GMFB抗体作为制备糖尿病视网膜病治疗药物的应用的制作方法

本发明涉及抗体gmfb的用途，尤其是涉及gmfb抗体作为制备糖尿病视网膜病治疗药物的应用。

背景技术

随着我国经济的高速发展和老龄化进程的加速，糖尿病(diabetesmilletus，dm)的患病率正呈快速上升的趋势，成为继心脑血管疾病和肿瘤之后另一个严重危害人民健康的重要慢性非传染性疾病。世界卫生组织推测，在2025年中国糖尿病患者将达到3亿。糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,dr)，简称糖网病，是糖尿病最常见的并发症，在dm患者中1/3发生dr，1/10发生致命性威胁视力的糖尿病黄斑水肿(diabeticmacularedema,dme)或者增殖性糖网病(proliferativediabeticretinopathy,pdr)，严重影响患者生活质量，世界范围内dr已经成为显著的社会负担和社会问题。

dr曾被认为是视网膜的微血管病变，微循环损害是dr的经典标志，但是越来越多的证据提示在dr的病理过程中神经变性是一个早期事件，并参与微血管异常的发展。组织学上神经元凋亡和反应性的胶质化是dr神经变性的最重要的特征。目前dm捐献眼在眼科检查没有发现任何微循环异常，但是已经具有主要的神经变性的特点。视网膜节细胞(rgc)是dr最先被检测的发生凋亡的细胞；rgc丢失导致神经纤维层变薄，在dm患者或者有轻微dr的dm患者通过oct检测都检测到，在没有任何微血管病变的dmi型和ii型病人发现erg(electroretinogram，视网膜电流图)异常。神经元凋亡伴随着muller胶质细胞的变化。目前尚不清楚神经元凋亡和胶质化哪一个在dr中是第一个发生的事件。研究dr神经变性的机制及鉴定在神经变性的介导者对于研发新的治疗策略是非常必要的。从临床角度早期鉴别神经变性对于基于神经保护的药物的应用是必须的。

dr神经变性的机制研究现状：介导dr神经变性的主要机制有细胞外兴奋毒性谷氨酸(glutamate，glu)集聚、氧化应激增加、视网膜分泌保护因子的减少及慢性炎症。schellinsa等用光镜和电镜检测发现，dm早期muller细胞核已发生改变，而视网膜血管内皮细胞、周细胞并未见明显病理改变，dm早期视网膜muller细胞的超微结构和生理功能已发生变化，不仅影响早期dm患者神经细胞功能异常(表现为视觉敏感度及色觉敏感度下降，视网膜振荡电位b波异常)，而且影响整个dr的进展过程。在研究介导dr神经变性的分子中，我们更关注muller细胞产生的分子。

胶质细胞成熟因子beta(gliamaturationfactorbeta,gmfb)是一个小分子蛋白质，最早从牛脑分离纯化的17kd酸性胞浆蛋白，进化上高度保守，在中枢神经系统主要由星形胶质细胞产生，对脑组织生长、分化和再生有重要的作用，其表达在发育期上调，成年明显降低。在大鼠视网膜gmfb仅在muller细胞表达，从胚胎14天到成年均表达。新近研究显示gmfb是一种促炎因子，与人中枢神经系统退行性疾病密切相关，如阿茨海默病和帕金森病。gmfb基因敲除小鼠能够抵抗实验性自身免疫性脑炎和mptp的毒性。

目前用于dr进展相关的细胞因子包括以下4类：(1)与调节自然免疫有关的因子，如il-1b和il-10；(2)调节淋巴细胞激活增殖和分化的因子，如il-6和il-12；(3)与激活巨噬细胞相关的因子，如tnfa和tgfb；(4)趋化因子，如mcp-1和sdf-1等。

中国专利cn105154527a公开了gmfb的应用、gmfb干扰剂及gmfb干扰剂的应用，专利中公开gmfb作为糖尿病视网膜病变早期诊断以及病程进展的生物标记物的应用、gmfb作为糖尿病视网膜病变治疗靶点的应用、gmfb干扰剂及gmfb干扰剂的应用。该专利证实在stz-诱导的i型糖尿病(tidm)大鼠中，在发病早期gmfb在玻璃体含量显著升高。证实随着dr的病情进展，gmfb含量逐渐下降，可以用动态检测dr进展；证实干扰dr大鼠gmfb表达，可以保护视功能。证实gmfb介导视网膜变性的机制，包括引起muller细胞的谷氨酰胺合酶降低，导致节细胞死亡，并诱导光感受器细胞引起自噬。

