本发明涉及一种治疗胃痛、胁痛、胃肠溃疡、抑郁症的中药提取物(以下也称化肝煎方提取物)及其的制备方法及其应用，属于中医药技术领域。
背景技术
中医药是中国的国粹，在我国有几千年的应用历史，特别来源于《景岳全书》、《伤寒论》、《太平惠民和剂局方》、《金匮要略》等巨著的经典名方，经过近千年的临床实验，已经被广泛证明是科学有效的，因而被传承而长盛不衰。相比于现代中药制剂，传统制剂普通存在工艺落后，质量不稳定、技术水平低、生产效能不足等缺点。
肝气犯胃又名肝胃不和证、肝胃气滞证。是肝失疏泄，横逆犯胃，胃失和降所表现的证候。多由情志不遂，气郁化火，或寒邪内犯肝胃而发病。临床以胸胁胃脘胀满疼痛为主要表现。常见于胃脘痛、呕吐、呃逆、胁痛，以及现代医学的慢性胃炎、胃十二指肠溃疡、胃神经官能症、慢性肝炎、肝硬化等疾病。生理情况下，肝的疏泄功能可以促进脾胃的运化，脾胃的运化功能又有助于肝的疏泄，两者相互依赖，相互协调。疾病情况下，两者亦相互影响，如抑郁伤肝，肝失疏泄，横逆犯胃，胃失和降，引起肝气犯胃证；若胃气先虚，肝气相对偏盛，乘之于脾胃，也可引起肝气犯胃证。前者为木旺乘土，后者为土虚木乘。主要有胸胁胃脘胀满疼痛，呃逆嗳气，呕吐，或见嘈杂吞酸，烦躁易怒，舌苔薄白或薄黄，脉弦或弦数等。肝气郁结，疏泄失职，则见情志郁闷，善叹息，或烦躁易怒，胸胁胀痛；肝气横逆，气滞于胃，胃气上逆，则表现为胃脘胀痛，呃逆嗳气；气郁胃中而生热，可见吞酸嘈杂。因气郁化火与否的差别，舌苔可为薄白或薄黄，脉弦或弦数。若肝郁日久，气郁化火，则可表现为胸胁胃脘疼痛剧烈，心烦易怒，口干口苦，舌红苔黄，脉弦数。若火气灼伤肝阴，耗伤胃津，则常有胁肋隐隐作痛，胃脘胀痛，饥不欲食，口干，大便干，舌红少苔或中有裂纹等阴虚表现。若肝气犯胃，气滞不行，日久影响血液运行而致血瘀，则表现为胁肋胃脘疼痛固定，痛如针刺，甚则损伤脉络，而见呕血黑便。
目前，西医治疗慢性胃炎主要是清除幽门螺杆菌的感染、促进胃动力、保护胃粘膜。中医药在治疗慢性胃炎上有其独特的优势，运用中医经方，以顾护胃气为本，祛除病因为标，注意肝气调达，针药结合，灵活进行辩证治疗，可取得满意的疗效。目前治疗慢性胃炎的中药有多种，但针对于肝火犯胃型慢性胃炎的中成药尚无报道。
目前，全世界精神疾患已成为突出的社会问题，抑郁症作为一种严重的精神障碍，其发病率已跃居世界十大常见疾病的第四位。从疾病的负担情况来看，抑郁症已占整个疾病负担的6.2％，到2020年将达10.0％，将成为世界范围内支出最昂贵疾病的第二位，仅次于冠心病。抑郁症给个人和家庭造成的痛苦和损失也是其他疾病无法比拟的。所以，大力加强治疗抑郁症药物的开发具有重要的社会意义。
现代医学认为本病病因很复杂，至今尚未完全阐明。其病因可概括为生物学和社会生理学原因。生物学原因研究表明主要与遗传、神经内分泌、神经生化(单胺类神经递质学说等)机制有关。对本病的治疗，过去常用传统的抗抑郁药主要是化学合成药物，有三环类抗抑郁剂(tca)、单胺氧化酶抑制剂(maoi)，虽在不同程度上可缓解症状，但存在许多不足和缺点。第一，这些抗抑郁剂对一部分难治性抑郁症不能奏效；第二，原有常规抗抑郁症治疗中不良反应较多，使一部分人不能耐受。例如，三环类中的抗胆碱副作用和心血管副作用，再如maoi药物对肝功能的影响和奶酪反应等会使治疗中断；第三，常规抗抑郁药物起效徐缓，大抵需为时2-3周才能产生抗抑郁效果。起效缓慢对重症抑郁症患者会影响有效的治疗时机，难以控制症状，使之丧失治疗的信心。
90年代以来，出现了一些新型抗抑郁剂，主要以高选择性五羟色胺摄取剂抑制剂为首选，常用氟伏草胺、马氯贝胺、氟西汀、文拉法新、舍曲林(郁乐复)等，但均存在不同程度的副作用，长期应用易引起严重的并发症。可见，有关治疗本病的合成药物及生物制剂种类繁多，但均因效果有限且不确切、毒副作用和不良反应多或价格昂贵难以普及等问题，到目前为止，西药界尚未找到防治本病的理想药物。因此，近年来研究的热点转向以整体调节为特色的中医药，祖国医学对该病病因、病机及治疗的认识颇丰并有得天独厚的中药资源，临床验证疗效显著。中药以其疗效好，副作用少或无副作用的优势越来越受到世人的关注，研制开发出高效无毒副作用的中药新药，必将造福社会及广大家庭。
中医理论认为，抑郁症的发生，是由于情志所伤、肝气郁结逐渐引起五脏气机不和所致。主要表现为心情抑郁、情绪不宁、胁肋胀痛，或易怒善哭、失眠等各种复杂症状。郁症的发生，因郁怒、思虑、悲哀、忧愁七情之所伤，导致肝失疏泄、脾失运化、心神失常、肝脏阴阳气血失调而成。因此郁症初起，常是以情志所伤致肝失调达、疏泄失司，气郁气滞为主要病机。郁怒不畅，使肝失调达，气湿疏泄，而致肝气郁结，则可见心情抑郁、情绪不宁、郁郁不乐、多疑善虑；肝气循环布于两胁，肝失疏泄，经气郁滞则见胸胁胀满；肝郁抑脾可见腹胀纳呆，心主藏神，肝主疏泄，七情易伤心神，故可见心悸失眠、多梦，所以，郁症的主要病机为气机郁滞，治疗当以疏通气机为主。正如《证治汇补·郁症》所言：“郁病虽多，皆因气不周流，法当顺气为先。”根据受病脏腑虚实，或以祛实，或以补虚，或以调和升降气机等皆为疏通气机之法。针对本病的病因病机，我们从郁怒不畅、肝失疏泄、肝气郁结、肝郁抑脾、心神不安入手，拟定疏肝理气解郁除烦为主，兼以养血清心安神定志为治疗原则。
对于郁病的治疗，历代医家各有专长，临床经验累积甚丰。综其大法，首当调理气机，同时注意三焦通利，以及无形之郁与有形之滞(如食积痰湿水停等)的鉴别。李用粹说：“郁病虽多，皆因气不周流。法当顺气为先，开题为次。”(《证治汇补·内因门·郁症》)叶天士治郁，妙在灵巧。其遣方用药，贯穿了宣通的原则，而不重在攻补。
叶天士提出郁病治疗大法与治疗宜忌，特别对不注重辩证而妄攻呆补得不良倾向进行了批判。他说：“郁则气滞，其滞或在形躯，或在脏腑，必有不舒之现症。盖气本无形，郁则气聚，聚则似有形而实无质，如胸隔似阻，心下虚痞，胁胀背胀，脘闷不食，气瘕攻冲，筋脉不舒。医家不察，误认有形之滞，放胆用破气攻削，适至愈治愈剧，转方又属呆补，此不死于病，而死于药矣。”(《临证指南医案，郁》)。
从以上论述中可以看出，祖国医学对郁症从病因、病机、病位到治则、用药、宜忌，已形成比较完整的理论体系，积累了丰富的临床经验。
化肝煎方来源于《景岳全书》(明代张景岳所著，卷五十一)。治怒气伤肝，因而气逆动火，致为烦热胁痛，胀满动血等证。水一盅半，煎七、八分。食远温服。主要组分为青皮、陈皮各二钱，芍药二钱，丹皮、栀子(炒)、泽泻各一钱半，土贝母二、三钱。主治：怒气伤肝，气逆动火，胁痛胀满，烦热动血。主要功效用于治怒气伤肝，因而气逆动火，致为烦热胁痛，胀满动血等证。本方中青皮疏肝理气，芍药养血柔肝，陈皮理气和胃，缓急止痛，丹皮、山栀清肝泻热，泽泻化湿泻热，土贝母清热散结。诸药配伍，共奏泻热和胃，疏肝理气之功。主要用于治疗肝郁化火，邪热犯胃导致的脘胁胀痛。方用青皮、陈皮理气和胃，芍药养血敛肝，牡丹皮、山栀清肝泄热；肝胃并治，为其配伍特点。临床应用以胃脘灼痛、痛势急迫、胁痛胀满、烦热易怒，为其辨证要点。
传统上，该方剂的制备工艺及服用方法主要是水煎服(水一盅半，煎七、八分。食远温服)，且仅煎一次，传统的水提工艺参数没有，可见，传统上其工艺粗糙，有效成分含量较低，且服用、携带不方便，服用量大，也不适宜加工成其他剂型。有关化肝煎方的现代制备工艺、提取物研究，文献上尚无报道、其新制剂、新药、新产品开发，也是无。其主要活性成分在复方的体现，研究上也是空白。而复方中陈皮、青皮主要成分为橙皮苷等黄酮类成分；芍药中主要成分为芍药苷等黄酮类成分；牡丹皮中主要成分为丹皮酚；栀子中主要成分为栀子苷；泽泻中主要成分为23-乙酰泽泻醇b；土贝母中主要成分为土贝母苷甲等生物碱类成分，本发明工艺对其主要成分进行系统优化和确认，同时进行了制剂学研究。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种治疗胃痛、胁痛、胃肠溃疡、抑郁症的中药提取物及其制备方法和应用。对其主要成分进行系统优化和确认，解决传统制剂存在质量不稳定、工艺落后、效能不足等问题。
