本发明涉及中兽药组合物领域，具体为一种预防舍饲绵羊尿结石复方中药组合物。
背景技术：
羊尿道结石是指尿路中盐类结晶凝结成大小不一、数量不等的凝结物，刺激尿路黏膜而引起的出血性炎症和尿路阻塞性疾病。临床上以腹痛，排尿障碍和血尿为特征。
经有关资料归纳显示，尿结石不但受饲料品种的影响，而且尿石的化学成分因家畜种类不同，也不一致。
目前，形成尿结石的真正机制还不很清楚，一般认为与以下三个因素有关。
1、尿石的核心物质。这是形成尿石的基质，多为黏液、凝血块、脱落的上皮细胞、坏死组织碎片、红细胞、微生物、纤维蛋白和砂石颗粒等，均可作为尿石的核心物质，促使尿结石的形成。
2、尿中溶质的沉淀。当预防尿中溶质沉淀的保护性胶体被破坏时，尿中大量矿物质盐类结晶发生沉淀，成为尿结石的实体，一般盐类结晶有碳酸盐、磷酸盐、硅酸盐、草酸盐和尿酸盐。它们以核心物质为基础，环绕、逐渐沉积形成结石。
3、导致尿石的因素。尿液中的理化性质发生改变，可成为尿结石形成的诱因。如尿液的ph值改变，可影响一些盐类的溶解度。尿液潴留或浓稠，因其中尿素分解产生氨，致使尿变为碱性，形成碳酸钙，磷酸铵和磷酸铵镁等沉淀。酸性尿也容易促使尿酸盐尿石的形成。尿中的柠檬酸盐的含量下降，易发生钙盐的沉淀，形成尿石。
总之，尿石形成的条件是，有结石核心物质的存在，尿中保护性胶体环境的破坏，尿中盐类结晶不断析出并沉积。
目前一般认为，尿石形成于肾脏，随尿液转移至膀胱，并在膀胱增大体积，常在输尿管和尿道形成阻塞。尿石形成后，于阻塞部位刺激尿路黏膜，引起黏膜损伤、炎症、出血，并使局部的敏感性增高，由于刺激，尿路平滑肌出现痉挛性收缩，因而病畜发生腹痛，频尿和尿痛现象。当结石阻塞尿路时，则出现尿闭，腹痛尤为明显，甚至可发生尿毒症和膀胱破裂。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明目的是提供一种预防舍饲绵羊尿结石复方中药组合物，降低绵羊尿结石的发病率。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种预防舍饲绵羊尿结石复方中药组合物，具有以下两种配方。
配方ⅰ，由以下重量份的原料组成：
金钱草50份，瞿麦25份，萹蓄25份，海金沙25份，车前子25份，滑石30份，栀子20份，泽泻30份，鸡内金20份，牛膝25份。
功效：清热泻火、利水通淋
主治：湿热下注引起的热淋、石淋
方解：本方用于湿热下注所致的淋症，湿热下注至膀胱，则水道不利甚至闭而不通。治宜清热通淋为主。方中金钱草清热消肿利水通淋、瞿麦清热利水、行血祛瘀为君药，辅以萹蓄、海金沙、车前子、滑石清热除湿、利水通淋。佐以栀子、泽泻、鸡内金清热泻火、保肝利胆健脾祛湿。牛膝清热活血化瘀、载药下行为使。诸药共用可达清热泻火、利水通淋之功。
配方ⅱ，由以下重量份的原料组成：
金钱草10份，瞿麦10份，萹蓄10份，海金沙10份，王不留行15份，元胡10份，鸡内金15份，丹参15份，木香10份，牛膝10份。
功效：清热泻火、利水通淋
主治：湿热下注引起的热淋、石淋
方解：本方用于湿热下注所致的淋症，湿热下注至膀胱，则水道不利甚至闭而不通，导致疼痛昏厥。治宜清热通淋为主。方中金钱草清热消肿利水通淋、瞿麦清热利水、行血祛瘀为君药，辅以萹蓄、海金沙清热除湿、利水通淋。佐以木香、元胡行气止痛、鸡内金运脾利水之功效、王不留行、丹参清热活血化瘀、牛膝载药下行为使。诸药共用可达清热泻火、利水通淋之功，用于治疗湿热内蕴之结石。
上述两种配方药物制备及使用方法如下：
药物按配方比例混合均匀，且直接与饲料搅拌均匀进行投喂。
投喂时期：舍饲育肥绵羊群体平均达到25公斤开始投喂，连续投喂15天。
投喂剂量：25g/只/天。
本发明主要研制筛选了预防尿结石发生的两组中药配方，并进行了预防试验，结果中药配方有效的保护修复了育肥绵羊的泌尿系统细胞结构，整体调节了血液、尿液中肌酐、尿素氮、钙，磷、镁的代谢减少了尿结石发生的几率。提高血液中超氧化物酶的活性，减少机体抗氧化损伤，发挥了中医中药的整体调节功能，促进了舍饲育肥绵羊快速健康的成长。在预防育肥绵羊尿结石发生的试验中中药配方组降低了绵羊尿结石的发病率6.7%。
