂)，所述免疫增强剂为具有以下特征的精胺修饰的普鲁兰多糖(ps)，其中所述精胺分子直接偶联在多糖的羟基或c骨架上；或者所述精胺分子通过间隔分子(spacer)间接连接在多糖的羟基或c骨架上；其中精胺分子的导入率在1％-90％之间，特别是在10％-30％之间。所述精胺分子的导入率定义为偶联在多糖上的精胺分子占多糖中全部羟基的比例。本发明首次发现ps具有免疫增强剂的作用，可单独激活一种或多种免疫细胞，提高机体的固有免疫响应；也可以作为免疫佐剂，增强机体对特定抗原的特异性免疫响应。本发明中所述ps单独使用时，可以有效激活巨噬细胞，提高巨噬细胞的抗原呈递能力和分泌多种对肿瘤具有杀伤作用的细胞因子的能力；也可以促进t淋巴细胞活化，对肿瘤细胞产生杀伤作用。上述功能可有效抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的生存期。其中，所述肿瘤为乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤。另一方面，本发明涉及一种具有免疫增强作用的组合物，其中所述组合物包含本发明所述的ps和其他免疫增强剂(如脂多糖(lps，由各种革兰氏阴性菌获得))，其中ps在组合物中占20％以上，特别是占50％以上。ps与lps或其他免疫增强剂联合使用时，可发挥协同效应，进一步提高免疫响应水平，更显著地抑制肿瘤生长，延长小鼠生存期。其中，所述肿瘤为乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤。另一方面，本发明涉及根据本发明所述的免疫增强剂或免疫增强组合物在制备用于治疗肿瘤的免疫药物组合物中的用途；所述免疫药物组合物包括肿瘤灭活疫苗、肿瘤特异性多肽抗原或肿瘤特异性蛋白质抗原等抗肿瘤免疫治疗药物和基于ps的免疫增强剂或免疫增强组合物。所述肿瘤选自乳腺癌、肝癌、肺癌和黑色素瘤。与现有技术相比，本发明的有益效果是：ps带有正电荷，可以通过静电相互作用有效吸附或包覆抗原，可以延长抗原在注射部位的停留时间，使抗原更有效的进入抗原提呈细胞(apc)内，延长对apc的作用时间，从而更有效地诱导apc细胞产生体液免疫。不同于传统铝佐剂，ps可以激活toll样受体，刺激巨噬细胞协同共刺激分子cd86以及mhc-i、mhc-ii的表达，在诱发体液免疫反应的同时可以引起细胞毒性t淋巴细胞的活化，诱导细胞免疫反应。与天然多糖提取物相比，ps的分子结构和成分明确，安全性与质量可得到更好的保证。而且，ps可与lps或其他免疫增强剂发挥协同效应，进一步提高机体的免疫响应水平。因此，ps是一种新型免疫增强剂，在肿瘤免疫治疗领域具有良好的应用前景。附图说明图1是ps对小鼠巨噬细胞raw264.7增殖的影响；图2a至图2c分别是ps以及ps与lps联合使用对小鼠巨噬细胞raw264.7分泌tnf-α、il-6、il-12的影响；其中con表示对照组；图3a至图3c分别是ps以及ps与lps联合使用对小鼠巨噬细胞raw264.7分泌cd86、mhc-i、mhc-ii的影响；其中con表示对照组；图4a至图4b分别是ps以及ps与lps联合使用对荷4t1乳腺癌小鼠的脾脏淋巴细胞cd4、cd8表达的影响；其中con表示对照组；图5是ps以及ps与lps联合使用对荷4t1乳腺癌小鼠的脾脏淋巴细胞分泌ifn-γ的影响；其中con表示对照组；图6是ps以及ps与lps联合使用对荷4t1乳腺癌小鼠进行治疗后，小鼠脾脏淋巴细胞对4t1乳腺癌细胞的杀伤能力；其中con表示对照组；图7是ps以及ps与lps联合使用对荷4t1乳腺癌小鼠进行治疗后，小鼠肿瘤体积变化情况；其中con表示对照组；图8是ps以及ps与lps联合使用对荷4t1乳腺癌小鼠进行治疗后，小鼠生存情况；其中con表示对照组。具体实施方式下面将对通过实例介绍本发明。下述实施例中如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用到的小鼠巨噬细胞raw264.7和小鼠乳腺癌细胞4t1均从中国医学科学院基础医学研究所细胞中心购买。下述实施例中所用试剂如无特殊说明，均通过正规商业途径购买得到。实施例1：普鲁兰多糖的精制ps可由商业途径获得的普鲁兰多糖或由其进一步精制获得的产物进行合成。典型的精制过程简述如下:将商业普鲁兰多糖(购自tokyochemicalindustry，平均分子量约为10万)在酸溶液中加热水解，并通过向水解产物中逐步添加乙醇进行分级沉淀精制,从而获得一系列具有不同分子量的普鲁兰多糖。