俄色叶及其提取物在制备降血脂药物中的用途的制作方法

本发明涉及俄色叶及其提取物在制备降血脂药物中的用途。

背景技术

“俄色叶”为甘孜州藏族自治州藏族民间习用药材，来源于蔷薇科苹果属植物变叶海棠和花叶海棠的干燥叶。始载于《晶镜本草》，具有保肝利胆、除腻涤滞、攻坚化积的作用，常用于治疗消化不良、脘腹胀痛、肝疾，在该地区使用历史悠久，但目前缺乏法定标准，且化学成分、有效性均不明确。有文献对俄色叶的化学成分与功效相关性的研究，明确指标性成分。(夏冬梅，藏药“俄色叶”的质量标准研究，成都中医药大学硕士论文，2014-05-01)

俄色叶具有除腻涤滞，攻坚化积，保肝利胆等功效，传统的藏医主要将其用于治疗消化不良、高血压、高血糖、高血脂及一些肝疾，其疗效确切，用法独特。现代药理研究报道，俄色叶及其代表成分根皮苷、根皮素具有保肝、抗氧化、降血糖、降血脂、降血压等作用。

目前尚无俄色叶特定的有机溶剂提取物或有效部位用于降血脂的报道。

技术实现要素：

本发明的技术方案是提供了俄色叶及其提取物的新用途，具体是在制备降血脂药物中的用途。

本发明提供了俄色叶及其提取物在制备降血脂药物中的用途。

其中，所述的俄色叶为蔷薇科植物变叶海棠malustoringoides(rehd.)hughes和花叶海棠malustransitoria(batal.)schneid.的干燥叶及叶芽。

其中，所述的俄色叶提取物为总提取物部位、水提取部位、正丁醇提取部位、乙酸乙酯部位、二氯甲烷提取部位、石油醚提取部位。

其中，所述的俄色叶提取物为乙酸乙酯部位。其中，所述的俄色叶提取物的制备方法为：

a、取俄色叶过筛，加入95％乙醇提取，过滤，残渣再加水煎煮，过滤；醇提液减压回收乙醇至无醇味得醇提浸膏；以水提液浓缩液分散醇提浸膏并浓缩得浸膏，浸膏干燥为总提取部位；

b、将醇提浸膏以水提液浓缩液分散醇提浸膏，使其充分均匀溶解，依次加入石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇萃取，萃取剩余部分为水部分，回收各部位萃取溶剂于旋转蒸发仪上蒸干，再真空干燥至干，则最终依照极性大小顺序得到水、水饱和的正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚部位。

本发明俄色叶不同提取部位均能显著降低tc(p＜0.05，p＜0.01)，其中以乙酸乙酯部位降低tc最明显。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1正常肝l-02细胞诱导造模前后形态对比图(其中，a正常对照组(10×20)b医用脂肪乳诱导组(模型组)(10×20))

图2俄色果与俄色叶总提取部位对脂变性l-02细胞内tg含量影响(n＝3)

图3俄色果与俄色叶总提取部位对脂变性l-02细胞内tc含量影响(n＝3)

图4俄色叶各溶剂提取部位及单体对脂变性l-02细胞内tg含量的变化(n＝3)

图5俄色叶各溶剂提取部位及单体对脂变性l-02细胞内tc含量的变化(n＝3)

具体实施方式

试验例1本发明俄色叶有效部位的制备

取俄色叶过2号筛粉末各100g，分别按1﹕20的料液比加入2000ml95％乙醇回流提取2次，每次2h，趁热过滤，残渣再加10倍量水煎煮2次，每次2h，趁热过滤；合并2次醇提滤液，减压回收乙醇至无醇味；合并2次水提滤液并浓缩得浸膏，浸膏真空干燥后为总提取部位(水提浸膏与醇提浸膏的混合物)。将浸膏以水提液浓缩液分散醇提浸膏，使其充分均匀溶解，依次加入石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇萃取，每次300ml，连续萃取3次，萃取剩余部分为水部分，回收各部位萃取溶剂于旋转蒸发仪上蒸干，再真空干燥至干，则最终依照极性大小顺序得到水、水饱和的正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚等5个萃取部位样品粉末。

