本发明属于兽药技术领域，具体涉及一种兽用硫酸庆大霉素-盐酸林可霉素复方缓释注射液及其制备方法。
背景技术：
猪呼吸道疾病是一种多因素引起的呼吸道疾病的总称，由原发性病原和继发性病原混合引起。目前，在猪场中，真正引起感染的单一病原病例只占9%，而91%的猪呼吸道疾病病例都是由两个病原以上引起的混合感染，以蓝耳病病毒、圆环病毒、副猪嗜血杆菌、链球菌的复合感染率最高，而由猪链球菌、副猪嗜血杆菌等导致的继发性感染，致死率高，危害严重，而单独的原发性感染，致死率不高，相对危害性不大，如：猪支原体感染造成的猪气喘病不会引起猪的死亡，但属于慢性消耗性疾病，致使猪的饲料转化率降低，生长性能差；又如:猪继发感染7型猪链球菌后，可以增强蓝耳病病毒的致病力，导致病猪病情进一步恶化，最终使病猪死亡；猪单独感染圆环病毒发病的病死率较低，但继发感染副猪嗜血杆菌后致死率可达80%以上。所以防治猪呼吸道疾病的首要任务是解决由革兰氏阳性菌猪链球菌、革兰氏阴性菌副猪嗜血杆菌引起的继发感染问题。
目前，对于猪呼吸道疾病的防治一般采用疫苗预防、抗菌药物加对症治疗的方法，如：抗菌药物加退烧药物、抗菌药物加平喘类药物等。然而这种治疗方法只是治标不治本，治疗没有针对性，不能有效抑制或杀灭革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及猪支原体引起的混合感染。虽然，针对发病的原因，也有人采用不同抗菌药物抑制或杀灭革兰氏阳性菌猪链球菌、革兰氏阴性菌副猪嗜血杆菌和猪支原体，例如：支原净、氟苯尼考、泰乐菌素、黄芪多糖等联合应用，然而这种单方-单方药物的联合应用存在药物之间的配伍是否合理及毒副作用等问题。
林可霉素可作用于病原菌的核糖体50s亚基，阻止肽链的延长，从而抑制细菌细胞的蛋白质合成，不仅对原发性病原-支原体有较强的杀灭作用，而且对继发性病原中的革兰氏阳性菌，如猪链球菌也有较强的杀灭作用，同时，庆大霉素作为氨基糖苷类抗生素，可与细菌核糖体30s亚单位结合，抑制细菌蛋白质的合成，并间接导致细菌细胞膜、细胞壁的缺损，对继发性病原中的革兰氏阴性菌，如副猪嗜血杆菌具有较强的杀灭作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种兽用硫酸庆大霉素-盐酸林可霉素复方缓释注射液及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种兽用硫酸庆大霉素-盐酸林可霉素复方缓释注射液，每100g注射液由以下组分组成：
硫酸庆大霉素0.1~30g、盐酸林可霉素0.1~20g、缓释载体0.01~5g、稳定剂0~20g、止痛剂0~3g、有机溶媒20~30g，余量为注射用水；
其中，所述缓释载体为羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、明胶、阿拉伯胶中的一种或两种以上的组合；所述有机溶媒为1,2-丙二醇、甘油、无水乙醇中的一种或两种以上的组合。
较好地，所述缓释载体为纤维素类载体和胶类载体两种载体的组合，且纤维素类载体和胶类载体的质量配比为2∶1；其中，纤维素类载体为羧甲基纤维素钠和/或羟丙基甲基纤维素，胶类载体为明胶和/阿拉伯胶。
较好地，所述稳定剂为聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600中的一种或两种以上的组合。
较好地，所述止痛剂为苯甲醇。
制备方法，包括如下步骤：
（1）将稳定剂加入部分注射用水中，搅拌溶解；随后在体系中加入两种主药硫酸庆大霉素和盐酸林可霉素，搅拌溶解至澄清透明，获得体系a；
（2）将缓释载体加入体系a中，搅拌至完全溶解，获得体系b；
（3）将止痛剂溶解于有机溶媒中，获得体系c；
（4）将体系c与体系b混匀后，注射用水定容至100g，即得兽用硫酸庆大霉素-盐酸林可霉素复方缓释注射液。
本发明制备的兽用硫酸庆大霉素-盐酸林可霉素复方缓释注射液具有缓释功能，本发明通过微型包囊技术，使药物溶解在载体中，形成骨架型微小球状实体，延缓药物在体内释放的速度，延长作用时间，减少动物应激性，增加顺应性。并且因具有缓释作用，药物释放慢，可以降低因剂量过大引起的庆大霉素的肾毒性作用。两种药物联合应用，对于革兰氏阳性菌及阴性菌引起的猪呼吸道疾病有良好的治疗效果，具有广阔的市场前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例1-10