本发明包括如下技术方案：
本发明中，所用的青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母原料均为它们的中药饮片。所涉及的乙醇的百分浓度单位％均为体积百分浓度％v/v。本发明的下述方法制备而得的“化肝煎方”中药提取物中，其含有量以重量计，橙皮苷不低于4.1％、芍药苷不低于0.80％、丹皮酚不低于0.67％、栀子苷不低于0.10％、23-乙酰泽泻醇b不低于0.03％、土贝母苷甲不低于0.70％。
技术方案1：一种治疗胃痛、胁痛、胃肠溃疡、抑郁症的中药提取物的水提取制备方法，以青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，各原料相对重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；制备方法包括如下步骤：将上述各味药材净选，按比例称取原料，加7～12倍水量浸泡20-30min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加水量与第一次一致)，第三次提取30min(加水量与第一次一致)，每次的提取时间从沸腾后开始计算，合并提取液，浓缩获得的提取液至所述提取液体积为所述原料重量的3～5倍，获得初步浓缩提取液；进一步干燥至相对密度为1.0～1.2g/cm3的“化肝煎方”中药提取物。
技术方案2：一种治疗胃痛、胁痛、胃肠溃疡、抑郁症的中药提取物的醇提取制备方法，以青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，各原料相对重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；制备方法包括如下步骤：将上述各味药材净选，按比例称取原料，加7～12倍65％～85％乙醇浸泡20-30min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加醇量与第一次一致)，第三次提取30min(加醇量与第一次一致)，每次的提取时间从沸腾后开始计算，合并提取液，浓缩获得的提取液至所述提取液的体积为所述原料重量的3～5倍，获得初步浓缩提取液；进一步干燥至相对密度为1.0～1.2g/cm3“化肝煎方”中药提取物。
技术方案3：一种治疗胃痛、胁痛、胃肠溃疡、抑郁症的中药提取物的水提醇沉制备方法，以青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，各原料相对重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；制备方法包括如下步骤：
1)制备浓缩液：将上述各味药材净选，按比例称取原料，加7～12倍水量浸泡20-30min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加水量与第一次一致)，第三次提取30min(加水量与第一次一致)，每次的提取时间从沸腾后开始计算，合并提取液，浓缩获得的提取液至所述提取液体积为所述原料重量的3～5倍，获得初步浓缩提取液；
2)加乙醇沉淀：加适量乙醇到上述制备的初步浓缩提取液中，使提取液含醇量为65～75％，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，得到精制液，浓缩，干燥即得“化肝煎方”中药提取物。
技术方案4：一种治疗胃痛、胁痛、胃肠溃疡、抑郁症的中药提取物的大孔树脂纯化制备方法，以青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，各原料相对重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；制备方法包括如下步骤：
1)制备浓缩液：将上述各味药材净选，按比例称取原料，加7～12倍水量浸泡20-30min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加水量与第一次一致)，第三次提取30min(加水量与第一次一致)，每次的提取时间从沸腾后开始计算，合并提取液，浓缩获得的提取液至所述提取液体积为所述原料重量的3～5倍，获得初步浓缩提取液；
2)大孔树脂纯化：分别加3～5倍体积热水到初步浓缩提取液中，取上清液；将上清液过大孔树脂柱吸附，弃流出液；然后用1～5bv的水以0.5～2.5bv/小时的流速洗涤所述吸附柱，弃水洗液；之后采用50～70％的乙醇，洗脱体积3～5bv，以0.5～2.5bv/小时的流速洗脱吸附柱，收集该乙醇洗脱液，浓缩、干燥所述乙醇洗脱液，获得“化肝煎方”中药提取物。
技术方案5：一种治疗胃痛、胁痛、胃肠溃疡、抑郁症的中药提取物的大孔树脂纯化制备方法，以青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料制成，各原料相对重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；
制备方法包括如下步骤：
1)制备浓缩液：取上各味中药饮片，按比例称取原料，加7～12倍65％～85％浓度乙醇浸泡20-30min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加醇量与第一次一致)，第三次提取30min(加醇量与第一次一致)，每次的提取时间从沸腾后开始计算，合并提取液，浓缩获得的提取液至所述提取液的体积为所述原料重量的3～5倍，获得初步浓缩提取液；
2)大孔树脂纯化：分别加3～5倍体积热水到上步获得的初步浓缩提取液中，取上清液；将上清液过大孔树脂柱吸附，弃流出液；上样后先用5bv的水洗涤所述吸附柱，弃水洗液；然后用1～5bv的水以0.5～2.5bv/小时的流速洗涤所述吸附柱，弃水洗液；之后采用50～70％的乙醇，洗脱体积3～5bv，以0.5～2.5bv/小时的流速洗脱吸附柱，收集该乙醇洗脱液，浓缩、干燥所述乙醇洗脱液，获得“化肝煎方”中药提取物。
技术方案6：一种“化肝煎方”汤剂制备方法，其特征在于，以青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料制成，各原料相对重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；
制备方法包括如下步骤：取上各味中药饮片，按比例称取原料，加7倍水量，加热提取2.5h，提取液浓缩获得的提取液至所述提取液体积为所述原料重量的5倍，获得初步浓缩提取液；进一步干燥至相对密度为1.0g/cm3的“化肝煎”的物质基准。所得物质基准的有效成分橙皮苷不低于3.6％、芍药苷不低于0.56％、丹皮酚不低于0.42％、栀子苷不低于0.05％、23-乙酰泽泻醇b不低于0.01％、土贝母苷甲不低于0.43％。
技术方案7：提供了含有上述方法制备而得的“化肝煎方”中药提取物的口服固体制剂，其中口服固体制剂包括：片剂、硬胶囊、软胶囊、颗粒剂、口服液；颗粒剂、硬胶囊以及片剂辅料选自淀粉、糖粉、乳糖、糊精、甜菊糖、预胶化淀粉、微晶纤维素、碳酸氢钙、甘露醇、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、聚乙二醇类等常用辅料；软胶囊剂辅料选自聚乙二醇(聚乙二醇2000-6000)、蜂蜡、液体石蜡、植物油、甘油、明胶等。口服液辅料选用β-环糊精、山梨醇等，其中片剂具体指普通压制片、包衣片、糖衣片、薄膜衣片。