典型的水解反应条件为：0.6mol/l硫酸溶液中80℃水解90min，此时普鲁兰多糖水解产物的平均分子量约在50000左右。可选取一种或多种分子量的普鲁兰多糖(典型分子量在5000-100000之间，特别是在50000左右)用于进一步合成ps。实施例2：ps的制备方法可利用偶联剂，如n,n′-羰基二咪唑(n,n'-carbonyldiimidazole,cdi)、n,n′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(n,n′-disuccinimidylcarbonate，dsc)、sodiumperiodate、galactoseoxidase的酶、反应性烷基卤素化合物、异氰酸酯等将精胺分子直接或间接偶联到普鲁兰多糖的羟基上；或通过高碘酸钠等氧化剂打开c-c键，形成醛基等活性官能团，从而进一步将精胺分子直接或间接偶联到普鲁兰多糖的碳骨架上。典型的反应条件如下：3.74g的精胺和450mg的cdi加入到100ml含100mg普鲁兰多糖的二甲亚砜(dimethylsulphoxide,dmso)中,35℃下搅拌反应20h,然后将混合液透析2天,透析截留分子量为8～14kd。透析完成后进行冷冻干燥即获得ps粉末.通过元素分析等方法可测得该条件下的精胺导入率约为25％左右。实施例3:cck8法检测ps对小鼠巨噬细胞活性影响使用小鼠巨噬细胞raw264.7进行实验，按每孔20000个细胞将raw264.7细胞按种于96孔板中，待细胞贴壁生长良好后，加入不同浓度的ps(1、2.5、5、7.5、10μg/ml)与细胞共孵育24h。采用pbs润洗两遍后，加入cck8检测试剂(100μl培养基+10μlcck8)，将培养板放于培养箱2h后，吸取上清，检测450/630nm处吸光度，整理数据。结果如图1所示，与未经处理的对照组相比，细胞存活率无显著差异，说明ps浓度小于10μg/ml时不会影响细胞活性。实施例4：ps以及ps联合lps可以促进巨噬细胞的活化小鼠巨噬细胞raw264.7按每孔2×105种于12孔板中，待细胞贴壁生长良好后，加入ps(最终浓度为7.5μg/ml)或ps与lps(最终浓度分别为7.5μg/ml和50ng/ml)，共孵育24h。收集细胞后采用pbs润洗两遍，提取细胞rna，步骤如下：a:每管加入1mltrizol后反复吹打混匀裂解细胞，冰上放置20分钟；b:每管加入200μl氯仿，摇晃混匀后，于冰上放置5分钟，之后12000rpm/分钟离心15分钟；c:吸取上层水相至新ep管中，加入等体积异丙醇后，放于-20℃冰箱1h；d:12000rpm/分钟离心10分钟，去上清后，加入75％乙醇洗涤沉淀两次，室温下晾干沉淀；e:加入depc水溶解沉淀，检测rna浓度。rna逆转成为cdna后，进行实时rt-pcr检测tnf-α、il-6和il-12的表达。结果如图2a至图2c所示，ps可以激活tnf-α的表达，与lps联用后可以显著提高tnf-α、il-6和il-12的表达，呈现协同效应，说明ps可以促进lps对巨噬细胞的活化作用。实施例5：ps以及ps联合lps增强巨噬细胞抗原递呈能力小鼠巨噬细胞raw264.7按每孔2×105种于12孔板中，待细胞贴壁生长良好后，ps(最终浓度为7.5μg/ml)或ps与lps(最终浓度分别为7.5μg/ml和50ng/ml)，37℃共孵育24h。收集细胞后，pbs润洗两遍，细胞重悬于含1％bsa(牛血清白蛋白)的pbs中，加入pe(藻红蛋白)标记的mhc-i、mhc-ii和cd86抗体4℃孵育30分钟，用含1％bsa的pbs润洗两遍后，采用流式细胞术检测细胞荧光强度。结果如图3a至图3c所示，ps与lps联用后可以显著提高mhc-i、mhc-ii和cd86的表达，呈现协同效应，说明ps可以增强lps对巨噬细胞的活化作用以及抗原递呈能力。实施例6：ps以及ps联合lps能增强荷瘤小鼠体内淋巴细胞的活化及对肿瘤细胞的杀伤能力于8周龄雌性balb/c小鼠左侧腹股沟处皮下乳腺脂肪垫注射4t1细胞，接种7天注射部位成瘤后，随机分组，于瘤旁皮下注射ps、lps或ps联合lps共注射，隔天注射一次，连续注射21天后，处死小鼠。无菌条件下分离小鼠脾脏，研磨制备单细胞悬液，采用淋巴细胞分离液分离小鼠脾脏淋巴细胞，pbs润洗两遍后，细胞重悬于含1％bsa的pbs中，之后加入pe标记的cd4、cd8抗体，4℃孵育30分钟，用含1％bsa的pbs润洗两遍后，采用流式细胞术检测细胞荧光强度。