本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种高酶活淀粉酶的表达方法。
背景技术
淀粉酶是酶制剂中用途最广、消费量最大的一种。主要用于面包生产中的面团改良(降低面团粘度、加速发酵进程、增加糖含量、缓和面包老化)；婴幼儿食品中谷类原料的预处理；啤酒制造；工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生物制剂等多种领域。米曲霉被美国fda及世界卫生组织列为食品级安全菌株(gras)，是工业上淀粉酶的重要来源。通过基因敲除手段选育出更高酶产量的米曲霉，有助于米曲霉在工业上更好的应用。
淀粉是自然界最丰富的原料之一，是人类食物的重要成分，淀粉很容易从植物中获得，价格低廉。淀粉利用的关键是通过淀粉酶降解为可发酵的葡萄糖等可发酵性糖。根据作用的方式可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山萮菜)及微生物中。
米曲霉应用历史悠久，随着人类发展生活所需，获得高产淀粉酶的菌株，降低淀粉酶的生产成本成为淀粉酶工业化利用的必由之路，选育优良的菌株是酶制剂产业的核心问题。米曲霉相对于植物和哺乳动物具有较强的蛋白质分泌、合成能力以及快速生长，易培养等优点，与大肠杆菌和酵母相比也具有强大的翻译后修饰功能，被认为是生产淀粉酶最有应用前景的菌株之一。目前获得优良的高产量菌株，通常采用诱变和基因工程构建基因工程菌株等方法。诱变方法简单成本低，但是具有一定的随机性，因此基因工程技术手段是未来选育高产量菌株的一个有效方法，特别的米曲霉的全基因组的破译更促进了基因工程技术的应用。发展安全、通用、高效、规模化表达系统，是全面提高酶制剂产业技术水平的战略必争之地，对于酶制剂产业实现变革性突破具有十分重要的意义。
米曲霉中淀粉酶转录激活因子amyr在淀粉或麦芽糖的诱导下会激活下游淀粉酶的表达，而crea和creb参与调控淀粉酶转录因子amyr的表达。米曲霉淀粉酶生产的瓶颈在于：在米曲霉培养后期存在着反抑制调控，其会抑制米曲霉淀粉酶的生产，虽然这方面有研究通过删除单crea和双crea/creb基因片段，一定程度上提高了在高浓度培养后期的淀粉酶活性，但效果不是很明显。
技术实现要素：
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种高酶活淀粉酶的表达方法，通过同源重组将米曲霉中的ao090701000363基因用选择标记基因pyrg代替，从而获得ao090701000363敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种高酶活淀粉酶的表达方法，先敲除米曲霉中的ao090701000363基因，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，获得高酶活淀粉酶。
所述的高酶活淀粉酶的表达方法，通过同源重组将米曲霉中的ao090701000363基因用选择标记基因pyrg代替，从而实现ao090701000363敲除。
所述的高酶活淀粉酶的表达方法，具体步骤如下：
1)利用primestarpcr聚合酶扩增并获得ao090701000363基因两侧片段和pyrg基因；
2)将ao090701000363基因两侧片段与pyrg基因融合；
3)将融合基因转化入e-f1菌株，利用选择性培养基进行至少两次分离纯化，然后提取基因组，进行southernblot鉴定；
4)培养阳性菌株，获得高活性淀粉酶。
步骤1)中，ao090701000363基因两侧片段为：ao090701000363l，基因序列如seqidno.1所示，ao090701000363r，基因序列如seqidno.2所示；pyrg基因的序列如seqidno.3所示。
步骤1)中，pcr体系：25μl的primestarmix酶；上游引物、下游引物各2μl；1μla.oryzaerib40基因组dna；加入水至50μl；具体引物序列见下表：
步骤1)中，pcr条件：98.0℃10s；98.0℃10s，55.0℃15s，72.0℃2min20s，35次循环；72.0℃5min；16.0℃保存。
步骤2)中，利用fusionpcr进行融合，基因加入摩尔浓度比：ao090701000363l∶pyrg∶ao090701000363r＝1∶3∶1。
步骤2)中，pcr体系：primestarmix25μl；上游引物，下游引物各加2μl；按浓度比加入模板；加水定容至50μl。
步骤2)中，两步法：98.0℃10s；98.0℃10s，68.0℃4min，35cycles；72.0℃5min；16.0℃保存；
三步法：98.0℃10s；98.0℃10s，55.0℃15s，72.0℃4min，35cycles；72.0℃5min；16.0℃保存。
