本发明涉及生物技术和生物医药领域，特别涉及一种治疗关节软骨损伤的细胞凝胶制剂及其用途和所用的保持冻存细胞活性的凝胶溶液。
背景技术：
关节软骨缺损目前在我国临床十分常见，据统计在我国每年新增的软骨损伤病人将近一千万。由于关节软骨表面组织无神经、无血管及无淋巴回流，故损伤的软骨组织难以自我修复。目前临床上用于修复关节软骨损伤方法有：关节融合、关节清理术、关节切除成型术、人工关节置换术、自体或异体软骨移植术、基质诱导的自体软骨细胞移植术，以及基因疗法和干细胞疗法等。该方法虽然能暂时缓解疼痛，但远期疗效并不理想，其中手术修复软骨方式无法完全替代具有完整生物活性功能的软骨组织，严重的会导致关节功能丧失。
透明质酸(ha)是动物体内的酸性粘多糖，因具有良好的生物相容性、生物降解性，保护关节软骨，减轻或消除关节疼痛、抑制关节软骨退变特性，可用于研究可注射性组织工程软骨的构建，并已被fda批准用于临床。
壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰作用而来，具有良好的生物相容性、生物可降解吸收性、亲水性及无免疫原性。同时，由葡萄糖胺和n-乙酰氨基葡萄糖组成的壳聚糖在结构上类似于葡糖氨基葡聚糖，存在于软骨组织的胞外基质中。基于壳聚糖的水凝胶具有维持细胞活性，对细胞具有保护和支持作用，软骨组织的保护剂，使其成为软骨修复的理想选择。
胶原作为关节软骨主要的组成部分，是由多种氨基酸组成的聚合物。具有良好生物相容性、降解性、吸水保水性，在体内被完全降解吸收，对人体无毒无抗原。同时，胶原蛋白的网状结构是关节软骨的框架，能抑制软骨退变，减少骨于骨之间的摩擦，因此胶原是一种理想的软骨损伤修复材料。
硫酸软骨素作为软骨的组成成分，它对维持细胞环境的相对稳定和正常生理功能起到重要作用，并有抗炎、加速伤口愈合和抗肿瘤等方面的作用。更为重要的是硫酸软骨素可作为输送管道，把氧气和营养输送至关节处，同时把二氧化碳和废物加以排除，从而促进软骨再生的功效。此外，硫酸软骨素的加入有助于软骨细胞的纤维链接蛋白表达增加，该蛋白一般出现于软骨形成的早期阶段和成熟关节软骨内。
间充质干细胞(mscs)因具有强大的自我更新、增殖能力及分化潜能、低免疫原性、组织相容性好、释放分泌因子等优点而备受关注。同时在扩增过程中可保留其干细胞特性，促进软骨细胞的分化。这些特点使mscs逐渐成为修复软骨缺损的理想种子细胞。
软骨细胞是关节软骨的重要组成部分，通过分泌一些细胞和生长因子来对关节软骨组织进行调控，并且该细胞在软骨新陈代谢过程中发挥着重要的作用。与此同时，自体软骨细胞移植术是目前临床上治疗关节软骨损伤的主要途径。
目前，韩国已经批准用于治疗关节软骨损伤的间充质干细胞药物
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供了一种治疗关节软骨损伤的细胞凝胶制剂及其用途和所用的保持冻存细胞活性的凝胶溶液，可以在使用前完成包括无菌在内的所有质量检测，解冻后可以立即使用，使用简便。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案：一种保持冻存细胞活性的凝胶溶液，包括下述质量与体积组分：高分子材料稳定剂1～50mg，硫酸软骨素0.1～1mg，人血白蛋白5～50mg，丙三醇30～150ul，dmso1～30ul,复方电解质注射液或氨基酸注射液或生理盐水注射液700～900ul。
所述高分子材料稳定剂为透明质酸钠、壳聚糖、胶原中的一种或几种的组合。
所述高分子材料稳定剂、硫酸软骨素、dmso、丙三醇、人血白蛋白、复方电解质注射液、氨基酸注射液、生理盐水注射液都是药用级原辅料，其中生理盐水注射液质量百分比浓度为浓度0.9％。
一种含有上述保持冻存细胞活性的凝胶溶液的治疗关节软骨损伤的细胞凝胶制剂，其特征在于，按体积百分比，凝胶溶液为50％～95％，复方电解质细胞重悬液为5％～50％，每毫升细胞凝胶制剂中含有0.5×105～2×107个细胞。
