利用大豆糖蜜生产的细菌纤维素制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料的制作方法

本发明涉及一种利用大豆糖蜜生产的细菌纤维素制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料的方法，属于大豆副产物利用
技术领域：
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背景技术：
皮肤是人体的最大器官，不仅可以保护人体免受外界损伤，同时也可以维持人体内部环境的平衡。在人们的日常生活中难免会遇到损伤，如果伤口得不到及时的治疗没有及时愈合，会引起伤口发炎或者其他病理变化，在皮肤受损的时候用皮肤组织修复材料(伤口敷料)是一种行之有效的办法。伤口敷料不仅可以隔绝伤口与外界的接触，也可以促进伤口愈合。传统敷料具有一定的弊端，通透性差，持水性差，保湿性低等问题，而纤维素具有良好的通透性，生物相容性以及生物可降解性等优良性能，是制备伤口敷料的理想原料。大豆糖蜜是生产大豆浓缩蛋白的副产物之一，因颜色和流动性类似于蜂蜜命名为糖蜜，含有丰富的低聚糖以及蛋白质，因为糖蜜不易处理，其中大部分的大豆糖蜜会被作为废物排放，浪费了资源同时污染环境。大豆糖蜜成分复杂，含有微生物生长所需要的营养和水溶性矿物质，是一种优质的发酵剂。以大豆糖蜜为发酵剂生产细菌纤维素可以提高糖蜜的生物利用率和经济价值，促进发展，减少环境污染。现行制备伤口敷料多采用植物纤维素，通过结合化学转化或裂解法溶解木质素和半木质素，不符合绿色化学可持续发展的原则，对环境造成了污染。细菌纤维素更加环保，同时与植物纤维相比纯度更高，结晶度更好，持水性更好，生物适应性更强，更适合作为伤口敷料的原料，同时增加了大豆副产物的利用。但是细菌纤维素具有一定的弊端，本身不具有治疗功能，因此需要进一步制备功能性复合膜。本发明利用了大豆糖蜜制备了细菌纤维素，采用高压静电喷雾涂覆法制备功能化壳聚糖-纤维纳米复合膜伤口敷料。此纳米复合膜多孔，透明，具有良好的保湿性，透气性，吸水性，可以作为潜在的皮肤伤口敷料。技术实现要素：为了解决大豆糖蜜资源浪费，污染环境，生物利用率低，传统伤口敷料通透性差，生物相容性低，生物降解性低的问题，本发明提供了利用大豆糖蜜生产的细菌纤维素制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料的方法，采用的技术方案如下：(1)配制培养基：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钠0.27％，柠檬酸0.115％，琼脂2％，调节ph至6.0，121℃高压灭菌20min。配制种子培养基：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钠0.27％，柠檬酸0.115％，调节ph至6.0，121℃高压灭菌20min；(2)挑选一环已活化的居间驹形氏杆菌接种于装有100ml种子培养基的三角瓶中，30℃，180r/min振荡培养22h；(3)将已活化的种子液按照5-15％的接种量接种于装有50ml大豆糖蜜发酵培养基的三角瓶中，其中大豆糖蜜可溶性固形物含量为5-25°brix，在30℃静置培养5d；(4)发酵5d后，在培养基表面形成一层凝胶状的细菌纤维素膜，将其取出后，用蒸馏水冲洗，在0.1mol/l的naoh溶液中浸泡，80℃水浴1h，去除残留的菌体，再用蒸馏水反复浸泡，直至细菌纤维素膜呈乳白色半透明状，将水分沥干置于65℃烘箱中至质量恒定；(5)用naoh/尿素溶液溶解细菌纤维素制备纯纤维素膜；(6)以纯纤维素膜为基材，采用高压静电喷涂法将2-6wt％壳聚糖溶液涂敷于纯纤维素膜上制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜。电喷参数为：电压20kv，接受距离10cm，推进速度2.0ml/h，温度25℃，湿度40-50％；所述的碳源选择大豆糖蜜，既能提高细菌纤维素的产量，又能提高大豆糖蜜的生物利用率，减少环境污染；所述的壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料原料选择细菌纤维素，与其他纤维素相比，通透性更好，结晶度更好，生物相容性更好；所述的naoh/尿素水溶液可以在低温下溶解纤维素，并且该水溶液属于环境友好型溶剂，绿色环保；所述的壳聚糖具有生物相容性以及内在的止血抗菌性能，是作为伤口敷料的良好材料，其最佳含量为6wt％；所述的发酵培养基中，最佳可溶性固形物含量为15°brix，最佳接种量为10％；本发明针对大豆糖蜜的低利用率，对环境造成污染，传统伤口敷料制备工艺复杂，生物可降解度低等难题，本发明制备了一种利用大豆糖蜜生产的细菌纤维素制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料的方法，即利用大豆糖蜜作为碳源生产细菌纤维素，采用高压静电喷雾涂覆法制备功能化壳聚糖-纤维纳米复合膜伤口敷料。