步骤3)中，转化过程如下：solution1，使用0.45μm过滤灭菌到新的50ml灭菌tube中；将培养的米曲霉用漏斗过滤，用水冲一下把培养基冲走，用药匙挤一下把水挤下；用药匙把菌体放入1中配置的solution0+1中，用封条裹上tube，30℃50rpm3h；制冰；过滤，取液体；加solution210ml，上下混合；将tube取出在4℃下离心2000rpm8min，取沉淀；加5mlsolution2混匀4℃下离心2000rpm8min上清液丢弃；视沉淀量加solution2，分装各200μl×4；分别加10μl质粒，用一次性吸管混匀；放冰上30min，在此期间将cd选择培养基放微波炉溶后，倒入50ml的tub中，放45℃中保温；30min后分3次加入solution3：250μl混匀；250μl混匀；850μl混匀；在室温中放置20min；加入5mlsolution2混匀后4℃下离心2000rpm8min将上清液丢弃；加入500μlsolution2混匀，加入10mlcd上层培养基混匀后倒平板；在cd培养基30℃环境下3-5天避光培养。
有益效果：与现有技术相比，本发明通过同源重组将米曲霉中的ao090701000363基因用选择标记基因pyrg代替，从而获得ao090701000363敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶，试验结果证实：ao090701000363的缺失显著提高了米曲霉淀粉酶的活性，第3天，ao090701000363敲除菌株的淀粉酶活性是参照菌株的1.5倍，并且在后期培养中，敲除菌株的酶活性均高于对比菌株2倍之多。
附图说明
图1是ao090701000363基因敲除原理图；
图2是基因片段的0.8％琼脂糖凝胶电泳图；
图3是融合基因的0.8％琼脂糖凝胶电泳图；
图4是southernblot验证结果图；
图5是米曲霉淀粉酶酶活性测定图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
一种高酶活淀粉酶的表达方法，流程图如图1所示，通过同源重组将米曲霉中的ao090701000363基因用选择标记基因pyrg代替，从而获得ao090701000363敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶，图中标出的smai酶切位点及probe探针位置用于southernblot验证。具体步骤如下：
1)利用primestarpcr聚合酶(takara，japan)扩增ao090701000363基因两侧片段(ao090701000363l，基因序列如seqidno.1所示；ao090701000363r，基因序列如seqidno.2所示)和pyrg基因(基因序列如seqidno.3所示)，主要过程如下：
pcr体系：25μl的primestarmix酶；上游引物、下游引物各2μl(具体引物序列见表1)；1μla.oryzaerib40(日本(财团法人)野田产业科学研究所赠送)基因组dna；加入水至50μl。
表1具体引物序列
pcr条件：98.0℃10s；98.0℃10s，55.0℃15s，72.0℃2min20s，35次循环；72.0℃5min；16.0℃保存。
2)电泳确定，结果如图2所示，图中三条条带：依次为ao090701000363基因orf的左侧序列(l)、ao090701000363基因orf的右侧序列(r)、pyrg选择标记基因，大小分别约1kb、1kb、2.2kb，说明扩增成功。
3)纯化电泳凝胶中dna
利用kit：takaraminibestagarosegeldnaetractionkit(takara，japan)切胶提取dna，主要过程如下：
准备：将干热恒温仪设定至37℃。将胶切碎加入1.5ml微量离心管中，加3倍量的buffergm混匀，37℃，10min(中途可拿出涡旋，以便更快溶解)；将spincolumn放到collectiontube中，将上述中溶液用移液枪移到spincolumn中。12000rpm离心1min，离心结束后将下面的液体移除；加700μlbufferwb到column中。12000rpm离心30s。离心结束后将下面的液体移除，重复该步骤；空转12000rpm离心1min；将spincolumn放入新的1.5ml的tube中。加30μl水/elutionbuffer中，在室温下静置1min；12000rpm离心1min。
4)ao090701000363基因两侧片段与pyrg基因融合
利用fusionpcr进行融合，基因加入摩尔浓度比：ao090701000363l∶pyrg∶ao090701000363r＝1∶3∶1。
pcr体系：primestarmix25μl；上游引物，下游引物各加2μl(具体引物序列见表1)；按浓度比加入模板；加水定容至50μl。
两步法：98.0℃10s；98.0℃10s，68.0℃4min，35cycles；72.0℃5min；16.0℃保存。
三步法：98.0℃10s；98.0℃10s，55.0℃15s，72.0℃4min，35cycles；72.0℃5min；16.0℃保存。
5)电泳确认，结果如图3所示，图中：ao090701000363基因两侧片段与pyrg基因融合片段约4.2kb，电泳图中出现4.2kb片段说明融合成功。将此片段通过使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkit(takara，japan)纯化凝胶中dna，用于转化。
6)转化
