一种多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药的制备方法与流程

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药的制备方法及其在药物治疗癌症领域的应用。

背景技术：

β-环糊精(β-CD)由于良好的生物相容性和生物降解能力，常被用作引发剂通过可逆加成-断裂链转移聚合反应或原子转移自由基聚合反应制备星型聚合物。喜树碱（Camptothecin, CPT，化学结构式：C20H16N2O4，CAS号：7689-03-4，相对分子量：348.43）是一种从中国中南、西南分布的喜树中提取得到的植物抗癌药。对肠胃道和头颈部癌等有较好的疗效。喜树碱属于细胞毒性喹啉类生物碱，能抑制DNA拓扑异构酶(TOPO I)。阿霉素（Doxorubicin,DOX，化学结构式：C7H29NO11，CAS号：23214-92-8，相对分子量：543.52）是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各个周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。

由于喜树碱和阿霉素药物分子尺寸较小且水中溶解度极低，因此在药物递送过程中面临非特异选择性差、药物利用率较低、肾清除率较高以及毒副作用较强等问题，因此提高其水溶性和保护其生物活性具有重要的科学意义。聚合物前药递送系统可有效结合聚合物药物与纳米系统的技术优点，通过引入双硫键和具有酸刺激响应的基团，可选择性的将药物递送至肿瘤部位，在降低毒副作用的同时发挥药效。相比于传统聚合物前药，基于β-环糊精所合成的星形前体药物，可同时携带两种抗癌药物进入体内，药物上载量高并实现可控释放，具有协同抗肿瘤作用，并降低对健康组织的伤害。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一是针对现有单分子抗肿瘤药物选择性差，不可控释放，药物上载率低，治疗效果差等缺陷，提供一种多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药的制备方法及其在药物治疗癌症领域的应用。

本发明具体技术方案如下

一种多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）制备还原性响应的喜树碱前驱体CPT-SS,其反应式如式(I)所示，包括以下步骤：（i）在氩气(Ar, 2-10Pa)氛围条件下，将2-羟乙基二硫化物（BHD）、无水四氢呋喃（THF）、三乙胺(TEA)混合得到溶液，再向上述溶液中逐滴滴加无水THF溶解的甲基丙烯酰氯溶液，混合搅拌反应24-72h，柱提纯得到2-（（2-hydroxyethyl）disulfanyl）ethyl methacrylate(简称为MABHD)；(ii)将喜树碱（CPT）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）的混合物分散到无水二氯甲烷（DCM）中，并向其中逐滴滴加含有三光气（BTC）的无水DCM溶液，反应0.5-1h，再滴加入含有MABHD的无水THF溶液，搅拌反应24-72h，提纯得到前驱体CPT-SS；

式（I）

（2）制备药物引发剂β-CD-Br，包括以下步骤：在氩气（Ar，2-10Pa）氛围下，将溶于无水N-甲基吡咯烷酮（NMP）的2-溴代异丁酰溴溶液滴加到冷却至0℃的含有环糊精（CD）的无水NMP溶液中，在0℃条件下反应2小时后再在室温下反应48小时，纯化得到产物β-CD-Br；

（3）多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药β-CD-P(CPT-co-DPA-co-OEGMA)（简称CCDO）的制备，其反应式如式（）所示，包括以下步骤：在氩气(Ar，2-10Pa)氛围下，将步骤（2）得到的β-CD-Br和步骤（1）得到的CPT-SS以及DPA和OEGMA溶于二甲基亚砜（DMSO）溶液，随后向体系中加入溴化亚铜（CuBr），进行冷冻-抽气-解冻，循环3次后，加入配体三-（2-甲氨基乙基）胺（Me6TREN），再重复冷冻-抽气-解冻1次，在25℃避光反应24-72h，然后将产物溶液用THF稀释后用Al2O3 过滤除去催化剂，所得溶液在甲醇溶液中透析24h，旋蒸浓缩后，将产物固体从乙醚中沉淀出来，真空干燥后得到多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药CCDO；

式（II）

（4）多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药的胶束制剂的制备，包括以下步骤：在室温（25℃）下，取一定量步骤（3）得到的CCDO和适量的DOX、TEA溶于适量的DMF中，避光搅拌过夜，再在搅拌下逐滴滴加到一定量的水中，搅拌5~60min，用水透析除去有机溶剂便得到球状的纳米胶束水溶液，即得到多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药的胶束制剂。

进一步，所述的步骤（1）(i)中，BHD、甲基丙烯酰氯和TEA三者物质的量比为2:1:1; 所述的含甲基丙烯酰氯的THF溶液的制备过程为甲基丙烯酰氯分散于无水THF中，质量浓度范围为216-108mg/mL；体系中THF与TEA加入体积比为15:1-20:1；加药顺序依次为BHD、THF、TEA、含甲基丙烯酰氯的THF溶液。

进一步，所述的步骤（1）(ii)中，CPT和DMAP的混合溶液中，CPT的质量浓度在15-25 mg/mL；体系中，CPT、DMAP、BTC和MABHD四者物质的量之比为2.4:6.7:1:1.4；其中BTC需先溶于无水DCM中(质量浓度范围为40-60mg/mL)，再缓慢滴加至CPT和DMAP的混合溶液中；MABHD也需先溶于无水THF中（质量浓度范围为80-120 mg/mL），再缓慢滴加至体系中；加药顺序依次为CPT、DMAP、DCM、BTC的DCM溶液、MABHD的THF溶液。