技术实现要素：

本发明的目的是提供gmfb抗体作为制备糖尿病视网膜病治疗药物的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供gmfb抗体作为制备糖尿病视网膜病变治疗药物的应用。

在本发明的一个实施案例中，所述gmfb抗体作为制备减弱视网膜细胞胶质化的药物的应用。

在本发明的一个实施案例中，所述gmfb抗体作为制备降低gfap表达的药物的应用。

在本发明的一个实施案例中，gmfb抗体作为制备糖尿病视网膜病变早期神经保护治疗药物的应用。

在本发明的一个实施案例中，所述gmfb抗体作为制备玻璃体腔注射药剂或滴剂的应用。

本发明还提供gmfb抗体作为制备保护和/或改善视功能的药物的应用。

在本发明的一个实施案例中，所述gmfb抗体作为制备玻璃体腔注射药剂或滴剂的应用

所述神经保护包括视网膜细胞的胶质化反应减弱，视网膜细胞凋亡受到抑制。

本发明利用玻璃体腔注射技术为stz诱导dm大鼠右眼注射gmfb抗体，左眼注射等量pbs，两周后使用erg法检测大鼠双眼视觉功能的差异，发现注射gmfb抗体的眼球与未注射gmfb抗体的眼球相比，视功能有明显的改善。然后发现，在注射gmfb抗体的眼球视网膜中，gfap(muller细胞胶质化的标志物)的表达明显下调，且检测细胞凋亡的tunel染色也有所减弱，这说明玻璃体腔内注射gmfb抗体可作为dr早期干预的靶向，从而保护视功能。

本发明首次证实gmfb抗体注射入大鼠玻璃体腔内可以保护和改善dr大鼠的视功能以及减弱视网膜细胞的胶质化。

中国专利cn105154527a是针对于gmfb基因的操作(降低gmfb的mrna表达水平)和gmfb作为早期糖尿病视网膜病变的生物标记物的应用。而本申请则为gmfb抗体的应用，抗体本质是蛋白，对gmfb蛋白内源性的表达没有影响。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)在dr大鼠发病第一天经玻璃体腔内注射gmfb抗体，胶质化反应减弱；

(2)在dr大鼠发病第一天经玻璃体腔内注射gmfb抗体，功能性方法erg可证明视功能有显著改善，tunel检测细胞凋亡受到抑制，从而证明gmfb抗体发挥神经保护的作用。

附图说明

图1：玻璃体腔内注射gmfb抗体两周后stz大鼠的erg波形图；

图2：玻璃体腔内注射gmfb抗体两周后stz大鼠的erg波形b值；

图3：westernblot检测玻璃体腔内注射gmfb抗体两周后stz大鼠视网膜内gmfb的表达情况；

图4：qpcrt检测玻璃体腔内注射gmfb抗体两周后stz大鼠视网膜内gmfb的表达情况；

图5：免疫荧光检测玻璃体腔内注射gmfb抗体两周后stz大鼠视网膜内gmfb的表达情况；

图6：westernblot检测玻璃体腔内注射gmfb抗体两周后stz大鼠视网膜内gfap的表达情况；

图7：qpcrt检测玻璃体腔内注射gmfb抗体两周后stz大鼠视网膜内gfap的表达情况；

图8：免疫荧光检测玻璃体腔内注射gmfb抗体两周后stz大鼠视网膜内gfap的表达情况；

图9：tunel试剂盒检测玻璃体腔内注射gmfb抗体两周后stz大鼠视网膜细胞凋亡情况；

图10：tunel试剂盒检测玻璃体腔内注射gmfb抗体两周后stz大鼠视网膜细胞凋亡情况，计数细胞的凋亡个数。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