准备：solution0(50mmmaleatebufferph5.5)；solution2(1.2msorbitol，50mmcacl2，35mmnacl，10mmtris-hclph7.5)：solution3(60％peg4000，50mmcacl2，10mmtris-hclph7.5)；cd上层培养基(cd培养基+1.2msorbitol+0.8％agar)；cd选择培养基(0.3％nano3，0.2％kcl，0.1％kh2po4，0.05％mgso4·7h2o，0.002％feso4·7h2o，2％glucose，ph5.5)；ypd液体培养基。
前培养：ypd液体培养基培养e-f1菌株(δku70：：ptra，δaf，δpyrg，由日本(财团法人)野田产业科学研究所赠送)，30℃，150rpm，18-24h。
转化实验：solution1(0.1％yatalase，0.6m(nh4)2so4，加入10mlsolution0)，使用0.45μm过滤灭菌到新的50ml灭菌tube中；将培养的米曲霉用漏斗过滤，用水冲一下把培养基冲走(菌体白色)，用药匙挤一下把水挤下；用药匙把菌体放入1中配置的solution0+1中，用封条裹上tube，30℃50rpm3h(原生质体化)；制冰；过滤(使用一次性)，取液体；加solution210ml，上下混合；将tube取出在4℃下离心2000rpm8min(上升速率调至3’)，取沉淀；加5mlsolution2混匀4℃下离心2000rpm8min上清液丢弃；视沉淀量加solution2(1-5×107加1ml)，分装各200μl×4；分别加10μl质粒(不超过15μl)，用一次性吸管混匀；放冰上30min，在此期间将cd选择培养基放微波炉溶后，倒入50ml的tub中，放45℃中保温；30min后分3次加入solution3：250μl混匀；250μl混匀；850μl混匀。在室温中放置20min；加入5mlsolution2混匀后4℃下离心2000rpm8min将上清液丢弃；加入500μlsolution2混匀，加入10mlcd上层培养基混匀后倒平板；在cd培养基30℃环境下3-5天避光培养；
7)利用选择性培养基(cd)进行至少两次分离纯化，然后提取基因组，过程如下：
准备：加nucleilysissolution(600μl)核酸溶出液。液氮处理，研钵研磨放入1.5ml的tube中；干式恒温器65℃处理15min，取出后冷却到手温；加3μlrnasea37℃30-60min水解rna；加200μlproteinprecipitationsolution上下翻转混合20s去除蛋白质；离心12000rpm3min将上清液移到新的1.5mltube中；600μlpci处理(戴手套)上下翻转混合进一步去除蛋白质等杂质(phenol(苯酚)∶chloroform(氯仿)∶isoamylalcohol(异戊醇)25∶24∶1)；离心12000rpm3min取上清液；加600μlisopropanol异丙醇沉淀基因；离心12000rpm5min除去上清液取沉淀；600μl70％乙醇清洗12000rpm5min除去上清液取沉淀；12000rpm离心1min除去上清液，风干10min；加100μlte溶液。
8)southernblot
通过southern印迹分析鉴定转化菌株，提取米曲霉菌株的基因组dna，电泳后，将消化的基因组dna转移到hybond-n+膜(amershambiosciences，amersham，uk)上，进行southern杂交(takahashi等，2004)，使用pcrdig标记试剂盒(rochediagnostics，mannheim，德国)构建地高辛配基(dig)标记的探针，根据说明书(rochediagnostics)进行dig系统的信号杂交和检测，结果如图4所示，m为marker(λdna/hindiii)；1为对照菌株；2、3、4均为转化株。对照株基因组dna用bglii酶切后与探针反应的片段约为4.4kb；ao090701000363基因成功敲除的菌株基因组dna被bglii酶切后与探针反应的片段约6.1kb。
实施例2淀粉酶活性测定
将实施例制备的2号转化株，以control：将pyrg导入e-f1(δku70：：ptra，δaf，δpyrg)得到的菌株作为参照菌株，接入ypd液体培养基，45ml/瓶；分生孢子数：105，30℃，150rpm条件下进行培养，3个重复。测酶活天数：2，3，4，5d。
使用淀粉酶(ams)测试盒淀粉-碘比色法(上海纪宁)测定ypd培养基中的淀粉酶活性。
结果见图5，control：将pyrg导入e-f1(δku70：：ptra，δaf，δpyrg)得到的菌株作为参照菌株；δ363：ao090701000363敲除菌株。ao090701000363的缺失显著提高了米曲霉淀粉酶的活性，第3天，ao090701000363敲除菌株的淀粉酶活性是参照菌株的1.5倍左右，后续两天缺陷株的活性是参照菌株的2倍之多。
序列表
<110>南京林业大学
<120>一种高酶活淀粉酶的表达方法
<130>100
<160>9
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1118
<212>dna
<213>aspergillusoryzae
<400>1
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