进一步，所述的步骤（2）中，引发剂（β-CD-Br）的具体制备过程为：在氩气（Ar，2-10Pa）氛围下，将环糊精（CD）溶于无水N-甲基吡咯烷酮（NMP）溶液中，冷却至0℃，再将事先溶于无水NMP的2-溴代异丁酰溴溶液滴加到搅拌中的含有β- CD的无水NMP溶液中，在0℃条件下反应2小时后再在室温下反应48小时，纯化得到产物β-CD-Br。

进一步，所述的步骤（3）中，药物单体CPT-SS、DPA、OEGMA、引发剂β-CD-Br、催化剂CuBr和配体Me6TREN的物质的量比为5：10：15：1：1：1。

进一步，所述步骤（4）中，CCDO与DOX的物质的量之比约为（100~1）：1；有机溶剂和水的体积比为1：（3~1000），用水透析后所得到的球状纳米胶束的粒子直径为10~1000nm。

本发明的主要优点在于：

1. 针对目前单分子前药递送系统存在的问题，本项目创造性地提出一种多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药及其胶束制剂的递送系统，能负载两种抗癌药物，发挥协同治疗作用，有效提高药物上载量和治疗效果，并能够选择性释放，解决当前单分子前药递送系统药物治疗效果差、靶向可控释放的问题，推动肿瘤的精确诊断与高效治疗。

2.本项目中，两亲性有助于药物粒子延长体内循环时间，小尺寸的纳米结构有助于药物快速进入细胞，增强细胞内化，也是本项目的最大特色之一。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为实施例1中一种多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药CCDO的合成示意图

图2为实施例1中一种多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药CCDO的核磁示意图

图3为实施例1中一种多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药CCDO的GPC曲线、紫外吸收谱图、荧光谱图以及CCDO在THF相的TEM图和DLS示意图

图4为实施例1中一种多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药CCDO胶束和CCDO/DOX载药胶束的体外释药示意图以及对HeLa 和MCF-7细胞的毒性对比图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 制备多刺激响应的星形聚合物前药CCDO

（1）制备还原性响应的CPT前驱体CPT-SS：在氩气(Ar)氛围条件下，①将2-羟乙基二硫化物（BHD，6.25g, 40.5mmol）、四氢呋喃（THF, 50mL）和三乙胺(TEA, 3.3mL, 24mmoL)混合搅拌，甲基丙烯酰氯（2.2mL, 22.73mmoL）溶于15 mL无水THF中并逐滴滴加至体系中，反应过夜，柱提纯得到MABHD；②将CPT（1.39g, 4mmoL）、4-二甲氨基吡啶（DMAP, 1.56g, 11.3mmoL）的混合物分散到70mL 无水DCM中，三光气（BTC，500mg,1.685mmoL） 溶于10 mL无水DCM中，再逐滴滴加至体系中，反应30min后，再将含有MABHD（976mg, 2.375mmoL）的10 mL无水THF逐滴滴加至体系中, 搅拌过夜，提纯得前驱体CPT-SS；

（2）制备药物引发剂β-CD-Br：在氩气（Ar，2-10Pa）氛围下，将环糊精（CD）溶于无水N-甲基吡咯烷酮（NMP）溶液中，冷却至0℃，再将事先溶于无水NMP的2-溴代异丁酰溴溶液滴加到搅拌中的含有β- CD的无水NMP溶液中，在0℃条件下反应2小时后再在室温下反应48小时，纯化得到产物β-CD-Br；

（3）多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药CCDO的制备，包括以下步骤：在氩气(Ar，2-10Pa)氛围下，将步骤（2）得到的β-CD-Br和步骤（1）得到的CPT-SS以及DPA和OEGMA溶于二甲基亚砜（DMSO）溶液，随后向体系中加入溴化亚铜（CuBr），进行冷冻-抽气-解冻，循环3次后，加入配体三-（2-甲氨基乙基）胺（Me6TREN），再重复冷冻-抽气-解冻1次，在25℃避光反应24-72h，然后将产物溶液用THF稀释后用Al2O3 过滤除去催化剂，所得溶液在甲醇溶液中透析24h，旋蒸浓缩后，将产物固体从乙醚中沉淀出来，真空干燥后得到多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药CCDO；

（4）多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药的胶束制剂的制备，包括以下步骤：在室温（25℃）下，取一定量步骤（3）得到的CCDO和适量的DOX、TEA溶于适量的DMF中，避光搅拌过夜，再在搅拌下逐滴滴加到一定量的水中，搅拌5~60min，用水透析除去有机溶剂便得到球状的纳米胶束水溶液，即得到多刺激响应的协同抗肿瘤聚合物前药的胶束制剂。其DLS结果（图3E,F）显示前药纳米胶束CCDO的水合粒径为13.95 nm，分散系数为0.251，而载有DOX的纳米胶束CCDO/DOX的水合粒径为69.39nm，分散系数为0.191。图3D是所得纳米粒子CCDO的TEM形貌图。图4A是纳米前药CCDO在不同浓度的DL-二硫苏糖醇（DL-DTT）溶液中的体外释放对比图。图4B是纳米前药CCDO/DOX在不同pH条件下的体外释药对比图。图4C和图4D是胶束CCDO和CCDO/DOX对HeLa与MCF-7肿瘤细胞作用24h和48h的体外毒性对比示意图。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。