CTRP3用于制备预防治疗心肌肥厚药物的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及ctrp3用于制备防治病理性心肌肥厚，延缓心衰发生的应用。

背景技术

心脏在压力负荷、炎症、氧化应激等刺激因素作用下，产生的一系列基因表达、表观形态和心脏功能层面的变化，这些刺激因素既可以直接刺激心肌细胞肥大，也可以通过激活信号通路诱导肥厚相关基因过表达，引起心肌肥厚。

病理性心肌肥厚表现为心脏质量和体积明显增加，心室后壁中部和室间隔厚度增加居多，心腔狭小，心肌细胞核变大，细胞体积增大、直径增宽或长度增加且细胞间排列紊乱，心肌间质细胞增殖，心脏细胞外基质改建，肌节数量增多并伴有纤维组织增生。

病理性心肌肥厚通常经历两个阶段：

第一个阶段是代偿期，在刺激因素的作用下，心室需要拮抗负荷，需要获取更多的能量，代偿性体积增大，收缩功能增强，所以在这个时期里心脏射血功能减退不明显甚至可以增强，心脏结构也没有产生太大改变。

第二个阶段是失代偿期，虽然心脏在受到肥厚因素刺激的情况下可以代偿性地肥厚保证供血功能不会减退，但是当刺激因素持续存在，心肌细胞代偿能力和能量消耗达到极限，心肌细胞会产生病变状态，甚至凋亡，取而代之的是增生的纤维组织，心肌细胞数量减少功能减退，心肌纤维化加重，从而引起心脏收缩泵血功能不可逆性减退，最终导致心力衰竭。

临床上造成心肌肥厚的疾病有许多，最常见的原发性或继发性高血压，缺血性心脏病，瓣膜病等也是病理性心肌肥厚的因素。我国人群高血压患病率居高不下且呈持续上升的趋势，目前估计全国有心血管病患者2.9亿,其中高血压患者2.7亿。心肌肥厚会增加心肌梗死、心衰和猝死的风险。目前用于防治心肌肥厚的药物众多，但由于具体作用机制、药物来源、副作用等诸多问题，亟待探索新型安全有效的心肌肥厚防治药物。

技术实现要素：

发明人研究发现ctrp3可以减轻心肌肥厚，并发现ctrp3可以减轻心肌细胞肥厚。在实验层面，发明人研究发现，在心肌细胞肥厚模型中，ctrp3可以降低心肌肥厚标志分子表达，减小心肌细胞平均表面积；在在体动物模型中，ctrp3可以降低小鼠主动脉弓缩窄后心体比和肺体比，降低收缩期室间隔厚度和舒张期左室后壁厚度，减小心肌细胞横截面积，改善心脏左心室收缩功能，减轻心肌组织间质和微血管周围纤维化程度，具有显著的抗病理性心肌肥厚，延缓心衰发生的作用。

基于上述发现，本发明提供了ctrp3用于制备预防或/和治疗心肌肥厚药物的应用。

优选的，本发明所述的心肌肥厚为病理性心肌肥厚。

本发明的ctrp3为人ctrp3，所述ctrp3的基因序列为：

(1)seqidno.1所示核苷酸序列；或

(2)与(1)限定的核苷酸序列中至少有90％同源性的核苷酸序列。

所述ctrp3的氨基酸序列为：

(3)seqidno.2所示氨基酸序列；或

(4)与(3)限定的氨基酸序列中至少有90％同源性的氨基酸序列。

本发明同时提供了一种预防或/和治疗心肌肥厚的药物，所述药物由ctrp3和辅料制成。

具体实施方式中，本发明的药物为静脉注射药物制剂、肌肉注射药物制剂、吸入药物制剂、舌下含服药物制剂或植入缓释药物制剂。

本发明的药物辅料是药物在制备或调配过程中所必需的、除ctrp3以外的物质。其不影响药物制剂中药物疗效、含量测定和稳定性；药物辅料的主要作用是方便制剂的制备和临床应用。

本发明具有防治病理性心肌肥厚，减少心肌细胞的凋亡，改善心脏功能方面以及延缓心衰发生的疗效。

附图说明

图1为重组人ctrp3蛋白的电泳图，1、marker；2、破碎沉淀；3、镍柱流穿液；4、100mm咪唑洗脱液；5、500mm咪唑洗脱液；6、重组人ctrp3蛋白。