以下实施例中，sd大鼠购自史莱克，gmfb抗体购自proteintech，stz购自翊圣。

实施例1：玻璃体腔内注射gmfb抗体改善dr大鼠视功能。

(1)糖尿病大鼠制备：采用雄性sd大鼠，160-180g，实验前先将大鼠饥饿24小时。单次腹腔内注射stz(60mg/kg体重)来诱发dm，正常对照组腹腔注射等体积的柠檬酸溶液；24小时后断尾取血测血糖，血糖值低于250mg/dl的大鼠补充注射stz。连续3天测血糖。将血糖连续3天超过250mg/dl的大鼠确定为dm大鼠(血糖低于250mg/dl的大鼠将被排除)。

(2)注射gmfb抗体：在stz-tidm大鼠发病当天，右眼玻璃体腔内注射gmfb抗体10ul(浓度：10ug/150ul.)，左眼注射等量pbs缓冲液作为对照。在注射后2周检测erg、gmfb和gfap的表达以及凋亡情况。

实施例2：erg检测。

aps全自动视觉电生理检查仪(aps-2000)购于重庆康华科技有限公司。

(1)视觉电生理功能检查前一天，把dm大鼠转移到暗房，进行暗适应。

(2)大鼠的准备：向大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠(1ml/500g体重)进行麻醉，1×速眠新(0.1ml/200g)让眼球突出，然后给予一滴0.5％托吡卡胺散瞳(wuxishanhegroup，jiangsu，china)，一滴0.4％盐酸奥布卡因表面麻醉(eisaicoltd，tokyo，japan)，每只眼睛各涂一点导电膏。

(3)插电极：地线接大鼠尾巴上，负极接大鼠两耳朵之间，正极接两眼睛角膜上，注意不要触到眼睑和巩膜上。

(4)打开软件“视觉电生理图”，点“ferg”，再点1,2通道，一个为左眼通道，另一个为右眼通道，点“设置”，刺激次数为2次，刺激频率为0.05hz；依次点击刺激强度(1)―0.0006325(cd*s/m)、(5)―0.006325(cd*s/m)、(9)―0.06325(cd*s/m)，每次强度至少间隔2min。点“示波”，待波的基线平稳时，点击“采集”，等听到“嘀”的一声后，采集完毕，点击“保存”。再点击“设置”，修改文档号和刺激强度，依次类推。等所有强度做完后，换下一只大鼠。所有大鼠做完后，打开“文件”，进行标定，双击曲线，曲线变为白色，点击“标定”。标定完a波后，按空格键，标定b波。所有标定完毕，点击“打印”，保存为.pdf格式。点击左下角按钮，退出软件，关闭电脑，关闭放大器。

在玻璃体腔注射gmfb抗体后第2周、进行erg检测，图1和2显示注射gmfb抗体的右眼和注射pbs作为对照的左眼有显著差异，注射gmfb抗体的右眼b波波值明显升高，与正常大鼠在同一水平，说明在眼球玻璃体腔注射gmfb抗体对糖尿病大鼠的视功能有保护作用。

实施例3：用westernblot检测视网膜内蛋白表达水平。

(1)视网膜用pbs缓冲液洗2次，加入200ulripa裂解液，用匀浆器将视网膜组织裂解为单个细胞。

(2)放置冰上充分裂解30h，每隔十分钟涡旋振荡数秒。

(3)以12000rpm的转速在4℃下离心15分钟。

(4)以30ug/孔的蛋白量上样，再进行sds-page电泳，电泳条件：90v，30min；120v，至结束。

(5)转膜，将蛋白转移到pvdf膜上。条件为300ma，2h。

(6)用兔来源gmfb，gfap抗体和抗兔hrp标记的二抗检测相应蛋白的表达，以actin作为内参。

在玻璃体腔注射gmfb抗体后第2周、取视网膜进行用westernblot检测gmfb和gfap的表达情况。图3和6显示与正常大鼠相比，糖尿病两周大鼠视网膜内gmfb与gfap明显增高，gfap增高则提示细胞胶质化加重，注射gmfb抗体两周后gmfb和gfap有下降趋势，但无统计学意义。