技术方案8：提供了上述方法制备而得的“化肝煎方”中药提取物在制备治疗胃痛、胁痛、胃肠溃疡及治疗抑郁症药物或保健品中的应用。
本发明具备以下优点：
1、本发明的中药提取物以青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料制备。其中青皮为芸香科植物橘(citrusreticulatablanco)及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮；陈皮为为芸香科植物橘(citrusreticulatablanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮；芍药为毛茛科植物芍药(paeoniatactilorapall.)的干燥根；牡丹皮为为毛茛科多年生落叶小灌木植物牡丹(paeoniasuffruticosaandr.)的干燥根皮；栀子为茜草科植物栀子(gardeniajasminoidesellis)的干燥成熟果实；泽泻为泽泻科植物泽泻(alismaorientalis(sam.)juzep.)的干燥块茎；土贝母为葫芦科植物土贝母(bolbostemmapaniculatum(maxim.)franquet)的干燥块茎。获得的中药提取物为所含各种药材活性成分协同起效的混合物，它不同于活性单体，其药效也不同于各种药材活性成分药效的简单加和。
2、本发明的“化肝煎”方中药提取物均以青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，处方比例清晰明确。经查验相关文献可知“化肝煎”处方来源于明朝张景岳编著的《景岳全书》，其具体配方及比例如下：
根据邱隆写的“中国历代度量衡单位量值表及说明”一文中可知，在明朝1两等于37.3g，相当于1钱等于3.73g，按此计量换算可得每日处方用量为青皮二钱[7.5g]，陈皮二钱[7.5g]，芍药二钱[7.5g]，牡丹皮一钱半[5.6g]，栀子(炒)一钱半[5.6g]，泽泻一钱半[5.6g]，土贝母三钱[11.2g]，各原料相对重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6。
3、本发明采用了水提、醇提、水提醇沉、大孔树脂纯化等多种方法，从根本上保证“化肝煎方”中药汤剂的优越性，为制备成高质量的不同剂型产品提供保障。本发明提供的提取物的制备工艺能有效地富集主要活性成分如：橙皮苷、芍药苷、丹皮酚、栀子苷、23-乙酰泽泻醇b和土贝母苷甲等。
4、质量控制采用高效液相分析方法进行含量测定，简单易控。本发明的提取物的物质基础为一定比例的多个活性成分含量组成，对于该配方，尚为首次提出活性成分清晰的物质基础。体现发明专利的创新性。
5、本发明所涉及的提取物的各种制备工艺所获得的提取物成分和古方制备工艺相比(经典名方物质基准)，具有有效成分高，成本低，更便于加工制剂，便于市场推广和应用。
6、本发明提供的大孔树脂纯化制备方法中采用树脂纯化方法，该方法简便、快捷、重现性好；所选用的大孔树脂吸附量大，解吸率大，可反复使用，降低工艺成本；所用的溶剂乙醇，价廉无毒。经大孔树脂纯化的制备方法得到的提取物与原方剂的水煎物相比，体积小、中药内在质量高，产品吸潮性减少、稳定性增加，容易制成外观美观的各种剂型。
7、本发明的制备方法所制备的“化肝煎方”中药提取物具治疗胃痛、胁痛、胃肠溃疡及治疗抑郁症功能。而且毒性低，具有很好的用药安全性，这充分提示了本工艺制备的提取物的临床用药的安全性。
因此，本发明中所述的“化肝煎”方中药提取物适合工业化生产，具有很强的实用性。
具体实施方式
通过下面的实施例可以更好的理解本发明的本质，但不以任何方式限制本发明。
材料来源：青皮为芸香科植物橘(citrusreticulatablanco)及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮；陈皮为为芸香科植物橘(citrusreticulatablanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮；芍药为毛茛科植物芍药(paeoniatactilorapall.)的干燥根；牡丹皮为为毛茛科多年生落叶小灌木植物牡丹(paeoniasuffruticosaandr.)的干燥根皮；栀子为茜草科植物栀子(gardeniajasminoidesellis)的干燥成熟果实；泽泻为泽泻科植物泽泻(alismaorientalis(sam.)juzep.)的干燥块茎；土贝母为葫芦科植物土贝母(bolbostemmapaniculatum(maxim.)franquet)的干燥块茎。其中材料均通过商业途径购买。
实施例1水提取方法制备“化肝煎”方中药提取物
方法1：取青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，以水为溶剂提取所述原料，各原料重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；将上述各味药材净选，按比例称取青皮28公斤、陈皮28公斤、芍药28公斤、牡丹皮21公斤、栀子21公斤、泽泻21公斤、土贝母42公斤，1.89吨水量浸泡20min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加水量与第一次一致)，第三次提取30min(加水量与第一次一致)，每次的提取时间从沸腾后开始计算。合并提取液，浓缩获得的提取液至所述提取液体积为所述原料重量的3倍，获得初步浓缩提取液；进一步干燥至相对密度为1.0g/cm3的“化肝煎”方中药提取物(批号为18010106)。
方法2：取青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，以水为溶剂提取所述原料，各原料重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；将上述各味药材净选，按比例称取青皮48公斤、陈皮48公斤、芍药48公斤、牡丹皮36公斤、栀子36公斤、泽泻36公斤、土贝母72公斤，3.24吨水量浸泡30min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加水量与第一次一致)，第三次提取30min(加水量与第一次一致)，每次的提取时间从沸腾后开始计算，合并提取液，浓缩获得的提取液至所述提取液体积为所述原料重量的5倍，获得初步浓缩提取液；进一步干燥至相对密度为1.2g/cm3的“化肝煎”方中药提取物(批号为18010208)。
方法3：取青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，以水为溶剂提取所述原料，各原料重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；将上述各味药材净选，按比例称取青皮40公斤、陈皮40公斤、芍药40公斤、牡丹皮30公斤、栀子30公斤、泽泻30公斤、土贝母60公斤，2.70吨水量浸泡25min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加水量与第一次一致)，第三次提取30min(加水量与第一次一致)，每次的提取时间从沸腾后开始计算，合并提取液，浓缩获得的提取液至所述提取液体积为所述原料重量的4倍，获得初步浓缩提取液；进一步干燥至相对密度为1.1g/cm3的“化肝煎”方中药提取物(批号为18010309)。
实施例2醇提取方法制备“化肝煎”方中药提取物