所述细胞为间充质干细胞和软骨细胞中的一种或两种的混合。
所述间充质干细胞来源于骨髓、脐带、脐血、胎盘、羊膜或脂肪组织。
上述细胞凝胶制剂在制备治疗关节软骨损伤药物中的应用。
所述关节软骨损伤包括创伤性关节炎、退行性骨关节炎、类风湿性关节炎、肌腱修复术、半月板置换术。
本发明的有益效果是：该凝胶制剂生物相容性好，能直接进行低温长期保存且维持较高的细胞活性(-80℃)，制备操作简便，在-20℃储存7天能维持细胞的活性80％以上，不需要传统的液氮冻存，复苏后的细胞凝胶制剂仍能够维持细胞的生物学特性、功能及其在关节腔内存活率高。可以用于关节软骨损伤的治疗应用。
附图说明
图1是本发明脐带间充质干细胞在透明质酸钠/胶原蛋白/硫酸软骨素(1:1:0.1)凝胶中的活率检测图
图2是本发明脐带间充质干细胞在透明质酸钠/胶原蛋白/硫酸软骨素(48:2:1)凝胶中的活率检测图。
图3是本发明软骨细胞在壳聚糖/硫酸软骨素(1:0.1)凝胶中的活率检测图。
图4是本发明软骨细胞在壳聚糖/硫酸软骨素(50:1)凝胶中的活率检测图。
图5是本发明长期冻存后，透明质酸钠/胶原蛋白/硫酸软骨素(25:25:1)凝胶制剂中软骨细胞的活率曲线图(18个月)
图6是本发明长期冻存后，壳聚糖/胶原蛋白/硫酸软骨素(48:2:1)凝胶制剂中脐带间充质干细胞的活率曲线图(18个月)
图7是含有脐带间充质干细胞的透明质酸钠/胶原蛋白/硫酸软骨素(25:25:1)凝胶制剂对新西兰兔软骨缺损的治疗作用图。
图8是含有脐带间充质干细胞的透明质酸钠/胶原蛋白/硫酸软骨素(25:25:1)凝胶制剂对大鼠骨关节炎的治疗作用图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方案对本发明进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。
本发明的一种保持冻存细胞活性的凝胶溶液，包括下述质量与体积组分：高分子材料稳定剂1～50mg，硫酸软骨素0.1～1mg，人血白蛋白5～50mg，丙三醇30～150ul，dmso1～30ul,复方电解质注射液或氨基酸注射液或生理盐水注射液700～900ul。
所述高分子材料稳定剂为透明质酸钠、壳聚糖、胶原中的一种或几种的组合。
所述高分子材料稳定剂、硫酸软骨素、dmso、丙三醇、人血白蛋白、复方电解质注射液、氨基酸注射液、生理盐水注射液都是药用级原辅料，其中生理盐水注射液质量百分比浓度为浓度0.9％。
一种含有上述保持冻存细胞活性的凝胶溶液的治疗关节软骨损伤的细胞凝胶制剂，其特征在于，按体积百分比，凝胶溶液为50％～95％，复方电解质细胞重悬液为5％～50％，每毫升细胞凝胶制剂中含有0.5×105～2×107个细胞。
所述细胞为间充质干细胞和软骨细胞中的一种或两种的混合。
所述间充质干细胞来源于骨髓、脐带、脐血、胎盘、羊膜或脂肪组织。
上述细胞凝胶制剂在制备治疗关节软骨损伤药物中的应用。
所述关节软骨损伤包括创伤性关节炎、退行性骨关节炎、类风湿性关节炎、肌腱修复术、半月板置换术。
具体地说，所述细胞即间充质干细胞和/或软骨细胞都需经过组织分离与培养，再经传代获得。
所述含有间充质干细胞和/或软骨细胞的用凝胶制剂的制备方法，具体步骤如下：
①凝胶溶液的制备：
按照上述提供配比，将注射级或药用级原辅料，丙三醇，人血白蛋白，dmso，硫酸软骨素，溶于复方电解质注射液和/或氨基酸注射液、生理盐水注射液补足，经充分搅拌混匀、待用。
②获得性细胞：
从细胞库中选取所需细胞，使用含有10％胎牛血清的dmem培养基作为完全培养基，细胞于37℃、5％co2的条件下进行培养，待细胞生长到85％左右时，用磷酸盐缓冲液清洗细胞，0.25％胰蛋白酶进行消化，然后用完全培养基中止其消化，获得的细胞悬液进行1500×g,5min离心,弃上清，再用100～300ul复方电解质注射液对细胞进行重悬，调整细胞浓度至5×105～6×107个/毫升备用。