此纳米复合膜多孔，透明，具有良好的保湿性，透气性，吸水性，可以作为潜在的皮肤伤口敷料。本发明有益效果：1、本发明利用大豆糖蜜生产的细菌纤维素制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料的方法，运用了现代微生物发酵技术，使用大豆糖蜜作为发酵剂，为微生物的生长提供所需的营养以及水溶性矿物质元素，提高了大豆糖蜜的利用率同时减少了环境污染；2、本发明利用大豆糖蜜生产的细菌纤维素制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料的方法，既可以将皮肤创面口与外界环境隔离，又可以为创面口提供一个合适的促进伤口愈合的环境；3、本发明利用大豆糖蜜生产的细菌纤维素制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料的方法，优选的加入的最佳可溶性固形物含量为15°brix，最佳接种量为10％，可以提高细菌纤维素的产量，提高生物利用率；4、本发明使用高压静电喷雾法，可以提高壳聚糖和纤维素的结合率，提高伤口敷料的功能性，避免了壳聚糖溶液敷涂过程中造成的纤维膜孔堵塞的情况，提高了伤口敷料的多孔性。附图说明附图1大豆糖蜜生产的细菌纤维素制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料制作流程图具体实施方式下面是结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。以下实施例所用的主要原料、试剂以及实验器材如下：(1)主要原料与试剂：大豆糖蜜，居间驹形氏杆菌，葡萄糖，酵母浸粉，蛋白胨，磷酸氢二钠，柠檬酸，琼脂，壳聚糖，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5二苯基四氮唑溴盐(mtt)，hela细胞；(2)实验器材：sw-ci-1d超净工作台，hzq-f100型恒温振荡培养箱，1006高压静电纺丝仪。实施例1：本实施例提供了一种利用大豆糖蜜生产的细菌纤维素制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料的方法，具体步骤如下：(1)配制培养基：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钠0.27％，柠檬酸0.115％，琼脂2％，调节ph至6.0，121℃高压灭菌20min。配制种子培养基：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钠0.27％，柠檬酸0.115％，调节ph至6.0，121℃高压灭菌20min；(2)挑选一环已活化的居间驹形氏杆菌接种于装有100ml种子培养基的三角瓶中，30℃，180r/min振荡培养22h；(3)已活化种子液按照10％的接种量接种于装有50ml大豆糖蜜发酵培养基的三角瓶中，其中大豆糖蜜可溶性固形物含量为15°brix，在30℃静置培养5d；(4)发酵5d后，在培养基表面形成一层凝胶状的细菌纤维素膜，将其取出后，用蒸馏水冲洗，在0.1mol/l的naoh溶液中浸泡，80℃水浴1h，去除残留的菌体，再用蒸馏水反复浸泡，直至细菌纤维素膜呈乳白色半透明状，将水分沥干置于65℃烘箱中至质量恒定；(5)用naoh/尿素溶液溶解细菌纤维素制备纯纤维素膜；(6)以纯纤维素膜为基材，采用高压静电喷涂法将6wt％壳聚糖溶液涂敷于纯纤维素膜上制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜。电喷参数为：电压20kv，接受距离10cm，推进速度2.0ml/h，温度25℃，湿度40-50％；(7)进行细胞毒性和增殖实验；实施例2：本实施例提供了一种利用大豆糖蜜生产的细菌纤维素制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料的方法，具体步骤如下：(1)配制培养基：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钠0.27％，柠檬酸0.115％，琼脂2％，调节ph至6.0，121℃高压灭菌20min。