方法1：取青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，以65％乙醇为溶剂提取所述原料，各原料重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；将上述各味药材净选，按比例称取青皮28公斤、陈皮28公斤、芍药28公斤、牡丹皮21公斤、栀子21公斤、泽泻21公斤、土贝母42公斤，1.89吨65％乙醇浸泡20min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加醇量与第一次一致)，第三次提取30min(加醇量与第一次一致)，每次的回流提取时间从沸腾后开始计算，提取液合并，静置24小时，过滤取上清液，将上清液浓缩到原药材的3倍，获得初步浓缩提取液；进一步干燥至相对密度为1.0g/cm3的“化肝煎”方中药提取物(批号为18020423)。
方法2：取青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，以85％乙醇为溶剂提取所述原料，各原料重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；将上述各味药材净选，按比例称取青皮48公斤、陈皮48公斤、芍药48公斤、牡丹皮36公斤、栀子36公斤、泽泻36公斤、土贝母72公斤，3.24吨85％乙醇浸泡30min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加醇量与第一次一致)，第三次提取30min(加醇量与第一次一致)，每次的回流提取时间从沸腾后开始计算，提取液合并，静置24小时，过滤取上清液，将上清液浓缩到原药材的5倍，获得初步浓缩提取液；进一步干燥至相对密度为1.2g/cm3的“化肝煎”中药醇提取物(批号为18020524)。
方法3：取青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，以75％乙醇为溶剂提取所述原料，各原料重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；将上述各味药材净选，按比例称取青皮40公斤、陈皮40公斤、芍药40公斤、牡丹皮30公斤、栀子30公斤、泽泻30公斤、土贝母60公斤，2.70吨75％乙醇浸泡25min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加醇量与第一次一致)，第三次提取30min(加醇量与第一次一致)，每次的回流提取时间从沸腾后开始计算，提取液合并，静置24小时，过滤取上清液，将上清液浓缩到原药材的4倍，获得初步浓缩提取液；进一步干燥至相对密度为1.1g/cm3的“化肝煎”中药醇提取物(批号为18020625)。
实施例3水提醇沉方法制备“化肝煎”方中药提取物
方法1：取青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，以水为溶剂提取所述原料，各原料重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；将上述各味药材净选，按比例称取青皮28公斤、陈皮28公斤、芍药28公斤、牡丹皮21公斤、栀子21公斤、泽泻21公斤、土贝母42公斤，加1.89吨：吨水量浸泡20min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加水量与第一次一致)，第三次提取30min(加水量与第一次一致)，每次的提取时间从沸腾后开始计算，合并提取液，浓缩获得的提取液至所述提取液体积为所述原料重量的3倍，获得初步浓缩提取液；边搅拌边缓慢加入适量乙醇，使溶剂含醇量为65％，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，得到精制液，浓缩，干燥获得“化肝煎”方中药提取物(批号为18030518)。
方法2：取青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，以水为溶剂提取所述原料，各原料重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；将上述各味药材净选，按比例称取青皮48公斤、陈皮48公斤、芍药48公斤、牡丹皮36公斤、栀子36公斤、泽泻36公斤、土贝母72公斤，加3.24吨水量浸泡30min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加水量与第一次一致)，第三次提取30min(加水量与第一次一致)，每次的提取时间从沸腾后开始计算，合并提取液，浓缩获得的提取液至所述提取液体积为所述原料重量的5倍，获得初步浓缩提取液；边搅拌边缓慢加入适量乙醇，使溶剂含醇量为75％，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，得到精制液，浓缩，干燥获得”化肝煎”方中药提取物(批号为18030620)。
方法3：取青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，以水为溶剂提取所述原料，各原料重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；将上述各味药材净选，按比例称取青皮40公斤、陈皮40公斤、芍药40公斤、牡丹皮30公斤、栀子30公斤、泽泻30公斤、土贝母60公斤，加2.70吨水量浸泡25min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加水量与第一次一致)，第三次提取30min(加水量与第一次一致)，每次的提取时间从沸腾后开始计算，合并提取液，浓缩获得的提取液至所述提取液体积为所述原料重量的4倍，获得初步浓缩提取液；边搅拌边缓慢加入适量乙醇，使溶剂含醇量为70％，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，得到精制液，浓缩，干燥获得“化肝煎”方中药提取物(批号为18030722)。
实施例4大孔树脂方法一制备“化肝煎”方中药提取物
方法1：取青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，以水为溶剂提取所述原料，各原料重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；将上述各味药材净选，按比例称取青皮28公斤、陈皮28公斤、芍药28公斤、牡丹皮21公斤、栀子21公斤、泽泻21公斤、土贝母42公斤，1.89吨水量浸泡20min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加水量与第一次一致)，第三次提取30min(加水量与第一次一致)，每次的提取时间从沸腾后开始计算，合并提取液，浓缩获得的提取液至所述提取液体积为所述原料重量的3倍，获得初步浓缩提取液；将初步浓缩提取液加3倍热水稀释，加入适量中药澄清剂壳聚糖，离心，去沉淀，取上清液，上样于d101大孔树脂柱(在上样前分别用酸，碱，水，醇对树脂柱进行前处理)，上样后先用1bv纯水冲洗，水溶液弃除，改用3bv的50％乙醇洗脱，洗脱液流速为0.5bv/h，收集该乙醇洗脱液。继续减压回收溶剂，收集浸膏，干燥获得“化肝煎”方中药提取物(批号为18040817)。