③细胞凝胶制剂的制备：
将已制备的细胞悬液注入到含有凝胶溶液的预充注射器中，充分混合均匀，直接冻存于-80℃冰箱中待用。
实施例1：脐带间充质干细胞在透明质酸钠/胶原蛋白/硫酸软骨素(1:1:0.1)凝胶中的活率检测
将无菌透明质酸钠(10mg)、胶原蛋白(10mg)及硫酸软骨素(1mg)组合成共混粉末溶于8.49ml磷酸盐溶液中，室温溶胀24小时后，再加入1.5ml丙三醇，50mg人血白蛋白，10uldmso,充分搅拌混匀,配制成的高分子材料凝胶溶液。静置后待用，取900ul凝胶溶液加入100ul含有5×105/cells脐带间充质干细胞的复方电解质重悬液，混合均匀，制成透明质酸钠/硫酸软骨素/胶原蛋白凝胶制剂。直接冻存于-80℃冰箱中，0，7，15天后，各组各取3支进行细胞活率检测。由实验结果可见，该凝胶制剂具有良好的细胞相容性，即维持脐带间充质干细胞的活性(图1)
实施例2：脐带间充质干细胞在透明质酸钠/胶原蛋白/硫酸软骨素凝胶(48:2:1)中的活率检测
将无菌透明质酸钠(480mg)、胶原蛋白(20mg)及硫酸软骨素(10mg)组合成共混粉末溶于9.4ml氨基酸注射液中，室温溶胀24小时后，再加入300ul丙三醇，5mg人血白蛋白，300uldmso,充分搅拌混匀,配制成的高分子材料凝胶溶液。静置后待用，取900ul凝胶溶液加入100ul含有5×105/cells脐带间充质干细胞的复方电解质重悬液，混合均匀，制成透明质酸钠/胶原蛋白/硫酸软骨素凝胶制剂。直接冻存于-80℃冰箱中，0，7，15天后，各组各取3支进行细胞活率检测。由实验结果可见，该凝胶制剂具有良好的细胞相容性，即维持脐带间充质干细胞的活性(图2)
实施例3：软骨细胞在壳聚糖/硫酸软骨素(1:0.1)凝胶中的活率检测
将无菌壳聚糖(10mg)与硫酸软骨素(1mg)组合成共混粉末溶于8.49m生理盐水注射液中(生理盐水注射液质量百分比浓度为浓度0.9％)，室温溶胀24小时后，再加入1.5ml丙三醇，50mg人血白蛋白，10uldmso,充分搅拌混匀,配制成的高分子材料凝胶溶液。静置后待用，取700ml凝胶溶液加入300ul含有2×107/cells软骨细胞的复方电解质重悬液，混合均匀，制成壳聚糖/硫酸软骨素凝胶制剂。直接冻存于-80℃冰箱中，0，7，15天后，各组各取3支进行细胞活率检测。由实验结果可见，该凝胶制剂具有良好的细胞相容性，即维持软骨细胞的活性(图3)
实施例4：软骨细胞在壳聚糖/硫酸软骨素(50:1)凝胶中的活率检测
将无菌壳聚糖(500mg)与硫酸软骨素(10mg)组合成共混粉末溶于9.4ml磷酸盐溶液中，室温溶胀24小时后，再加入300ul丙三醇，5mg人血白蛋白，300uldmso,充分搅拌混匀,配制成的高分子材料凝胶溶液。静置后待用，取700ul凝胶溶液加入300ul含有2×107/cells软骨细胞的复方电解质重悬液，混合均匀，制成壳聚糖/硫酸软骨素凝胶制剂。直接冻存于-80℃冰箱中，0，7，15天后，各组各取3支进行细胞活率检测。由实验结果可见，该凝胶制剂具有良好的细胞相容性，即维持软骨细胞的活性(图4)
实施例5：长期冻存后，透明质酸钠/胶原蛋白/硫酸软骨素(25:25:1)凝胶制剂中软骨细胞的活率(18个月)
将无菌透明质酸钠(1.25g)、胶原蛋白(1.25g)及硫酸软骨素(50mg)组合成共混粉末溶于42.45ml磷酸盐溶液中，室温溶胀24小时后，再加入7.5ml丙三醇，2.5g人血白蛋白，50uldmso,充分搅拌混匀,配制成的高分子材料凝胶溶液。静置后待用，取800ul凝胶溶液加入200ul含有1×107/cells软骨细胞的复方电解质重悬液，混合均匀，制成透明质酸钠/胶原蛋白/硫酸软骨素凝胶制剂。第0，1，3，6，15，18个月，各取3支进行细胞活率检测，并检测其表型与分化能力。由实验结果得出，该凝胶制剂负载的软骨细胞均可以在-80℃长期保存至18个月，具有良好的稳定性(图5)。