一种兽用硫酸庆大霉素-盐酸林可霉素复方缓释注射液，每100g注射液的组方见表1。
对比例1-3
实施例1-10及对比例1-3产品的制备方法，包括如下步骤：
（1）、将稳定剂加入部分注射用水中，搅拌溶解；随后在体系中加入两种主药硫酸庆大霉素和盐酸林可霉素，搅拌溶解至澄清透明，获得体系a；
（2）、将缓释载体加入体系a中，搅拌至完全溶解，获得体系b（当缓释载体添加量为0时，省略此步骤）；
（3）、将止痛剂溶解于有机溶媒中，获得体系c；
（4）、将体系c与体系b（当缓释载体添加量为0时，此处为体系a）混匀后，注射用水定容至100g，即得对应的产品。
外观观察
实施例1-10所得兽用硫酸庆大霉素-盐酸林可霉素复方缓释注射液的外观为微黄色至微黄绿色的澄明液体。
稳定性试验
取实施例1-10所得兽用硫酸庆大霉素-盐酸林可霉素复方缓释注射液分别进行经时稳定性试验、加速稳定性试验、抗冷冻稳定性试验，观察本发明注射液的稳定性，确认是否有变色、析出等不稳定现象出现。
1、经时试验
取实施例1-10所得注射液在室温自然变化条件下储藏6个月，观察结果表明：实施例1-10所得注射液外观如初，无变色、析出等情况发生，含量复检合格，说明经时稳定性良好。
2、加速试验
将实施例1-10所得注射液分装于聚酯瓶中，密封之后置于温度40℃、相对湿度70%的加速箱中贮存90d，每隔30d取样观察，并对含量复检。结果表明：实施例1-10所得注射液在热贮后所有时间点，外观均如初，且无变色、析出等情况发生，说明热贮稳定性良好。
3、抗冷冻稳定性
将实施例1-10所得注射液在冰箱中-20℃保存一周后，恢复至室温观察。结果表明：实施例1-10所得注射液外观如初，无变色、析出等情况发生，含量复检合格，表明抗冷冻性良好。
联合药敏试验
以实施例1所得兽用硫酸庆大霉素-盐酸林可霉素复方缓释注射液为样品进行以下联合药敏试验。
首先，采用微量肉汤稀释法分别测定盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素对29株猪链球菌（由哈尔滨兽医研究所提供）分离株、16株副猪嗜血杆菌（由哈尔滨兽医研究所提供）分离株的最小抑菌浓度（mic）。然后，应用棋盘微量稀释法测定两药联用后对29株猪链球菌分离株、16株副猪嗜血杆菌分离株的抗菌效果，探讨盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素对猪链球菌、副猪嗜血杆菌的体外联合抗菌作用。
1、最小抑菌浓度（mic）测定
采用微量肉汤稀释法，分别测定盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素对29株猪链球菌、16株副猪嗜血杆菌的mic值。
（1）、将猪链球菌分离株接种于含5%（体积百分数）牛血清的脑心浸液琼脂培养基中，副猪嗜血杆菌接种于含0.1%（质量体积百分数，g∶ml）nad的胰酪胨大豆肉汤培养基中，37℃孵育过夜；调整菌液浊度0.5麦氏单位即1.5×108cfu/ml，然后将菌液用灭菌生理盐水作1∶1000体积倍稀释。
（2）、取无菌96孔微孔板，加入上述猪链球菌或副猪嗜血杆菌稀释液，除第1孔加180µl外，第2~24孔均加100µl；继之于第1孔加入抗生素原液20µl，充分混合后吸出100µl加入第2孔中，同法系列二倍稀释至第23孔，充分混合后吸出100µl丢弃；第24孔不含抗生素，为细菌阳性对照孔。混匀后盖好，于37℃孵育18~24h。
第1孔加入的抗生素原液为用注射用水配制的对应的单一待测定药物的水溶液，浓度为盐酸林可霉素原液：40000µg/ml，硫酸庆大霉素原液：4000µg/ml。
（3）、以肉眼观察，猪链球菌和副猪嗜血杆菌组药物最小浓度孔无细菌生长者（细菌生长完全抑制），即为受试菌的mic。读取菌株的mic前，应检查细菌阳性对照孔的细菌生长情况是否良好。