方法2：取青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，以水为溶剂提取所述原料，各原料重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；将上述各味药材净选，按比例称取青皮48公斤、陈皮48公斤、芍药48公斤、牡丹皮36公斤、栀子36公斤、泽泻36公斤、土贝母72公斤，3.24吨水量浸泡30min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加水量与第一次一致)，第三次提取30min(加水量与第一次一致)，每次的提取时间从沸腾后开始计算，合并提取液，浓缩获得的提取液至所述提取液体积为所述原料重量的5倍，获得初步浓缩提取液；将初步浓缩提取液加5倍热水稀释，加入适量中药澄清剂壳聚糖，离心，去沉淀，取上清液，上样于d101大孔树脂柱(在上样前分别用酸，碱，水，醇对树脂柱进行前处理)，上样后先用5bv纯水冲洗，水溶液弃除，改用5bv的70％乙醇洗脱，洗脱液流速为2.5bv/h，收集该乙醇洗脱液。继续减压回收溶剂，收集浸膏，干燥获得“化肝煎”方中药提取物(批号为18040927)。
方法3：取青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，以水为溶剂提取所述原料，各原料重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；将上述各味药材净选，按比例称取青皮40公斤、陈皮40公斤、芍药40公斤、牡丹皮30公斤、栀子30公斤、泽泻30公斤、土贝母60公斤，2.70吨水量浸泡25min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加水量与第一次一致)，第三次提取30min(加水量与第一次一致)，每次的提取时间从沸腾后开始计算，合并提取液，浓缩获得的提取液至所述提取液体积为所述原料重量的4倍，获得初步浓缩提取液；将初步浓缩提取液加4倍热水稀释，加入适量中药澄清剂壳聚糖，离心，去沉淀，取上清液，上样于d101大孔树脂柱(在上样前分别用酸，碱，水，醇对树脂柱进行前处理)，上样后先用2.5bv纯水冲洗，水溶液弃除，改用4bv的60％乙醇洗脱，洗脱液流速为1.5bv/h，收集该乙醇洗脱液。继续减压回收溶剂，收集浸膏，干燥获得“化肝煎”方中药提取物(批号为18041021)。
实施例5大孔树脂方法二制备“化肝煎”方中药提取物
方法1：取青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，以65％乙醇为溶剂提取所述原料，各原料重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；将上述各味药材净选，按比例称取青皮28公斤、陈皮28公斤、芍药28公斤、牡丹皮21公斤、栀子21公斤、泽泻21公斤、土贝母42公斤，1.89吨65％乙醇浸泡20min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加醇量与第一次一致)，第三次提取30min(加醇量与第一次一致)，每次的回流提取时间从沸腾后开始计算，提取液合并，静置24小时，过滤取上清液，将上清液浓缩到原药材的3倍，获得初步浓缩提取液；将浓缩提取液加3倍热水稀释，加入适量中药澄清剂壳聚糖，离心，去沉淀，取上清液，上样于d101大孔树脂柱(在上样前分别用酸，碱，水，醇对树脂柱进行前处理)，上样后先用5bv水(用1％盐酸调节ph为5)洗涤所述吸附柱，弃水洗液；再用中性1bv水溶液洗脱，水溶液弃除，改用3bv的50％乙醇洗脱，洗脱流速为0.5bv/h，收集该乙醇洗脱液。继续减压回收溶剂，收集浸膏，干燥获得“化肝煎”方中药提取物(批号为18051103)。
方法2：取青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，以85％乙醇为溶剂提取所述原料，各原料重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；将上述各味药材净选，按比例称取青皮48公斤、陈皮48公斤、芍药48公斤、牡丹皮36公斤、栀子36公斤、泽泻36公斤、土贝母72公斤，3.24吨85％乙醇浸泡30min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加醇量与第一次一致)，第三次提取30min(加醇量与第一次一致)，每次的回流提取时间从沸腾后开始计算，提取液合并，静置24小时，过滤取上清液，将上清液浓缩到原药材的5倍，获得初步浓缩提取液；将浓缩提取液加5倍热水稀释，加入适量中药澄清剂壳聚糖，离心，去沉淀，取上清液，上样于d101大孔树脂柱(在上样前分别用酸，碱，水，醇对树脂柱进行前处理)，上样后先用5bv水(用1％盐酸调节ph为6)洗涤所述吸附柱，弃水洗液；再用中性5bv水溶液洗脱，水溶液弃除，改用洗5bv的70％乙醇洗脱，洗脱流速为2.5bv/h，收集该乙醇洗脱液。继续减压回收溶剂，收集浸膏，干燥获得“化肝煎”方中药提取物(批号为18051205)。
方法3：取青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，以75％乙醇为溶剂提取所述原料，各原料重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；将上述各味药材净选，按比例称取青皮40公斤、陈皮40公斤、芍药40公斤、牡丹皮30公斤、栀子30公斤、泽泻30公斤、土贝母60公斤，2.70吨75％乙醇浸泡25min，加热提取3次，第一次提取2.5h，第二次提取1h(加醇量与第一次一致)，第三次提取30min(加醇量与第一次一致)，每次的回流提取时间从沸腾后开始计算，提取液合并，静置24小时，过滤取上清液，将上清液浓缩到原药材的4倍，获得初步浓缩提取液；将浓缩提取液加5倍热水稀释，加入适量中药澄清剂壳聚糖，离心，去沉淀，取上清液，上样于d101大孔树脂柱(在上样前分别用酸，碱，水，醇对树脂柱进行前处理)，上样后先用5bv水(用1％盐酸调节ph为5.5)洗涤所述吸附柱，弃水洗液；再用中性3bv水溶液洗脱，水溶液弃除，改用洗4bv的60％乙醇洗脱，洗脱流速为1.5bv/h，收集该乙醇洗脱液。继续减压回收溶剂，收集浸膏，干燥获得“化肝煎”方中药提取物(批号为18051228)。
实施例6水提取方法制备“化肝煎”方中药汤液(经典名方物质基准)
取青皮、陈皮、芍药、牡丹皮、栀子(炒)、泽泻、土贝母为原料，以水为溶剂提取所述原料，各原料重量比为青皮：陈皮：芍药：牡丹皮：栀子(炒)：泽泻：土贝母＝4：4：4：：3：3：3：6；将上述各味药材净选，按比例称取青皮28公斤、陈皮28斤、芍药28公斤、牡丹皮21公斤、栀子21公斤、泽泻21公斤、土贝母42公斤，1.89吨水量加热提取2.5h，提取液浓缩获得的提取液至所述提取液体积为所述原料重量的5倍，获得初步浓缩提取液；进一步干燥至相对密度为1.0g/cm3的“化肝煎”的物质基准(批号为18011118)。
实施例7“化肝煎”方中药提取物的口服制剂制备方法
1)“化肝煎”方中药提取物颗粒剂的制备
处方：(化肝煎提取物分别取自于实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6的“化肝煎”方中药提取物)
化肝煎提取物：500.0g
淀粉：200.0g
磷酸氢钙：150.0g
糊精：100.0g
乳糖：50.0g
称取处方量化肝煎提取物，加入处方量的辅料，加60％乙醇制软材，过20目制粒，50～60℃鼓风干燥(水份控制在5％～8％)，过16目筛整粒，即得化肝煎颗粒。
2)“化肝煎”方中药提取物包衣片的制备