以下通过具体药效试验试验证明本发明的有益效果。

仪器与材料

1.1实验材料

俄色叶、俄色果、根皮苷、根皮素的来源市售。盐酸普萘洛尔片(批号：1704159)购自江苏亚邦爱普森药业有限公司。

1.2细胞株

正常人肝细胞l-02细胞株来源于美国atcc公司。

1.3试剂试药

医用脂肪乳(批号f17020110)购自四川科伦药业股份有限公司，二甲基亚砜(dmso)购自德国biofroxx公司，总胆固醇(tc)试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司，甘油三酯(tg)试剂盒、总蛋白定量测定试剂盒(微板法)均购自南京建成生物工程研究所，rpmi-1640培养基、磷酸缓冲液(pbs)和胰蛋白酶均购自heslone公司，胎牛血清(fbs)购自呼和浩特市草原绿野生物工程材料有限公司。其余试剂均为分析纯。

1.4仪器设备

倒置显微镜(德国leica公司)，细胞孵育箱(美国thermo公司)，多功能酶标仪(美国thermo公司)，移液器(德国eppendorf公司)，allegrax-12series离心机(美国beckmancoulter公司)，超净工作台(北京亿达科创科技有限公司)，优普系列超纯水器(成都超纯科技有限公司)。

1.5溶液的配制

完全培养液的配制：将胎牛血清10ml与rmpi-1640培养基90ml，混匀即得(含100u.ml^-1青霉素，100μg.ml^-1链霉素)。

0.2％血清rpmi-1640培养液的配制：将胎牛血清0.2ml与rmpi-1640培养基99.8ml，混匀即得(含100u.ml^-1青霉素，100μg.ml^-1链霉素)。

医用脂肪乳诱导液的配制：将胎牛血清10ml与20％医用脂肪乳5ml混匀，用无血清的rmpi-1640稀释至100ml，即得。

2方法

2.1样品的配制

2.1.1“俄色”不同药用部位各溶剂提取部位制备(实施例1制备)

2.1.2“俄色”不同药用部位各溶剂提取部位配制

将俄色叶和俄色果总提取部位和5个萃取部位样品粉末分别用dmso溶解后，于实验前用0.2％血清的rpmi-1640培养液分别配制成低剂量组(25μg.ml^-1)，中剂量组(50μg.ml^-1)，高剂量组(100μg.ml^-1)3个浓度的供试品，0.22μm微孔滤膜滤过，分装至无菌小瓶密封保存至4℃冰箱备用。

2.1.3根皮苷、根皮素和阿托伐他汀供试品的制备

精密称取适量根皮苷和根皮素，用0.2％血清的rpmi-1640培养液分别配制成低剂量组(12.5μg.ml^-1)，中剂量组(25μg.ml^-1)，高剂量组(50μg.ml^-1)3个浓度的供试品。精密称取适量阿托伐他汀，用0.2％血清的rpmi-1640培养液分别配制成浓度为10μg.ml^-1的供试品。

2.2l-02细胞培养、传代、冻存、复苏

2.2.1细胞的培养

采用25cm²的细胞培养瓶对l-02细胞进行培养，置于37℃、饱和湿度及5％co2细胞培养箱中，以含10％的fbsrpmi-1640培养基进行常规培养。对细胞形态和生长状况进行观察，依据其生长状态，每1～2天换入新鲜培养液一次，于无菌操作台中进行实验操作。

2.2.2细胞的传代

在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，当观察到l-02细胞长满或接近长满瓶底时，在无菌超净工作台中，弃去旧培养液，pbs润洗1～2次后，加入0.25％胰酶1ml，37℃对细胞进行消化，约1～2min后，轻晃培养瓶，显微镜下观察到细胞形态变圆，胞间间隙变大，个别细胞脱落时，说明细胞消化较充分，立即加入预温的完全培养基对消化进行终止。用移液枪吹打培养瓶的底部，使细胞散开成细胞悬液，转移到10ml离心管中，1000rpm.min^-1离心3min，弃上清，加入新鲜培养基1ml，吹打混匀使细胞单个散在，按1传3或1传5的比例，转移部分悬液至新的培养瓶中，吸入3ml～4ml新鲜完全培养基，放入细胞培养箱中传代培养，约1～2天传代一次。