实施例3：trizol裂解法提取rna。

(1)将视网膜用pbs缓冲液洗2次，加入1mltrizol裂解液,用匀浆器将视网膜组织裂解为单个细胞。

(2)充分裂解后，加入五分之一体积的氯仿，剧烈混匀后，以12000rpm的转速在4℃下离心15分钟。

(3)离心后，将上清转移到新的离心管中，注意不要取到中间的蛋白层，加入等体积的异丙醇，冰浴20分钟。

(4)12000rpm的转速在4℃下离心15分钟，弃去上清，将沉淀用75％的乙醇洗2次。

(5)将沉淀室温干燥后，用适量的depc水溶解。测浓度。

实施例4：rna反转录。

cdna第一条链是通过promega公司的m-mlv反转录酶获得的，主要步骤如下：

(1)首先取2μg的rna与2μl的oligod(t)混合，72℃水浴放置5分钟，立即冰浴2分钟后，使oligod(t)与rna的poly-a尾巴结合，轻微离心。

(2)加入1.25μl的dntp(10μm)、1μlm-mlv反转录酶和0.5μlrna酶抑制剂，用depc水将反应体积调节到25μl。42℃水浴放置1小时。

(3)70℃放置10分钟使反转录酶失活。将得到的cdna单链保存于-20℃冰箱。

引物见下表1。

表1用于检测基因的引物

反转录体系如表2：

表2反转录体系

反转录程序：16℃保温30分钟，42℃保温30分钟，85℃保温10分钟后立即置于冰上5分钟。然后可于-20℃冰箱保存备用。

实施例5：定量pcr。

将rna反转录后得到的cdna第一链作为模板，设计引物。利用天根公司的sybrgreen实时荧光定量pcr检测试剂盒，检测目的基因的表达量。pcr扩增条件如下：94℃变性10分钟，进入循环(95℃保温5sec，60℃保温60sec)，一共40个循环，并收集溶解曲线。

图4和7显示与正常大鼠相比，糖尿病两周大鼠视网膜内gmfb与gfap明显增高，gfap增高则提示细胞胶质化加重，注射gmfb抗体两周后gmfb明显下降，gfap有下降趋势，但无统计学意义。

实施例6：眼球冰冻切片

(1)将大鼠脱颈处死，取眼球，显微镜下将角膜剪开一个小口，1h后将眼球取出，显微镜下剪开角膜，小心取出晶状体，只保留视杯

(2)4％pfa固定过夜

(3)依次放置于10％，20％，30％蔗糖溶液中梯度脱水

(4)将视杯“c”形放入oct包埋液中，4℃过夜

(5)放置于-80℃冰箱，待其凝固后便可在冰冻切片机上切片

(6)将切好的片子风扇固定过夜，放置于-80℃保存

实施例7：免疫荧光

(1)取出切片，放置于加水的黑盒中，待其升到室温

(2)用石蜡笔在标本周围画圈，将标本圈住

(3)滴加pbs于标本上，10min

(4)0.25％triton-x透膜30min

(5)3％bsa封闭30min

(6)用兔来源gmfb，gfap抗体和抗兔绿色荧光488标记的二抗检测相应蛋白的表达，使用dapi染色以便看到细胞核的位置，使用莱卡共聚焦显微镜拍摄

图5和8显示与正常大鼠相比，糖尿病两周大鼠视网膜内gmfb与gfap明显过表达，gfap过表达则提示细胞胶质化加重，注射gmfb抗体两周后gmfb和gfap表达显著减弱，表明在糖尿病大鼠中注射gmfb抗体能够降低视网膜细胞的胶质化。(dapi即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与dna强力结合的荧光染料，在荧光染色中用于确定细胞核的位置)，merge为dapi细胞核染色与相应蛋白染色的合成图。

实施例7：tunel试剂盒染色检测凋亡

(1)取出切片，放置于加水的黑盒中，待其升到室温，将试剂盒中的酶与缓冲液1:9混合

(2)滴加pbs于标本上，5min

(3)0.25％triton-x透膜30min

(4)pbs洗3次，每次5min

(5)滴加tunel混合液，37℃，1h

(6)pbs洗3次，每次5min

(7)dapi溶液染色5min

(8)pbs洗3次，每次5min

(9)dako封片，用莱卡共聚焦显微镜拍摄

图9和10中的dapi为细胞核染色，merge为dapti染色和tunel染色的合成图。图中显示，与正常大鼠相比，糖尿病两周大鼠视网膜内凋亡细胞明显增高，注射gmfb抗体两周后凋亡情况有所缓解。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。