处方：(化肝煎提取物分别取自于实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6的“化肝煎”方中药提取物)
化肝煎提取物：500.0g
预胶化淀粉：200.0g
微晶纤维素：230.0g
甜菊糖：25.0g
蔗糖：25.0g
硬脂酸镁：10.0g
微粉硅胶：10.0g
包衣剂：诺彩tm胃溶包衣剂(适量)
称取处方量的化肝煎提取物，加入处方量的辅料(硬脂酸镁、微粉硅胶外加)，加60％乙醇制软材，过20目制粒，50～60℃鼓风干燥(水份控制在5％～8％)，过16目筛整粒，与外加辅料硬脂酸镁、微粉硅胶混合均匀，压片，包衣，即得化肝煎包衣片。
3)“化肝煎”方中药提取物胶囊剂的制备
处方：(化肝煎提取物分别取自于实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6的“化肝煎”方中药提取物)
化肝煎提取物：500.0g
羟丙甲纤维素：40.0g(一半外加一半內加)
预胶化淀粉：190.0g
微晶纤维素：200.0g
乳糖：25.0g
糖粉：25.0g
硬脂酸镁：10.0g
滑石粉：10.0g
称取处方量化肝煎提取物，加入处方量的辅料(硬脂酸镁、滑石粉外加)，加60％乙醇制软材，过20目制粒，50～60℃鼓风干燥(水份控制在5％～8％)，过16目筛整粒，与外加辅料硬脂酸镁、微粉硅胶混合均匀，用充填机进行填充，即得化肝煎胶囊。
4)“化肝煎”方中药提取物软胶囊剂的制备
处方：(化肝煎提取物分别取自于实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6的“化肝煎”方中药提取物)
化肝煎提取物：500.0g
植物油：140.0g
山梨醇：100.0g
甘油：50.0g
液体石蜡：60.0g
明胶：150.0g
称取处方量化肝煎提取物与处方量的植物油、山梨醇混合均匀，将明胶与甘油分别盛装于贮液槽中，两液通过同心管状的双层喷头以不同速度喷出，使一定量的胶液将一定量的药液包裹后，滴入另一种不相互溶的冷却液(液体石蜡)中，胶液接触冷却液后因表面张力作用变为球形，并逐渐凝固而成软胶囊。
5)“化肝煎”方中药提取物口服液的制备
处方：(化肝煎提取物分别取自于实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6的“化肝煎”方中药提取物)
化肝煎提取物：500.0g
β-环糊精：140.0g
蔗糖：100.0g
蒸馏水260.0g
称取处方量化肝煎提取物，加入处方量的辅料，加蒸馏水溶解，搅拌均匀，即得化肝煎提取物口服液。
实施例8“化肝煎”方提取物的活性成分测定
1.色谱条件
agilent1260高效液相色谱仪，紫外检测器(dad)，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，c18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；橙皮苷(中国食品药品检定研究院，批号：110773-20101)的检测波长：283nm，流动相：甲醇醋酸水(35：4：51)；芍药苷(中国食品药品检定研究院，批号：110663-20201)的检测波长：230nm，流动相：甲醇-005mol/l磷酸二氢钾溶液(40：65)；丹皮酚(中国食品药品检定研究院，批号：110887-20101)的检测波长：274nm，流动相：甲醇-水(40：55)；栀子苷(中国食品药品检定研究院，批号：110457-20012)的检测波长：238nm，流动相：乙腈-水(15：85)；23-乙酰泽泻醇b(中国食品药品检定研究院，批号：110468-20162)的检测波长：208nm，流动相：乙腈-水(73：27)；土贝母苷甲(中国食品药品检定研究院，批号：110763-20201)的检测波长：214nm，流动相：甲醇水(65：35)；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl。
2.“化肝煎”方中药提取物样品的制备
1)本发明提取物
按本发明实例1、2、3、4、5、6所述的方法分别制得上述中药提取物各1个批号。
3.标准品溶液的配制
取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液，即得；取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得；取丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得；取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，即得；取23-乙酰泽泻醇b对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml含20μg的溶液，即得；取土贝母苷甲对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
4.测定方法
分别取各批号的上述中药提取物样品适量，精密称定约10-25mg，转移至50ml容量瓶中，加甲醇40ml，常温下超声30min，取出冷却到室温，加甲醇至刻度，摇匀，吸取适量，定容至50ml，摇匀，即可测定。根据外标一点法计算各成分含量。结果见表1：
表1化肝煎提取物各组分含量测定结果
故“化肝煎”方中药提取物，其含有以重量计，橙皮苷不低于4.1％、芍药苷不低于0.80％、丹皮酚不低于0.67％、栀子苷不低于0.10％、23-乙酰泽泻醇b不低于0.03％、土贝母苷甲不低于0.70％。
实施例9“化肝煎”方中药提取物的抗抑郁实验研究
昆明小鼠180只，分空白组、模型组、阴性对照组、样品1-1(批号：18010106)、样品1-2(批号：18010208)、样品1-3(批号：18010309)、样品2-1(批号：18020423)、样品2-2(批号：18020524)、样品2-3(批号：18020625)、样品3-1(批号：18030518)、样品3-2(批号：18030620)、样品3-3(批号：18030722)、样品4-1(批号：18040817)、样品4-2(批号：18040927)、样品4-3(批号：18041021)、样品5-1(批号：18051103)、样品5-2(批号：18051205)、样品5-3(批号：18051228)、样品6-1(批号：18011118)共十九组。每组动物各10只，各组小鼠连续灌胃给药24天。
抑郁模型建立：模型小鼠接受如下处理，24h断水、用止血钳夹尾部1min、40℃环境5min，鼠笼倾斜45度、4℃冰水游泳3min、24h断食、水平震荡(160次/min)45min、电击足底10min(电流强度1ma，电压30v，每隔1min刺激1次，每次持续10s，共刺激10次)、潮湿垫料24h，小鼠在接受抑郁模型处理期间，每且仅接受一种处理，连续两日内动物所接受的处理均不相同，以使动物不能预测刺激的发生。
小鼠行为测试
1)悬尾实验：将小鼠尾部用胶带悬挂。悬挂尾部点距尾尖2cm，悬挂6min，记录后4min小鼠完全不动的时间。
2)游泳实验：将动物放入大小合适的圆柱形玻璃缸中，每缸一只动物，水深适合游泳，水温25℃。实验前24h对动物进行游泳训练。实验时，动物在缸中游泳6mig，记录后4min内小鼠的完全不动时间。
脑组织内mda含量和sod活性测定：实验结束后将小鼠快速处死，在冰上快速分离脑组织。将脑组织称重后放入组织匀浆器中，匀浆成10％的组织匀浆。完成后，将匀浆液取出置入离心管中，4℃条件下冷冻，3000r/min离心10min。静置后取上清液，利用试剂盒分别测取小鼠脑组织mda含量和sod的活性。
对悬的影响，结果见表2.