药敏结果参照美国临床实验室标准（clsi/nccls，2005）中链球菌的突变点（breakpoint）进行判断，最小抑菌浓度mic值突变点判定标准：林可霉素，敏感（s）≤0.5µg/ml，中介（i）1-2µg/ml，耐药（r）≥4µg/ml；庆大霉素，敏感（s）≤4µg/ml，中介（i）8μg/ml，耐药（r）≥16µg/ml。庆大霉素对肠杆菌科的fda临界值为：敏感（s）≤4μg/ml，中介（i）8µg/ml，耐药（r）≥16µg/ml。
2、棋盘微量稀释法联合药敏
根据测得的每株菌的单药mic值，确定联合药敏的药物浓度。两药分别用菌稀释液（同单药药敏测定，菌液浊度约1.5×105cfu/ml）进行倍比稀释：2mic、mic、1/2mic、1/4mic、1/8mic，各取50μl，交叉组合于96孔微孔板中（如表3），使微孔板的每一列中加入相同浓度的硫酸庆大霉素，盐酸林可霉素浓度则依次为2mic、mic、1/2mic、1/4mic、1/8mic；在微孔板的每一行中，盐酸林可霉素浓度相同，硫酸庆大霉素浓度依次为2mic、mic、1/2mic、1/4mic、1/8mic。混合均匀并盖好，于37℃孵育24h。细菌生长指标同单药药敏试验，无菌生长的最低药物浓度为联用时的mic。
通过计算获取抑菌浓度指数（fractionalinhibitoryconcentration，fic），判断联合用药的相互作用。判断标准为：fic＝联合用药时盐酸林可霉素的mic/单独应用时盐酸林可霉素mic＋联合应用时硫酸庆大霉素的mic/单独应用时硫酸庆大霉素mic，fic指数≤0.5，为协同作用；0.5<fic≤1，为相加作用；1<fic≤2.0，为无关作用；fic>2.0，为拮抗作用。
3、试验结果
两药单用及联合应用对29株猪链球菌的试验结果见表4-5，显示：盐酸林可霉素单用时的mic50、mic90分别为8μg/ml和256μg/ml，联用后分别为4μg/ml和128μg/ml；硫酸庆大霉素单用时的mic50、mic90分别为16μg/ml和128μg/ml，联用后分别为4μg/ml和64μg/ml。联用后除8株猪链球菌的fic>1，即联合对此8株菌显示无关或拮抗作用（占27.58%）外，其余菌株mic均有不同程度的降低，其fic指数≤1，即合用对其余的21株猪链球菌（占72.42%）为相加或协同作用。
两药单用及联合应用对16株副猪嗜血杆菌的试验结果见表6-7，显示：盐酸林可霉素单用时的mic50、mic90分别为8μg/ml和16μg/ml，联用后分别为4μg/ml和250μg/ml；硫酸庆大霉素单用时的mic50、mic90分别为0.8μg/ml和4μg/ml，联用后分别为0.4μg/ml和50μg/ml。联用后除1副猪嗜血杆菌的fic>1，即联合对此1株菌显示无关或拮抗作用（占6.25%）外，其余菌株mic均有不同程度的降低，其fic指数≤1，即合用对其余的15株副猪嗜血杆菌（占93.75%）为相加或协同作用。
结论：盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素两者联用后对29株猪链球菌分离株、16株副猪嗜血杆菌分离株的mic比单用均有不同程度的降低，其中72.42%的猪链球菌分离株和93.75%的副猪嗜血杆菌fic≤1，表现为相加或协同作用。所以对治疗猪链球菌、副猪嗜血杆菌感染，采用盐酸林可霉素与硫酸庆大霉素联合用药方案，可提高体外的抗菌效果。
采用此试验方法，对其他实施例制得的硫酸庆大霉素盐酸林可霉素注射液为样品进行联合药敏的试验。
结果均表明：硫酸庆大霉素盐酸林可霉素不同比例的处方制备的产品，联合用药后可提高体外的抗菌效果。
溶血性试验
以实施例1所得兽用硫酸庆大霉素-盐酸林可霉素复方缓释注射液为受试物进行溶血性试验。
试验动物：新西兰白兔，体重2.8~3.0kg，由哈尔滨南岗区兴旺养殖场提供。
取新鲜兔血10ml，置三角烧瓶中，除去纤维蛋白原，制成脱纤血液，加入生理盐水约10体积倍量，摇匀，1000-1500r/min离心15min，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水按上述方法洗涤2-3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用生理盐水配成2wt%的红细胞混悬液，供试验用。