附图说明
图1表示试验后随机选取羊只进行肾脏超微结构处理采样结果图。
图2表示试验后随机选取羊只进行膀胱超微结构处理采样结果图。
图3表示绵羊opn免疫印迹结果图。
图4表示肾脏免疫组化结果opn免疫组织化学染色结果图。
图5表示膀胱免疫组化结果opn免疫组织化学染色结果图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细说明。
本发明提供的预防舍饲绵羊尿结石复方中药组合物，具有以下两种配方。
配方ⅰ，由以下重量份的原料组成：
金钱草50份，瞿麦25份，萹蓄25份，海金沙25份，车前子25份，滑石30份，栀子20份，泽泻30份，鸡内金20份，牛膝25份。
配方ⅱ，由以下重量份的原料组成：
金钱草10份，瞿麦10份，萹蓄10份，海金沙10份，王不留行15份，元胡10份，鸡内金15份，丹参15份，木香10份，牛膝10份。
通过对绵羊尿结石的调研和查看相关资料，结合以往尿结石预防经验，课题组总结了预防尿结石的措施以及筛选出预防用中药，并进行了预防试验。
一、复方中药对育肥绵羊泌尿系统的保护修复效果
本试验根据育肥绵羊生理结构以及中兽医理论，选用金钱草、瞿麦、海金沙、扁蓄、车前子、牛膝等中药分别组成配方ⅰ和配方ⅱ。配方针对尿结石发生的机制进行预防，主要起到清热泻火、利水通淋、促进泌尿系统代谢的功效。试验将90只25公斤左右育肥羊随机分成3组，每组30只，包括对照组、配方ⅰ组（1组）、配方ⅱ组（2组），试验后每组随机选取3只羊进行肾脏和膀胱超微结构处理采样结果见图1、2。
如图1所示，图a对照组中细胞核严重变形，核膜大部分破裂，核内容物外泄。多数线粒体嵴断裂，双层膜破裂，线粒体空泡化严重。图b配方ⅰ组中细胞核变形，核膜部分破裂，核内容物外泄，少数线粒体肿胀，个别空泡化。图c配方ⅱ组中细胞核变形，核膜肿胀，多数线粒体完整，个别线粒体肿胀。
如图2所示，图a对照组中细胞核核膜破裂，核内容物外泄。多数线粒体嵴断裂，双层膜破裂，溶酶体增多。微绒毛脱落严重。图b配方ⅰ组中细胞核变形，核膜部分破裂，核仁溶解。少数线粒体肿胀，微绒毛脱落。图c配方ⅱ组中核膜肿胀，核仁完整。多数线粒体完整，个别线粒体肿胀，空泡化。微绒毛少部分脱落。
舍饲绵羊在育肥中后期，由于大量营养物质的摄入，极其容易造成营养代谢紊乱，造成肾脏、膀胱实质性损伤，影响肾脏、膀胱的正常功能。器官发生损伤时，细胞中各种物质均有不同程度的变化，其中线粒体是细胞中代谢的主要细胞器，其发生变化较明显。结果显示配方ⅱ和配方ⅰ两组绵羊的发病率以及肾脏、膀胱的细胞结构均优于对照组，两配方均能保护修复舍饲绵羊肾脏、膀胱的损伤。
二、复方中药对育肥绵羊日增重效果研究
绵羊日增重也是舍饲育肥主要经济指标，所以在预防疾病的同时必须把绵羊日增重作为一个衡量标准。本试验在利用中药保护修复泌尿系统和调节体内代谢的同时对绵羊育肥的日增重进行的测试，并对试验三组的发病率进行观察。试验结果见表1。
表1绵羊增重与发病率情况
注：同行数据标记字母相同表示差异不显著（p＞0.05），字母相邻表示差异显著（p＜0.05）字母相间表示差异极显著（p＜0.01）。
表1中对照组发病率为6.67%，配方ⅰ组和配方ⅱ组均为0。初始体重在三个组中差异不显著，结束体重差异也不显著。但总增重和平均日增重配方ⅰ组和配方ⅱ组差异不显著，而配方ⅰ组与对照组差异显著（p＜0.05），配方ⅱ组与对照组差异极显著（p＜0.01），配方ⅰ组与配方ⅱ组差异不显著。
本试验既对尿结石发生的进行预防，同时也有促生长的功效，减少该病发生，提高绵羊育肥经济效益。
三、复方中药对育肥绵羊血液、尿液调节效果