表2悬尾实验及强迫游泳实验中小鼠不动时间的比较(
与空白组相比，*p<0.01；与模型组相比，**p<0.05；***p<0.001
由表2可以看出，与空白组比较，模型组小鼠悬尾实验及强迫游泳实验中小鼠不动时间明显延长(p<0.01)，表明建模成功。经过药物治疗后，各给药组小鼠悬尾实验及强迫游泳实验中小鼠不动时间明显减少。
对小鼠脑组织中mda含量及sod活性的影响，结果见表3
表3小鼠脑组织10％匀浆液mda含量和sod活性(
与空白组相比，*p<0.01；与模型组相比，**p<0.05；***p<0.001
由表3可以看出，与空白组比较，模型组小鼠脑组织mda含量增高，sod活性降低，表明建模成功。与模型组小鼠比较，各给药组小鼠脑组织中sod活性升高，mda含量明显下降。
实施例10“化肝煎”方中药提取物的治疗胃溃疡实验研究
1材料与方法
1.1材料
1.1.1大鼠健康雄性sd大鼠190只，体重180～200g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：scxk(湘)2017-0006。
1.1.2饲料由湖南中医药大学实验动物中心提供。
1.1.3屏障环境实验设施湖南中医药大学实验动物中心。
1.1.4药物实施案例1-6制备样品。蒸馏水(由湖南中医药大学实验动物中心提供)；10％水合氯醛、生理盐水(均由湖南中医药大学第一附属医院提供)。
1.1.5试剂及仪器pge2elisa试剂盒(购于bio-swamplifescience公司)；电子天平、恒温水浴箱、低温冰箱、酶标仪、高压蒸汽灭菌锅、高速离心机等(均由湖南中医药大学医学基础教学实验中心生化与分子生物学实验室提供)。
1.2方法
1.2.1动物分组实验前将动物在室温22～26℃安静环境下饲养3d，以让其适应环境并观察确定各实验大鼠无明显疾患后开始实验。将190只大鼠按随机数字表法分为19组：空白对照组、模型对照组、阳性对照组、样品1-1(批号：18010106)、样品1-2(批号：18010208)、样品1-3(批号：18010309)、样品2-1(批号：18020423)、样品2-2(批号：18020524)、样品2-3(批号：18020625)、样品3-1(批号：18030518)、样品3-2(批号：18030620)、样品3-3(批号：18030722)、样品4-1(批号：18040817)、样品4-2(批号：18040927)、样品4-3(批号：18041021)、样品5-1(批号：18051103)、样品5-2(批号：18051205)、样品5-3(批号：18051228)、样品6-1(批号：18011118)，每组各10只大鼠。
1.2.2动物造模空白对照组大鼠不造模。其他各组大鼠末次给药后禁食不禁水24h，采用水浸束缚应激(wrs)造模方法制作大鼠应激性胃溃疡模型。用10％水合氯醛麻醉大鼠后，将其仰卧固定在鼠板上，所用线绳松紧适度，待大鼠清醒后，将鼠板直立浸于20℃的恒温水浴箱中，水面保持在大鼠胸骨剑突部位，水浸15h后取出。
1.2.3给药方法16个样品组分别灌胃实施例1-6制备的样品；阳性对照组灌胃现配的3g/kg的奥美拉唑水悬液；空白对照组和模型对照组按1ml/100g灌胃生理盐水，各组预防性给药，每天1次，连续灌胃5d，于第5天给药后，禁食不禁水24h后造模。
1.2.4标本采集造模结束后，各组大鼠腹腔注射10％水合氯醛(300mg/kg)进行深度麻醉，麻醉后开腹，迅速分离腹主动脉，腹主动脉采血，置于无抗凝剂采血管中静置4h，3000r/min、离心10min，分离出血清置于ep管中，－20℃冰箱内保存备用。采血后，迅速结扎幽门，取出鼠胃，由贲门滴取少量胃液于ph试纸(测量范围：0.5～5.0，由湖南中医药大学医学基础教学实验中心生化与分子生物学实验室提供)，测定ph值。将鼠胃从幽门至贲门沿胃大弯剪开胃壁，使黏膜面外翻，用生理盐水轻轻漂洗，毛笔轻轻刷去胃黏膜表面粘液，于手术弯盘中展平，肉眼观察大鼠的胃黏膜损伤情况，计算胃溃疡指数。然后将胃组织保存于4％的多聚甲醛溶液中固定，he染色，观察胃黏膜组织病理形态学改变。
1.2.5指标检测方法胃液ph值测定：结扎鼠胃幽门，由贲门滴取少量胃液于ph试纸上，测定ph值。胃溃疡指数(ui)的计算：参照guth标准，即胃黏膜损伤长度以mm计算，斑点糜烂计1分；糜烂长度＜1mm计2分；糜烂长度1～2mm计3分；糜烂长度2～3mm计4分；糜烂长度＞4mm计5分；宽度＞1mm时分值×2，全胃得分之总和即为胃溃疡指数。酶联免疫法检测血清中pge2的含量，按照elisa试剂盒的说明进行操作。
1.2.6统计学方法采用spss16.0软件进行统计学分析，结果以均数±标准差(x±s)表示，组间均数比较采用单因素方差分析，并用lsd法进行两两比较、相关性检验，p＜0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1大体标本观察
空白对照组：大鼠胃黏膜光滑完整，无溃疡面和出血点；模型对照组：大鼠胃表面有咖啡样物质，可见胃黏膜表面充血水肿、糜烂，有大量点状或线状出血点和溃疡；阳性对照组：胃黏膜表面比较光滑，有极少的散在出血点，无明显的溃疡面；16个样品组：胃黏膜表面有散在的出血点、溃疡点。
2.2各组大鼠胃黏膜病理学变化的比较
空白对照组：胃黏膜层光滑完整，上皮细胞及腺体排列整齐，未见毛血管扩张充血和炎性细胞浸润。模型对照组：胃黏膜上皮明显破损，出现连续性中断，形成溃疡。有明显细胞脱落、组织溶解、出血倾向，黏膜下可见炎症细胞浸润。阳性对照组：胃黏膜损伤较模型对照组明显减轻，腺体排列较整齐，偶见表层小片状脱落上皮。16个样品组：胃黏膜轻度水肿，黏膜完整性较好，腺体排列较整齐，受损黏膜表浅且局限。。