图2为给予ctrp3对苯肾上腺素所致心肌细胞肥厚影响，a-c，细胞全蛋白免疫印迹典型图及统计图；d-e，细胞免疫荧光及细胞表面积统计。结果以均数±标准差表示，n＝6。与control组比较^ap<0.05；与pe组比较^aap<0.05。

图3为给予ctrp3对主动脉弓缩窄术后小鼠心功能影响，a-b，小鼠心脏/体重及肺脏/体重比值；c-f,小鼠心脏超声典型图及室间隔厚度、左室后壁厚度和心功能统计。与sham组比较^ap<0.05；与tac组比较^aap<0.05。

图4为给予ctrp3对主动脉弓缩窄术后小鼠心肌肥厚、纤维化的影响，a，心肌组织he染色；b-c，心肌组织masson染色；d-f，心肌细胞横截面积、纤维化程度统计；g-i，心肌组织免疫印迹典型图及统计图。与sham组比较^ap<0.05；与tac组比较^aap<0.05。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的阐述。实施例是对本发明进行详细说明而不是限定。

实施例1:ctrp3的表达、纯化及鉴定

根据人ctrp3基因序列(genbankaccessionnm_030945.3)开放阅读框序列，并根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，进行全基因合成(序列为：

atgcaccatcatcatcatcatcaggatgagtatatggagtctccacagaccggtggtctgccaccagattgctctaagtgctgtcatggtgattattcattcagaggttaccagggtccaccaggtccaccaggaccaccaggtatcccaggaaaccacggtaataacggtaacaacggtgccactggtcatgaaggtgccaaaggtgagaagggtgacaaaggtgatctgggtccacgtggtgaacgtggtcagcatggtccaaagggtgaaaagggttaccctggtattccccctgagctgcagatcgcttttatggcctctctggccacccatttctcaaaccagaactctggtattattttttcatctgtggaaaccaacattggtaacttcttcgacgtgatgaccggtcgtttcggtgctccagtgtctggtgtgtacttcttcaccttctctatgatgaagcatgaggacgtggaagaagtttacgtgtacctgatgcacaacggtaacaccgtgttctctatgtattcttatgaaatgaaaggtaaatctgacacctcttctaaccacgccgtgctgaaattggccaagggtgatgaggtgtggctgagaatgggtaacggtgccctgcacggtgatcatcagcgtttctctaccttcgccggtttcctgttgttcgaaaccaaataa)，将合成的基因连接于pet30a(+)的ecori和hindiii之间，采用iptg(终浓度1mm)进行16℃，200rpm过夜诱导表达，4000g离心收获菌体。超声破碎后，12000g离心取上清。上清经过镍柱亲和纯化，采用咪唑浓度梯度洗脱后，通过透析更换为pbs缓冲液，采用milliporeutral-15浓缩，除去内毒素后，即为重组人ctrp3蛋白(参见附图1)。

重组人ctrp3蛋白的氨基酸序列：

qdeymespqtgglppdcskcchgdysfrgyqgppgppgppgipgnhgnngnngatghegakgekgdkgdlgprgergqhgpkgekgypgippelqiafmaslathfsnqnsgiifssvetnignffdvmtgrfgapvsgvyfftfsmmkhedveevyvylmhngntvfsmysyemkgksdtssnhavlklakgdevwlrmgngalhgdhqrfstfagfllfetk。

实施例2：给予ctrp3可以减轻苯肾上腺素所致心肌细胞肥厚

临床上造成心肌肥厚的疾病有许多，最常见的原发性或继发性高血压，缺血性心脏病，瓣膜病等。体外心肌细胞肥厚模型多通过分离乳鼠心室心肌细胞，给予苯丙肾上腺素(pe)、异丙肾上腺素(iso)、血管紧张素ii(angii)等，诱导心肌细胞肥大。pe、iso或angii均能够特异性诱导心肌细胞肥大，排除成纤维细胞影响，模拟心肌细胞的肥大过程。本发明中，体外细胞研究采用pe刺激乳鼠心肌细胞，建立心肌细胞肥厚模型，进行说明。