配制种子培养基：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钠0.27％，柠檬酸0.115％，调节ph至6.0，121℃高压灭菌20min；(2)挑选一环已活化的居间驹形氏杆菌接种于装有100ml种子培养基的三角瓶中，30℃，180r/min振荡培养22h；(3)将已活化的种子液按照5％的接种量接种于装有50ml大豆糖蜜发酵培养基的三角瓶中，其中大豆糖蜜可溶性固形物含量为5°brix，在30℃静置培养5d；(4)发酵5d后，在培养基表面形成一层凝胶状的细菌纤维素膜，将其取出后，用蒸馏水冲洗，在0.1mol/l的naoh溶液中浸泡，80℃水浴1h，去除残留的菌体，再用蒸馏水反复浸泡，直至细菌纤维素膜呈乳白色半透明状，将水分沥干置于65℃烘箱中至质量恒定；(5)用naoh/尿素溶液溶解细菌纤维素制备纯纤维素膜；(6)以纯纤维素膜为基材，采用高压静电喷涂法将2wt％壳聚糖溶液涂敷于纯纤维素膜上制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜。电喷参数为：电压20kv，接受距离10cm，推进速度2.0ml/h，温度25℃，湿度40-50％；(7)进行细胞毒性和增殖实验；实施例3：本实施例提供了一种利用大豆糖蜜生产的细菌纤维素制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料的方法，具体步骤如下：(1)配制培养基：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钠0.27％，柠檬酸0.115％，琼脂2％，调节ph至6.0，121℃高压灭菌20min。配制种子培养基：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钠0.27％，柠檬酸0.115％，调节ph至6.0，121℃高压灭菌20min；(2)挑选一环已活化的居间驹形氏杆菌接种于装有100ml种子培养基的三角瓶中，30℃，180r/min振荡培养22h；(3)将已活化的种子液按照15％的接种量接种于装有50ml大豆糖蜜发酵培养基的三角瓶中，其中大豆糖蜜可溶性固形物含量为25°brix，在30℃静置培养5d；(4)发酵5d后，在培养基表面形成一层凝胶状的细菌纤维素膜，将其取出后，用蒸馏水冲洗，在0.1mol/l的naoh溶液中浸泡，80℃水浴1h，去除残留的菌体，再用蒸馏水反复浸泡，直至细菌纤维素膜呈乳白色半透明状，将水分沥干置于65℃烘箱中至质量恒定；(5)用naoh/尿素溶液溶解细菌纤维素制备纯纤维素膜；(6)以纯纤维素膜为基材，采用高压静电喷涂法将6wt％壳聚糖溶液涂敷于纯纤维素膜上制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜。电喷参数为：电压20kv，接受距离10cm，推进速度2.0ml/h，温度25℃，湿度40-50％；(7)进行细胞毒性和增殖实验；实施例4：本实施例提供了一种利用大豆糖蜜生产的细菌纤维素制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料的方法，具体步骤如下：(1)配制培养基：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钠0.27％，柠檬酸0.115％，琼脂2％，调节ph至6.0，121℃高压灭菌20min。配制种子培养基：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钠0.27％，柠檬酸0.115％，调节ph至6.0，121℃高压灭菌20min；(2)挑选一环已活化的居间驹形氏杆菌接种于装有100ml种子培养基的三角瓶中，30℃，180r/min振荡培养22h；(3)将已活化的种子液按照5％的接种量接种于装有50ml大豆糖蜜发酵培养基的三角瓶中，其中大豆糖蜜可溶性固形物含量为10°brix，在30℃静置培养5d；(4)发酵5d后，在培养基表面形成一层凝胶状的细菌纤维素膜，将其取出后，用蒸馏水冲洗，在0.1mol/l的naoh溶液中浸泡，80℃水浴1h，去除残留的菌体，再用蒸馏水反复浸泡，直至细菌纤维素膜呈乳白色半透明状，将水分沥干置于65℃烘箱中至质量恒定；(5)用naoh/尿素溶液溶解细菌纤维素制备纯纤维素膜；(6)以纯纤维素膜为基材，采用高压静电喷涂法将4wt％壳聚糖溶液涂敷于纯纤维素膜上制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜。电喷参数为：电压20kv，接受距离10cm，推进速度2.0ml/h，温度25℃，湿度40-50％；(7)进行细胞毒性和增殖实验；实施例5：本实施例提供了一种利用大豆糖蜜生产的细菌纤维素制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料的方法，具体步骤如下：(1)配制培养基：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钠0.27％，柠檬酸0.115％，琼脂2％，调节ph至6.0，121℃高压灭菌20min。配制种子培养基：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钠0.27％，柠檬酸0.115％，调节ph至6.0，121℃高压灭菌20min；(2)挑选一环已活化的居间驹形氏杆菌接种于装有100ml种子培养基的三角瓶中，30℃，180r/min振荡培养22h；(3)将已活化的种子液按照15％的接种量接种于装有50ml大豆糖蜜发酵培养基的三角瓶中，其中大豆糖蜜可溶性固形物含量为20°brix，在30℃静置培养5d；(4)发酵5d后，在培养基表面形成一层凝胶状的细菌纤维素膜，将其取出后，用蒸馏水冲洗，在0.1mol/l的naoh溶液中浸泡，80℃水浴1h，去除残留的菌体，再用蒸馏水反复浸泡，直至细菌纤维素膜呈乳白色半透明状，将水分沥干置于65℃烘箱中至质量恒定；(5)用naoh/尿素溶液溶解细菌纤维素制备纯纤维素膜；(6)以纯纤维素膜为基材，采用高压静电喷涂法将6wt％壳聚糖溶液涂敷于纯纤维素膜上制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜。电喷参数为：电压20kv，接受距离10cm，推进速度2.0ml/h，温度25℃，湿度40-50％；(7)进行细胞毒性和增殖实验；对照组1是利用传统发酵剂生产的细菌纤维素制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料；下面是一部分实验数据：表1各实施例复合膜的物理性质表2各实施例复合膜的力学性质实验组拉伸强度(mpa)断裂伸长率(％)弹性模量(gpa)实施例187.55(2.20)3.89(0.48)5.48(0.12)实施例279.23(1.78)2.78(0.32)4.71(0.15)实施例363.12(1.50)2.28(0.14)4.22(0.34)实施例469.35(0.57)2.91(0.19)4.91(0.17)实施例578.94(0.17)3.12(0.23)5.12(0.19)对照组162.15(1.23)2.18(0.18)4.19(0.12)综合表1、表2可以看出与传统发酵剂相比，使用大豆糖蜜作为发酵剂生产的细菌纤维更适合作为伤口敷料。使用大豆糖蜜作为发酵剂的细菌纤维孔隙更加蓬松，彼此相互贯穿形成一个相对规则的三位网格结构，同时多孔结构能够促进细胞的生长和增殖，有利于气体交换和渗出液派出，满足细胞正常的新陈代谢需要；具有良好的水蒸气透过率，可以为体液中度流失的创面提供湿润环境，将有助于伤口愈合；具有更高的溶胀性能，间接表明了允许营养物质、细胞和生物活性分子的扩散以及废物排除的能力。本发明利用大豆糖蜜生产的细菌纤维素制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料的方法，实验大豆糖蜜替代传统的发酵剂制备纤维素，采用高压静电喷雾涂覆法制备功能化壳聚糖-纤维纳米复合膜伤口敷料。综合表1、表2发现实验最佳参数为：将活化好的种子液按照10％的接种量接种于装有50ml大豆糖蜜发酵培养基的250ml三角瓶中，其中大豆糖蜜可溶性固形物含量为15°brix，在30℃静置培养5d；以纯纤维素膜为基材，采用高压静电喷涂法将6wt％壳聚糖溶液涂敷于纯纤维素膜上制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜。电喷参数为：电压20kv，接受距离10cm，推进速度2.0ml/h，温度25℃，湿度40-50％。利用大豆糖蜜生产的细菌纤维素制备壳聚糖-纤维素纳米复合膜伤口敷料的方法，运用了现代微生物发酵技术，使用大豆糖蜜作为发酵剂，为微生物的生长提供所需的营养以及水溶性矿物质元素，提高了大豆糖蜜的利用率同时减少了环境污染；使用高压静电喷雾法，可以提高壳聚糖和纤维素的结合率，提高伤口敷料的功能性，避免了壳聚糖溶液敷涂过程中造成的纤维膜孔堵塞的情况，提高了伤口敷料的多孔性以及修复性。虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页12