2.3各组大鼠胃溃疡指数的测定结果如表4所示：与空白对照组比较，模型对照组大鼠ui值明显升高，差异有统计学意义(p＜0.01)；与模型对照组比较，阳性对照组和各样品组大鼠ui值明显降低(p＜0.01)；与阳性对照组比较，左金丸高剂量组大鼠ui值差异无统计学意义(p＝0.429)。以上提示：(1)造模成功后大鼠胃黏膜明显受损；(2)各样品组均可降低应激性胃溃疡大鼠ui值，保护胃黏膜，且呈明显的量效正相关关系。
表4各组大鼠胃黏膜损伤指数比较
注：与空白对照组比较，ap＜0.01；与模型对照组比较，bp＜0.01。与阳性对照组比较，cp＜0.01。
2.4各组大鼠胃液ph值、血清pge2的测定结果如表5所示：与空白对照组比较，模型对照组大鼠胃液ph值和血清pge2含量均明显降低(p＜0.01)；与模型对照组比较，阳性对照组、样品组大鼠胃液ph值和血清pge2含量均明显升高，差异有统计学意义(p＜0.01)。提示：(1)“化肝煎方”能升高应激性胃溃疡大鼠的胃液ph值，减少攻击因子胃酸的损害，从而保护胃黏膜；(2)“化肝煎方”能促进应激性胃溃疡大鼠pge2的合成和分泌，发挥保护胃黏膜的作用。
表5各组大鼠胃液ph值、血清pge2含量比较
注：与空白对照组比较，ap＜0.01；与模型对照组比较，bp＜0.01。与阳性对照组比较，cp＜0.01，dp＞0.05。
实施例11“化肝煎”方中药提取物的治疗胃痛实验研究
1材料
1.1药品实施案例1-6制备样品：样品1-1(批号：18010106)、样品1-2(批号：18010208)、样品1-3(批号：18010309)、样品2-1(批号：18020423)、样品2-2(批号：18020524)、样品2-3(批号：18020625)、样品3-1(批号：18030518)、样品3-2(批号：18030620)、样品3-3(批号：18030722)、样品4-1(批号：18040817)、样品4-2(批号：18040927)、样品4-3(批号：18041021)、样品5-1(批号：18051103)、样品5-2(批号：18051205)、样品5-3(批号：18051228)、样品6-1(批号：18011118)。外用号乙醇提取液3g/ml，临用时配成所需浓度。乙酞胆碱100ug/ml(上海试剂三厂，批号860920)，组胺100ug/ml(中科院上海生物化学研究所)。氯化钡10mg/ml及阿斯匹林12.5mg/ml，均市售。
1.2动物家兔2kg/只，由我院动物室提供；昆明种小白鼠18～22g，由湖北省防疫站提供。
1.3器材超级恒温器、张力换能器、生理记录仪、恒温水浴等。
2方法与结果
2.1胃痛止对家兔肠平滑肌的作用
2.1.1准备将家兔处死，剖腹，取空肠一段置盛有充氧(含5％co2)的台氏液中，ph值均为7左右。沿肠壁分离肠系膜，用台氏液将肠内容物冲洗干净。选取2～2.5cm标本一段，两端穿线，一端系于通气钩上，轻轻放入37.5℃的恒温麦氏浴槽中，另一端系于换能器上，用成都仪器厂生产的lms-2a型生理记录仪描记肠肌收缩活动。
2.1.2胃痛止对家兔离体肠平滑肌的作用
家兔的离体肠标本对实施例1-6样品呈现出收缩张力降低。结果见表6。
表6胃痛止对家兔离体肠自发性活动的影响
2.1.3胃痛止抗乙酞胆碱、组胺和氯化钡的作用
本发明样品对乙酞胆碱、组胺、氯化钡所引起的兔肠平滑肌痉挛具有明显的解痉作用。结果见表7。
表7胃痛止抗ach、组胺和氯化钡的作用
2.2胃痛止对小鼠肠蠕动的影响小鼠于实验前禁食24小时，然后经口服给含有墨汁的药物(每5ml药物中加墨汁1ml)，30分钟后经颈椎脱位法处死，剖腹，将消化道自贲门至直肠末端完整地摘出，不加牵引，平铺于实验台上，测其长度，并记录墨汁的前沿到贲门的距离，计算其与胃肠道全长的百分比，进行各组平均值间的t检验。
实验结果显示，本样品均能明显抑制小鼠肠蠕动。结果见表8。
表8胃痛止对小鼠在体肠平滑肌的影响
2.3胃痛止对小白鼠的镇痛作用(热板法)调节恒温水浴水温在55±0.5℃，将500ml铜锅放入其中，使锅底接触水面。每次取雌性小白鼠1只，放入锅内，记录自放入铜锅至出现舔后脚所需时间(秒)，作为该鼠的痛阈值。凡30秒内不出现舔后足者，弃之不用。取预选合格的小鼠65只，随机分为8组，灌胃给药。40分钟后按热板法进行实验，测定各鼠痛阈值，与对照组进行比较。
结果提示，本发明样品、阿斯匹林均有明显的镇痛作用。见表4。
表4胃痛止对小白鼠的镇痛作用(热板法)
实施例12提取物的的急性毒理实验
预实验：按急性毒理实验方法，选用昆明小鼠20只，禁食、不禁水12h。把实施例1中提取物配制成最大浓度的混悬液。每只小鼠每次灌胃约为0.8ml/20g(体重)，24h内灌胃3次，间隔4h。然后按常规饲养，并观察小鼠的毒性反应情况(外观、活动、呼吸、分泌物、排便、死亡等)，且连续称重7天。因以最大给药浓度、最大给药容量，均未测出半数致死量(ld50)，故做最大给药量实验。
1)一般表现
给药后14天内，实验组小鼠均饮食正常，皮毛光滑，活动自如，大小便正常，无异常分泌物，其呼吸系统、心血管系统、神经系统、消化系统与泌尿系统均未见异常，小鼠全部存活。其每天最大给药量均为每公斤大于250g。
2)体重变化情况
给药后14天内，体重无异常变化。
3)主要脏器观察
2组小鼠经大体解剖并通过肉眼观察，未见脏器肿大、萎缩、坏死等异常现象，主要脏器均无任何不良病变，与空白对照组相近。综上所述，提示本药无毒，其临床用药量是一个安全的剂量，临床用药安全。