心肌细胞分离培养：出生1-2天的sd大鼠，75％酒精消毒两次，在超净台内无菌条件下迅速取下心脏，在青霉素小瓶中剪碎，加入胰酶，轻轻吹打，37℃放置3-4min。弃去上清。向小瓶中加入胶原酶，并将心肌组织和胶原酶全部转移至另一装有转子的青霉素小瓶中，盖上盖子，置于放在37℃孵箱中的磁力搅拌器上，100r/min，转60min。取出澄清上层液体入3个盛有含血清培养基(dmem培养基，10％新生牛血清，青霉素100μ/ml，链霉素100μ/ml)的14ml离心管中。重复加入胶原酶，置于磁力搅拌器上，转45min。重复至组织完全消化。将3个离心管中的细胞悬液800r/min离心5min，弃上清。用含血清培养基(dmem培养基，10％新生牛血清，青霉素100μ/ml，链霉素100μ/ml)重悬细胞，用差数贴壁分离法将细胞置于培养箱中孵育2h，纯化心肌细胞。

心肌细胞肥厚模型建立：心肌细胞给予去氧肾上腺素(pe)最终浓度100μm，建立心肌细胞肥厚模型。治疗组给予重组ctrp3蛋白，最终浓度为5μg/ml和7μg/ml。进行蛋白免疫印迹(western-blot)检测肥厚相关指标、免疫荧光染色测定细胞表面积。

蛋白免疫印迹：用裂解液将细胞裂解并将细胞刮下，冰上裂解20min，随后4℃离心20min，取上清按4:1加入loading-buffer，沸水中煮10min。进行sds-page电泳并电转移至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜用含50g/l脱脂奶粉的tbst室温封闭1.5h，然后依次滴加1:1000的各种一抗，4℃过夜后tbst洗涤3次，每次10min。然后用1∶5000的igg二抗孵育2h，然后用tbst洗涤3次，每次10min。最后用ecl发光液进行曝光。

免疫荧光染色：原代心肌细胞种于共聚焦皿上，处理过后，pbs洗涤3min3次，用4％多聚甲醛4℃固定30min。pbs洗涤3min3次，滴加0.05％的tritonx-100穿孔10min，pbs洗涤3min3次。用1％牛血清白蛋白(bsa)室温封闭30min，α-actin一抗孵育过夜。冲洗并孵育辣根过氧化物酶(hrp)标记的二抗37℃2h后，pbs洗涤3min3次，加入dapi10min染细胞核，pbs洗涤3min3次。共聚焦显微镜下观察。每个处理组随机选取视野，并随机选取至少50个细胞。采用iamgej2x图像分析软件计算各组目标蛋白表达情况。

结果：细胞全蛋白免疫印迹结果显示肥给予ctrp3重组蛋白以后，无论是5μg/ml和7μg/ml，心肌肥厚指标anp、β-mhc的蛋白表达都较模型组(pe组)显著降低(p<0.05)(见附图2a-b)；细胞免疫荧光染色显示，给予ctrp3重组蛋白后，心肌细胞平均表面积较模型组(pe组)显著减小(p<0.05)(见附图2d-e)。这说明，在细胞水平，ctrp3能够减少心肌肥厚指标分子anp、β-mhc减少，减小心肌细胞平均表面积。综合来讲，ctrp3能够显著抑制病理性心肌肥厚，具有作为防治病理性心肌肥厚药物的潜能。

实施例3:给予ctrp3可以减轻小鼠心肌肥厚在体动物模型

c57bl/6小鼠(雄性，8周龄，体重20-25g)，通过吸入异氟烷麻醉，将其固定于手术台上。在动物呼吸机辅助通气下，剪断胸骨，分离组织，在显微镜下，在头臂干和左颈总动脉之间进行结扎缩窄，关胸排气，完成主动脉弓缩窄手术(tac手术)。治疗组腹腔按照0.25μg/g体重给予ctrp3重组蛋白。主动脉弓缩窄术后即开始给药。

生理指标检测：小鼠吸入异弗烷麻醉后，称取体重，固定于手术板，剪开颈部皮肤，分离右侧颈总动脉，剪断取血。迅速剪开胸腔并取下心脏，用预冷的pbs清洗，滤纸吸干心脏内残存pbs和血液，称重记录，同时取肺脏组织，称重记录。根据测得的数据，分别计算得出心体比(hw/bw)、肺体比(lw/bw)。

心脏超声检测：小鼠通过吸入异氟烷麻醉，将小鼠固定于超声检测台；调节麻醉机异氟烷吸入浓度，使小鼠心率稳定在400-500次/分；记录m型超声图像；分析左心室射血分数(lvef)、收缩期室间隔厚度(ivs；s)、舒张期左室后壁厚度(lvpw；d)等指标。