结果如图4a至图4b所示，ps治疗后的小鼠体内cd4和cd8阳性细胞比例显著上升(cd4：p(con,ps)<0.05；cd8：p(con,ps)<0.05)，表明ps可以显著增强荷4t1乳腺癌小鼠t淋巴细胞的增殖能力，促进荷瘤小鼠的细胞免疫功能，且ps携载lps可以进一步提高这种促进作用。将小鼠脾脏淋巴细胞种于12孔板，12h后收集细胞培养上清，elisa(酶联免疫吸附实验)方法检测ifn-γ的浓度。结果如图5所示，ps治疗后的小鼠脾脏淋巴细胞分泌ifn-γ的能力显著上调，促进荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫，同时，ps携载lps后，可以更有效的激活ifn-γ的分泌。将脾脏淋巴细胞作为效应细胞(effectercell)，cfse标记的4t1细胞作为靶细胞(targetcells)，按效应细胞与靶细胞的比例(e:t)为10或20进行共培养。4h后，收集细胞，流式检测前加入凋亡检测试剂碘化丙啶(pi)，被杀伤的肿瘤细胞呈现cfse+pi+双阳性。结果如图6所示，ps治疗后的小鼠脾脏淋巴细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤能力显著上调，表明ps可以提高荷瘤小鼠体内杀伤性t淋巴细胞的活性，提高抗肿瘤免疫效应，此外，ps携载lps后，可以进一步促进对肿瘤细胞的靶向杀伤能力。实施例7：ps以及ps联合lps在乳腺癌免疫治疗中的应用于8周龄雌性balb/c小鼠左侧腹股沟处皮下乳腺脂肪垫注射4t1细胞，接种7天注射部位成瘤后，随机分组，于瘤旁皮下注射ps、lps或ps联合lps共注射，隔天注射一次，记录小鼠生存情况，同时量取小鼠肿瘤长(l)和宽(w)，肿瘤体积用以下公式计算得到：v＝l×w×w/2结果如图7所示，单独注射ps或lps均可有效抑制肿瘤生长，表明ps具有良好的抗肿瘤作用。同时，ps与lps两者联用后呈现更好的抗肿瘤作用，显著抑制肿瘤生长。生存结果如图8所示，注射ps后可以显著延长小鼠生存期(p(con,ps)<0.05)，同时，ps携载lps后，可以更有效的促进lps的免疫激活作用，显著延长小鼠生存期(p(lps,ps+lps)<0.05)。实施例8：基于ps或ps联合lps的免疫药物组合物在乳腺癌免疫治疗中的应用于8周龄雌性balb/c小鼠左侧腹股沟处皮下乳腺脂肪垫注射4t1细胞，接种7天注射部位成瘤后，随机分组。将4t1细胞，用丝裂霉素(购自北京协和医院)处理后，得到灭活的肿瘤细胞，即为瘤苗。将瘤苗的浓度调整为105cell/ml，与ps或ps+lps溶液混合后，注射到小鼠皮下。分别在接种肿瘤细胞后第7天和第14天对上述4组小鼠进行两次免疫治疗，每次免疫各组注射制剂情况如下：(1)对照组：皮下注射pbs溶液(0.15m磷酸盐缓冲液，ph＝7.4)0.1ml和去离子水0.4ml。(2)瘤苗组：皮下注射灭活肿瘤细胞0.1ml和去离子水溶液0.4ml混合物。(3)ps+瘤苗组：皮下注射灭活肿瘤细胞0.1ml和ps水溶液0.4ml混合物。(4)ps+lps+瘤苗组：皮下注射灭活肿瘤细胞0.1ml和ps+lps水溶液0.4ml混合物。在上述过程中，持续观察小鼠的肿瘤尺寸变化。第二次免疫5天后，ps+瘤苗组及ps+lps+瘤苗组中部分小鼠的肿瘤逐渐缩小，对照组及tcv组小鼠肿瘤尺寸发展较快。在第二次免疫15天后，处死肿瘤未治愈小鼠，测量最终肿瘤尺寸，统计有效率。肿瘤尺寸与对照组平均尺寸相比小于50％者视为治疗有效。统计结果见表1，显示出ps+瘤苗及ps+lps+瘤苗能够明显提高肿瘤免疫治疗的有效率。表1.ps或ps联合lps与瘤苗的组合制剂在乳腺癌免疫治疗中的作用有效率(％)瘤苗组9ps+瘤苗组53ps+lps+瘤苗组81实施例9：ps、ps联合lps及基于ps或ps联合lps的免疫药物组合物在肝癌、肺癌、及黑色素瘤免疫治疗中的应用参照实施例8，于8周龄雌性balb/c小鼠皮下分别注射hepa1-6小鼠肝癌细胞、小鼠lewis肺癌细胞、b16小鼠黑色素瘤细胞，获得肝癌、肺癌及黑色素瘤小鼠模型。将相应的细胞用丝裂霉素处理后，得到灭活的肿瘤细胞瘤苗。参照实施例8进行分组及肿瘤免疫治疗实验。统计结果见表2，显示在这些小鼠肿瘤模型中ps+瘤苗及ps+lps+瘤苗都能够明显提高肿瘤免疫治疗的有效率。表2.ps或ps联合lps与瘤苗的组合制剂在肝癌、肺癌、及黑色素瘤免疫治疗中的作用当前第1页12