实施例6：长期冻存后，壳聚糖/胶原蛋白/硫酸软骨素(48:2:1)凝胶制剂中脐带间充质干细胞的活率(18个月)
将无菌壳聚糖(2.4g)、胶原蛋白(100mg)及硫酸软骨素(50mg)组合成共混粉末溶于47ml磷酸盐溶液中，室温溶胀24小时后，再加入1.5ml丙三醇，250mg人血白蛋白，1.5mldmso,充分搅拌混匀,配制成的高分子材料凝胶溶液。静置后待用，取800ul凝胶溶液加入200ul含有1×107/cells脐带间充质干细胞细胞的复方电解质重悬液，混合均匀，制成壳聚糖/胶原蛋白/硫酸软骨素凝胶制剂。第0，1，3，6，15，18个月，取3支进行细胞活率检测，并检测其表型与分化能力。由实验结果得出，该凝胶制剂负载的脐带间充质干细胞均可以在-80℃长期保存至18个月，具有良好的稳定性(图6)。
实施例7：含有脐带间充质干细胞的透明质酸钠/胶原蛋白/硫酸软骨素(25:25:1)凝胶制剂对新西兰兔软骨缺损的治疗作用
取40只健康的新西兰白兔，雌雄不限，体重(2.0～2.5kg)，随机分4组(每组各10只)即：阳性对照组－生理盐水组(处理后)、阴性对照组－未处理组、治疗组-1：脐带间充质干细胞组、治疗组-2：细胞凝胶制剂组。依据上述实施例5提供的配比制备凝胶溶液，取800ul凝胶溶液加入200ul含有1×107/cell脐带间充质干细胞的复方电解质重悬液，混合均匀，制成透明质酸钠/胶原蛋白/硫酸软骨素凝胶制剂。动物模型：采用外径为2.0mm的点胶针头在股骨滑车中央部位慢慢用力旋转，至软骨表面缺损即出现一个圆环陷坑，刮除中央所有软骨组织至软骨下骨钙化层暴露，完成构建软骨全层缺损模型。治疗：对阳性对照组关节腔内注射200ul的生理盐水，对治疗组-1关节腔内注射含有2×106/cell脐带间充质干细胞复方电解质重悬液200ul，对治疗组-2关节腔内注射200ul细胞凝胶制剂。12周时进行缺损软骨组织修复icrs宏观评分。(评分标准参见表-1；评分结果见图7)
表1软骨损伤修复icrs评分系统
对照组和治疗组的缺损软骨组织修复icrs宏观评分结果显示(图7)：12周时，治疗组-1、-2评分结果明显高于阳性对照组即生理盐水组(p<0.05)；细胞凝胶制剂组(治疗组-2)的icrs评分结果高于脐带间充质干细胞组(治疗组-1),且与阴性对照组(未处理组)无显著性差异(p>0.05)。经细胞凝胶治疗后原缺损深度变浅约icrsi级，表面光滑。表明关节腔内注射细胞凝胶制剂能明显改善及修复软骨表面的损伤组织。
实施例8：含有脐带间充质干细胞的透明质酸钠/胶原蛋白/硫酸软骨素(25:25:1)凝胶制剂对大鼠骨关节炎的治疗作用
取40只健康的sd大鼠，随机分4组(每组各10只)即：阳性对照组－生理盐水组(处理后)、阴性对照组－未处理组、治疗组-1：脐带间充质干细胞组、治疗组-2：细胞凝胶制剂组。依据上述实施例5提供的配比制备凝胶溶液，取800ul凝胶溶液加入200ul含有1×107/cell脐带间充质干细胞的复方电解质重悬液，混合均匀，制成透明质酸钠/胶原蛋白/硫酸软骨素凝胶制剂。关节腔注射碘乙酸钠溶液构建骨关节炎模型。4周后成模，对阳性对照组关节腔内注射100ul的生理盐水，对治疗组-1关节腔内注射含有1×106/cell脐带间充质干细胞复方电解质重悬液100ul，对治疗组-2关节腔内注射100ul细胞凝胶制剂。12周后对软骨表面进行大体评分。(评分标准参见表-2；评分结果见图8)
表2软骨表面大体评分系统
12周后治疗组-1、-2软骨表面大体评分明显低于阳性对照组(p<0.05)，即阳性对照组(生理盐水组－处理后)关节面出现糜烂，且与周围组织分界明显。细胞凝胶制剂组要略高于细胞治疗组，即软骨缺损处均出现软骨样组织修复，表面完整光滑，与阴性对照组(未处理组)无显著性差异(p>0.05)。结果表明关节腔内注射细胞凝胶制剂能明显改善由关节炎所导致的软骨关节面损伤(图8)。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。