2.2.3细胞的冻存

取对数生长期的l-02细胞(前一日换掉旧培养液)，弃去细胞培养基，按本章“2.2.2”项下的消化方法进行消化，1000rpm.min^-1离心3min，将上清液吸弃，加入冻存液(dmso:完全培养基＝1:9)，轻轻吹打使之均匀悬浮，将细胞悬液按每管1ml的量分装至细胞冻存管中保存，梯度降温(4℃30min，-20℃2h，-80℃过夜)后，放入液氮罐中冻存。

2.2.4细胞的复苏

迅速将l-02细胞冻存管从液氮罐中拿出，37℃水浴锅内使其融化，待其完全融化，快速转移到无菌超净工作台中进行操作，将细胞悬液转移至离心管中，放入10倍培养基，轻轻吹打混匀，于离心机中1000rpm.min^-1离心3min，弃去上清液，加入完全培养基4～5ml，轻轻吹打混匀后，转移到培养瓶中，放入细胞培养箱内培养。

2.3肝l-02细胞体外高脂模型的建立

参考文献^[61-64]，取对数生长期的肝l-02细胞用0.25％胰蛋白酶消化，细胞计数后用正常培养液配成单个细胞悬液，以每孔3×10⁵个细胞的密度接种于6孔培养板中，每孔培养液体积2ml移入细胞培养箱中，在37℃、饱和湿度及5％co2条件下，培养48h使其充分贴壁生长，待细胞长至80％融合时，换成仅含有0.2％血清的rpmi-1640培养液培养24h，使细胞周期同步化。正常对照组继续给予含10％fbs的rpmi-1640培养液培养48h，模型组给予含10％fbs的医用脂肪乳rpmi-1640诱导培养液培养48h后，即可建立肝l-02细胞体外高脂模型。

2.4分组及给药

将肝l-02细胞按照“2.3”所述方法，接种于6孔培养板中，设空白组、模型组、俄色果、俄色叶各溶剂提取部位、根皮苷、根皮素和阳性对照阿托伐他汀组。空白组与模型组每孔继续给予2ml正常培养液；给药组及阳性对照组每孔给予含相应浓度药物培养液2ml进行培养。每个浓度3个复孔，培养时间48h。

2.5l-02细胞中tc、tg含量的测定

培养48h后，弃去培养基，用预冷的pbs洗涤细胞1～2遍，将多余的pbs吸干，每孔加入200μl细胞裂解液，混匀，静置10min。收集的裂解液按总胆固醇(tc)试剂盒，甘油三酯(tg)试剂盒测定tg和tc含量。

2.6统计方法

采用spss18.0软件进行分析，实验结果以“平均值±标准差”表示，组间采用单因素方差分析，采用lsd法进行两两比较。以p<0.05表示差异具有统计学意义。

3结果

3.1建立l-02细胞脂肪变性模型

医用脂肪乳诱导l-02细胞48h后，于倒置显微镜下观察到，对照组：细胞间结合紧密，边缘清晰，无缝隙，细胞内脂滴较少(图1a)。模型组：与正常组细胞相比，模型组细胞明显肿大，细胞轮廓模糊，细胞间结合欠紧密，细胞内脂滴较多且成环状包围细胞，有脂滴融合现象(图1b)。细胞内脂质含量测定结果显示，医用脂肪乳诱导组细胞内tg、tc含量显著升高(p<0.01)，见表1、表2，表明通过医用脂肪乳诱导48h后，成功建立了l-02细胞脂肪变性模型。