组织染色：小鼠取血后，剪开两侧肋骨，暴露心脏组织。心尖部灌注pbs清洗3次，随后灌注4％多聚甲醛，动脉夹夹住主动脉后从主动脉处剪下心脏，浸入4％多聚甲醛。经石蜡固定切片之后，进行he染色计算心肌细胞横截面积和masson染色计算心肌组织纤维化程度。

蛋白免疫印迹：用裂解液将细胞裂解并将细胞刮下，冰上裂解20min，随后4℃离心20min，取上清按4:1加入loading-buffer，沸水中煮10min。进行sds-page电泳并电转移至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜用含50g/l脱脂奶粉的tbst室温封闭1.5h，然后依次滴加1:1000的各种一抗，4℃过夜后tbst洗涤3次，每次10min。然后用1∶5000的igg二抗孵育2h，然后用tbst洗涤3次，每次10min。最后用ecl发光液进行曝光。

结果：tac术后6周，与tac组相比，给予ctrp3后，小鼠心体比(hw/bw)和肺体比(lw/bw)均显著下降(见附图3a-b)；与tac组相比，给予ctrp3后，心脏左心室收缩功能明显改善(lvef值显著升高)，收缩期室间隔厚度(ivs；s)和舒张期左室后壁厚度(lvpw；d)明显降低(见附图3c-f)；he染色显示，给予ctrp3后，心肌细胞横截面积显著缩小，心肌细胞排列更为紧密规则(见附图4a、d)；masson染色显示，给予ctrp3后，心肌组织间质纤维化程度显著降低(见附图4b、e)；给予ctrp3后，心肌组织微血管周围纤维化显著降低(见附图4c、f)；给予ctrp3后，心肌组织中anp和β-mhc显著降低(见附图4g-i)。这说明，动物层面，ctrp3能够：减少心肌肥厚指标分子anp、β-mhc，减小心肌细胞平均表面积，使得心肌细胞排列规则、紧密；减少心肌组织间质及微血管周围纤维化，减小收缩期室间隔厚度(ivs；s)和舒张期左室后壁厚度(lvpw；d)，改善左心室收缩功能。

以上所述结果说明ctrp3具有显著的抗病理性心肌肥厚，延缓心衰发生的作用。

核苷酸序列表电子文件

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>ctrp3用于制备预防治疗心肌肥厚药物的应用

<141>

<160>

<210>1

<211>696

<212>dna

<213>ctrp3基因序列

<220>

<223>

<400>1

atgcaccatcatcatcatcatcaggatgagtatatggagtctccacagaccggtggtctgccacc

agattgctctaagtgctgtcatggtgattattcattcagaggttaccagggtccaccaggtccac

caggaccaccaggtatcccaggaaaccacggtaataacggtaacaacggtgccactggtcatgaa

ggtgccaaaggtgagaagggtgacaaaggtgatctgggtccacgtggtgaacgtggtcagcatgg

tccaaagggtgaaaagggttaccctggtattccccctgagctgcagatcgcttttatggcctctc

tggccacccatttctcaaaccagaactctggtattattttttcatctgtggaaaccaacattggt

aacttcttcgacgtgatgaccggtcgtttcggtgctccagtgtctggtgtgtacttcttcacctt

ctctatgatgaagcatgaggacgtggaagaagtttacgtgtacctgatgcacaacggtaacaccg

tgttctctatgtattcttatgaaatgaaaggtaaatctgacacctcttctaaccacgccgtgctg

aaattggccaagggtgatgaggtgtggctgagaatgggtaacggtgccctgcacggtgatcatca

gcgtttctctaccttcgccggtttcctgttgttcgaaaccaaataa

<210>2

<211>224

<212>氨基酸

<213>ctrp3氨基酸序列

<220>

<223>

<400>2

qdeymespqtgglppdcskcchgdysfrgyqgppgppgppgipgnhgnngnngatghegakgekg

dkgdlgprgergqhgpkgekgypgippelqiafmaslathfsnqnsgiifssvetnignffdvmt

grfgapvsgvyfftfsmmkhedveevyvylmhngntvfsmysyemkgksdtssnhavlklakgde

vwlrmgngalhgdhqrfstfagfllfet