取洁净试管7只，进行编号，1-5号管为供试品管，6号管为阴性对照管，7号管为阳性对照管，按表8所示依次加入2wt%的红细胞悬液、生理盐水或蒸馏水、受试物，混匀后，立即置37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育，开始每隔15min观察1次，1h后，每隔1h观察1次，观察3h。
若试验中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；如红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，表明无溶血发生；若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生。
所有时间点观察结果：1~6号管上层溶液呈无色透明，红细胞下沉，表明无溶血反应，并且下沉的红细胞经振摇很快分散，无棕色或红棕色絮状沉淀，表明无凝血反应发生；7号阳性对照管有溶血产生。结果表明：本发明制备的兽用硫酸庆大霉素-盐酸林可霉素复方缓释注射液0.1~0.5ml在3h内对兔红细胞不产生溶血和凝聚作用。因此，根据以上结果可以判定该注射液安全。
皮肤刺激性试验
以实施例1所得兽用硫酸庆大霉素-盐酸林可霉素复方缓释注射液为受试物进行皮肤刺激性试验。
取4只家兔，雌雄各半。每只动物分笼饲养；给药前24h，动物脊椎两侧对称部位进行脱毛，脱毛区面积为4cm×6cm，试验采用同体左右侧自身对比；左侧脱毛区涂受试物0.5ml/次，右侧脱毛区涂空白基质（生理盐水）0.5ml/次，并用无刺激纱布及胶布加以固定，24h后用温水除去残留的受试物；涂药后1h、24h、48h、72h，肉眼观察并记录涂抹部位变化情况，如有无红斑和水肿等。按照皮肤刺激反应评分标准（表9）进行评分，然后再按皮肤刺激强度评价标准（表10）进行评价。
试验结果：停药后1h、24h、48h、72h，本发明制备的兽用硫酸庆大霉素-盐酸林可霉素复方缓释注射液对家兔完整皮肤所有时间点反应积分的平均值为0，由皮肤刺激强度评价标准可知本发明制备的兽用硫酸庆大霉素-盐酸林可霉素复方缓释注射液对皮肤无刺激。同时，病理组织学观察结果，结果为停药后1h、24h、48h、72h组织学观察均未见异常。
缓释制剂与普通制剂效果比较
为比较本发明制备的兽用硫酸庆大霉素-盐酸林可霉素复方缓释注射液与这两种主药组成的普通注射液之间的效果差异，开展以下对比试验。
试验动物：选择猪呼吸道疾病的自然发病病例。
试验药品：实施例1、对比例1-3产品。
试验分组：选取自然发病病例180头，随机分为6组，每组30头，其中五组治疗组，一组对照组，分组情况见表11。
仔细观察并记录给药前、给药后和停药后各组试验猪出现的临床症状，主要包括：咳嗽、呼吸频率、鼻腔分泌物等。同时记录各组试验猪症状的发生、发展、转归和消失情况，最终利用定量指标对其进行评估，具体打分原则如表12。
临床疗效判定：临床上通过死亡率、有效率和治愈率三个指标评定药物的疗效；有效率是指上述临床症状部分消失的试验猪的数量占试验猪总数的比例；治愈率是指上述临床症状全部消失的试验猪的数量占试验猪总数的比例；死亡率是指发生死亡的试验猪的数量占试验猪总数的比例。详细记录给药后各组试验猪的死亡数和死亡时间，症状好转试验猪的数量以及症状消失试验猪的数量，最终计算各组试验猪的死亡率、有效率和治愈率。
试验结果：本试验通过死亡率、有效率和治愈率三个指标评价各组的临床疗效，各组的具体情况如表13所示。
如表13所示：不给药对照组死亡率高达60%，对养殖户造成很大的经济损失；连续给药一天的复方普通组1与连续给药三天的复方普通组2及给药一天的缓释组比较，有效率和治愈率均较低；而连续给药三天的复方普通组2与只给药一天的缓释组比较，有效率与治愈率差异性不显著，与不给药对照组比较，显著提高。对照缓释组1或2与复方普通组1比较，效果稍优于后者，但因缓释载体配比发生改变，缓释效果远不如缓释组。
以上试验结果表明，本发明的兽用硫酸庆大霉素-盐酸林可霉素复方缓释注射液给药一次效果相当于复方普通制剂连续给药三次的效果，具有非常明显的缓释效果。这对于临床实际应用中，可以大大降低用药成本，减轻动物应激疼痛反应，养殖户用药方便快捷。本发明具有缓释作用的复方制剂治疗猪呼吸道疾病具有非常好的应用前景。