本试验根据育肥绵羊生理特点以及中兽医理论，选用金钱草、瞿麦、海金沙、扁蓄、车前子、牛膝等分别组成配方ⅰ和配方ⅱ。配方中金钱草、海金沙配伍使用，可以消石排石，利水通淋为君药；瞿麦、滑石、车前子、利尿通淋为臣药。方剂的药物代表之一金钱草，为报春花科植物过路黄的干燥全草，具有清热利湿、通淋、消肿之功效，是治疗尿路结石的常用中草药。试验动物由晋中市某养殖专业合作社提供，25公斤左右育肥羊90只随机分成3组，每组30只，包括对照组、配方ⅰ组、配方ⅱ组，试验结束后每组随机选择3只绵羊取样，剖杀前由颈静脉采血室温下静置分离血清置-20℃保存待测。剖杀后用注射针自膀胱抽取尿液，1000r·min-1离心10min，取8ml尿液上清，-20℃冻存备测。结果见表2。
表2各组绵羊血清指标
注：同行数据标记字母相同表示差异不显著（p＞0.05），字母相邻表示差异显著（p＜0.05）字母相间表示差异极显著（p＜0.01）。
由表2可知，血清中尿素氮、肌酐对照组极显著高于配方ⅰ组和配方ⅱ组（p＜0.01），两中药组差异不显著（p＞0.05），过氧化物酶对照组极显著低于配方ⅰ组合配方ⅱ组（p＜0.01），两中药组差异不显著（p＞0.05），钙、磷、镁三组含量差异都不显著（p＞0.05）。
表3各组绵羊尿液指标
注：同行数据标记字母相同表示差异不显著（p＞0.05），字母相邻表示差异显著（p＜0.05）字母相间表示差异极显著（p＜0.01）。
由表3可知，尿液中对照组尿素氮含量显著低于配方ⅰ组、配方ⅱ组（p＜0.05），两中药组差异不显著（p＞0.05）。虽然两中药组肌酐含量明显大于对照组但差异不显著（p＞0.05）。钙、镁三组中差异都不显著（p＞0.05）。对照组中的磷极显著高于两中药组（p＜0.01），两中药组差异不显著（p＞0.05）。对照组中ph值极显著高于两中药组（p＜0.01），两中药组差异不显著（p＞0.05）。
本试验中两中药配方组均降低了血液中肌酐、尿素氮的含量，同时促进了尿液中肌酐、尿素氮的排泄。草食动物吸收的磷主要是通过粪便排出，通过尿液排出量较少，本试验中药配方使得尿液中磷含量降低说明肾脏重吸收功能恢复，但血清无机磷与对照组无差异，推测多量的磷通过粪便排出体外。肾小管泌氢功能恢复降低了尿液ph值。综合因素使得磷酸盐结石的形成概率降低。研究中三试验组中钙、镁在血清和尿液中含量无差异，说明在肾虑过功能和重吸收受到损伤的一定时期内，血液中的钙、镁含量受到激素调节保持代谢平衡。
现代药理研究表明，金钱草化学成分主要为黄酮类化合物，并证实具有良好的抗氧化性能力。sod是机体内唯一能特异性清除超氧阴离子自由基的酶类，对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子，保护细胞免受损伤。本试验中两配方中药均已金钱草为君药，有效提高血清中sod活性，说明两中药配方能提高机体的抗氧化酶活性和抗氧化能力，可能对肾的损伤有一定的保护作用。
结论：两中药配方能明显保护和修复肾脏、膀胱的细胞结构；促进尿素氮、肌酐代谢产物的排泄；能提高机体的抗氧化酶活性，减轻机体的氧化损伤；同时通过降低尿液ph值和减少尿液磷的排泄防止磷酸盐结石的聚集，从而达到预防舍饲绵羊育肥阶段结石形成的效果。
四、复方中药对尿结石相关的骨桥蛋白（opn）表达的影响效果
为揭示中药对育肥绵羊尿结石在蛋白水平的影响，课题组在以上试验进行的同时，对绵羊肾脏的骨桥蛋白进行了蛋白表达试验以及对肾脏、膀胱进行了免疫组化试验。试验结果见图3、4、5。
如图3westernblot结果显示，绵羊肾脏总蛋白中存在能与兔抗opn多克隆抗体发生免疫阳性反应的蛋白条带。应用image-proplus6.0软件对绵羊opn免疫印迹结果进行分析，测定目的条带面积和灰度值，opn蛋白在绵羊肾脏组织中的平均蛋白对照组含量为2.8791±0.0239、配方ⅰ组为2.2356±0.0361，配方ⅱ组为2.1515±0.1322，三者比较，对照组与配方ⅰ组差异显著（p＜0.05），与配方ⅱ组差异显著（p＜0.05），两中药配方组差异不显著（p＞0.05）。