3.2“俄色”不同药用部位各溶剂提取部位对肝细胞内tg、tc影响

3.2.1俄色叶、俄色果总提取部位对肝细胞内tg、tc影响

与正常对照组比较，模型组tg、tc显著上升(p<0.01)，说明肝l-02细胞体外高脂模型造模成功。与模型组比较，俄色果中剂量组和高剂量组均能显著降低脂肪变性肝l-02细胞内tg的含量(p<0.05，p<0.01)，俄色果低剂量组及俄色叶低、中、高剂量组均不能降低细胞内tg的含量。俄色叶低、中、高剂量组及俄色果低剂量组和高剂量组均能降低脂肪变性肝l-02细胞内tc的含量(p<0.01)，俄色果中剂量组不能显著降低细胞内tc含量(p＞0.05)。结果见表1、图2和图3。

在降低脂肪变性肝l-02细胞内tc含量方面，俄色叶优于俄色果。

表1俄色叶与俄色果总提取部位对脂变性l-02细胞内tg、tc含量影响(n＝3)

注：与正常对照组比较，**p<0.01，*p<0.05；与模型组比较，^##p<0.01，^#p<0.05，下同

3.2.2俄色叶各溶剂提取部位对肝细胞内tg、tc影响

与模型组比较，仅根皮苷中剂量组能显著降低脂肪变性肝l-02细胞内tg的含量(p<0.05)，其余各组别均无显著性差异(p＞0.05)。与模型组比较，俄色叶水提取部位(高剂量组)、正丁醇提取部位(低、高剂量组)、乙酸乙酯提取部位(中、高剂量组)、二氯甲烷提取部位(低剂量组)、石油醚提取部位(低、中剂量组)、根皮素(低、中、高剂量组)均能显著降低脂肪变性肝l-02细胞内tc的含量(p<0.05或p<0.01)，其余各组别给药前后，tc含量均无显著性差异(p＞0.05)。结果见表2、图4和图5。

在降低tg含量方面，除根皮苷外，俄色叶各溶剂提取部位及根皮素均未表现出显著降低tg作用；在降低tc含量方面，正丁醇提取部位、乙酸乙酯提取部位较优，其次为二氯甲烷提取部位、石油醚提取部位，再次为水提取部位和根皮素，根皮苷未见降低细胞内tc含量作用。俄色叶各溶剂提取部位结果与“3.2.1”项下结果中俄色叶总提取部位能显著降低tc含量，不能降低tg含量结果基本一致。说明俄色叶虽没有显著降低tg含量的作用，但在降低tc方面具有显著作用。

表2俄色叶各溶剂提取部位及单体对脂变性l-02细胞内tg、tc含量的变化(n＝3)

4讨论

高血脂是指血中胆固醇(tc)和/或甘油三酯(tg)过高或高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)过低，现代医学称之为血脂异常。tc和tg是人体内含量最多的脂质成分，其含量的异常是高脂血症发病的重要病理基础，因此本实验重点检测了各药物对tc、tg含量的影响。

利用医用脂肪乳造模法建立的肝l-02细胞脂变模型tg浓度高，脂肪变性率高，细胞形态好，且医用脂肪乳价格低，对细胞毒性低，取材和使用方便，是一种良好的肝l-02细胞脂肪变性诱导剂。本实验采用含1％医用脂肪乳的完全培养基孵育l-02细胞48h后，诱导其形成体外高脂细胞模型，且特性稳定。细胞内脂质水平能够反映血脂含量的高低，因此将该高脂细胞模型用于降血脂药物的体外筛选及验证，能大幅缩短降脂功效评价的周期。

实验结果显示，俄色叶能显著降低变性肝l-02细胞内tc含量，但不能降低tg含量。在本实验给药剂量下俄色叶不能降低细胞内tg含量，但加大用药剂量可能可降低细胞内tg含量。

本发明俄色叶各溶剂(水、正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚)提取部位和根皮素均不能显著降低脂变性肝l-02细胞内tg含量，均能不同程度降低脂变性l-02细胞内tc含量，其中以正丁醇部位、乙酸乙酯部位活性较强，二氯甲烷部位、石油醚部位次之，水部位和根皮素对细胞内tc含量影响相对较小。