如图4肾脏免疫组化结果opn免疫组织化学染色结果显示，光镜下可见对照组肾小管上皮细胞表达opn，主要定位于胞质，呈棕褐色。对照组表达明显增多，色较深，平均吸光度为(0.0291±0.0090)；配方ⅰ组、ⅱ组肾小管上皮细胞表达较少，色较浅，平均吸光度为(0.01474±0.0032、0.01523±0.0074)。两中药组间差异不显著（p＞0.05），对照组与两中药组差异都显著（p＜0.05）。
如图5中膀胱免疫组化结果opn免疫组织化学染色结果显示，光镜下可见对照组膀胱移行上皮细胞表达opn，以及平滑肌少量表达，主要定位于细胞胞质，呈棕褐色。对照组表达明显增多，色较深，平均吸光度为(0.0392±0.0150)；配方ⅰ组、ⅱ组表达较少，色较浅，平均吸光度为(0.02934±0.0157、0.02729±0.0126)。两中药组间差异不显著（p＞0.05），对照组与两中药组差异都显著（p＜0.05）。
五、中药安全性试验
急性毒性试验：将70只昆明小白鼠随机分为：0.4ml/10g、0.3ml/10g、0.2ml/10g，两中药配方分别分成三个剂量组，每组10只，均为雌雄各半。采用改进karber法，以半数致死量（ld50）作为评价急性毒性程度指标，研究中药两配方急性毒性作用。经口服给药后连续观察7天。
亚急性毒性试验：试验将140只wistar大鼠，随机分为0.4ml/10g、0.3ml/10g、0.2ml/10g，两中药配方分别分成三个剂量组和一个1000毫克口服淀粉蒸水混悬液对照组，每组20只，共连续经口灌药28天。观察测定各组大鼠的临床症状、体重变化，并进行剖解观察大鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器组织变化。
试验结果显示：
急性毒性试验：经口服给药后连续观察7天，结果为各中药组小白鼠给药后饮食、饮水、活力、排便等各项指标均与对照组一样表现正常，试验中所有小白鼠都没有死亡，并且生长良好，呼吸、活动正常，饮水、饮食和排便均为正常，口、鼻、眼均无异常分泌物。每组随机剖解2只，共计8只小白鼠进行观察，未见各脏器有任何病理变化。
亚急性毒性试验：连续经口灌药28天。观察测定各组大鼠的临床症状、体重变化），并进行剖解观察大鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器组织变化。结果（见表4、表5）：试验组和对照组大鼠的生长良好，呼吸、活动正常，饮水、饮食和排便均为正常，口、鼻、眼均无异常分泌物；各组大鼠无发病和死亡发生；各组大鼠的平均采食量和饮水量均无显著差异（p＞0.05）；平均增重差异也不显著（p＞0.05）。剖解结果，心、肝、脾、肺、肾的重量，各组均差异不显著（p＞0.05）。眼观各脏器均无充、出血斑点；色泽、形态均为正常，未见各脏器有任何病理变化见表6、7。本试验用药均为天然中草药组成，具有和动物同源、同根、同食作用。
表4配方1组三个剂量临床表现及增重情况
注：1、采食量测定方法为：每天对各组大鼠饲料称重喂给，在第二天饲喂前要将各组大鼠饲槽内剩余饲料清扫称重，并在前一天饲料总量中扣除，计算前一天采食量。
2、饮水量测定方法为：每天对各组加水量进行称重，在第二天加水前要将各组大鼠饲槽内剩余水量吸出称重，并在前一天加水总量中扣除，计算前一天饮水量。
3、精神状态为全程观察记录总体分析结果。
表5配方2组三个剂量临床表现及增重情况
表6配方ⅰ组剖解各脏器变化
注：眼观指标：主要观察大白鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器表面是否光滑、有无充血、出血斑点；形态是否正常、有无肿大、结节或凹陷突起；切开后是否有质地过硬或过软、有无充血、出血斑点或结节突起等异常情况。
表7配方ⅱ组剖解各脏器变化
通过配方制剂的急性毒性试验和亚急性毒性试验研究，表明两中药配方使用安全，无毒副作用。
申请人采用本发明配方分别在太原小店、娄烦、阳曲，朔州右玉以及长治武乡等5个大型育肥羊场进行了推广应用，合计推广11.8万只绵羊，新增经济效益616.8万元。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。