短叶苏木酚酸甲酯在制备抗流感病毒药物中的应用的制作方法

本发明涉及化合物的新应用，特别涉及短叶苏木酚酸甲酯在制备抗流感病毒药物中的应用。

背景技术：

短叶苏木酚酸甲酯(methylbrevifolincarboxylate)分子式为c14h10o8。cas号为:154702-76-8。系统命名为methyl7,8,9-trihydroxy-3,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahydrocyclopenta[c]isochromene-1-carboxylate。结构式为：

短叶苏木酚酸甲酯提取自青果。青果，是橄榄科橄榄属植物橄榄[canariumalbum(lour.)raeusch]的果实，青果收录于2015版《中国药典》，常用于治疗咽喉肿痛、咳嗽、烦渴及鱼蟹中毒等。

已有文献表明，短叶苏木酚酸甲酯具有抑制人单纯孢疹病毒hsv-1staker株和hsv-2sar株的活性[左春旭,李凤琴,姚庆强,等.抗病毒新化合物短叶苏木酚酸甲酯及其制备方法,cn1093362[p].1994.]、抑制血小板凝集[iizukat,nagaim,taniguchia,etal.inhibitoryeffectsofmethylbrevifolincarboxylateisolatedfromphyllanthusniruril.onplateletaggregation[j].biological&pharmaceuticalbulletin,2007,30(2):382.]以及舒张血管[iizukat,moriyamah,nagaim.vasorelaxanteffectsofmethylbrevifolincarboxylatefromtheleavesofphyllanthusniruri.[j].biological&pharmaceuticalbulletin,2006,29(1):177.]的作用。

唐文照,王晓静,姚庆强,等.一种臭椿花提取物与其活性成分短叶苏木酚的制备方法及应用:,cn102659746a[p].2012.本发明提供一种臭椿花提取物与其活性成分短叶苏木酚的制备方法及应用，根据发明人对臭椿花进行的化学成分研究，制备了臭椿花提取物和总异香豆素活性部位，并且分离得到三个环戊酮异香豆素，包括短叶苏木酚、短叶苏木酚酸与短叶苏木酚酸甲酯。生物活性研究显示它们具有显著的抗氧化、抗炎与抗肿瘤作用。实验结果表明臭椿花提取物(包括有效部位)与活性化合物臭椿花素可用于制备抗氧化、抗炎与抗肿瘤等相关疾病方面的药品、保健品。

常莉,薛建平,王兴.不同处理对叶下珠种子萌发的影响[j].中国中药杂志,2009,34(7):916-918.公开了叶下珠phyllanthusurinarial.为大戟科叶下珠属植物，全草入药，有清肝明目、利尿、降血糖、降压、解毒和消积等功效。其活性成分主要为酚类、萜类、黄酮、生物碱以及脂类化合物，其中短叶苏木酚酸甲酯等成分具明显的抗乙肝病毒的活性和护肝作用。乙型肝炎病毒(hbv)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体，属嗜肝dna病毒科，主要通过血液、血液制品等传播、母婴垂直传播、密切接触传播、医源性传播。hbv通过低亲和力受体(如硫酸乙酰肝素、蛋白多糖等)，黏附到肝细胞表面，再通过大包膜蛋白的pres1区与病毒受体结合介导细胞对病毒的内吞作用。在内吞体病毒包膜和吞体膜融合将衣壳释放入细胞质，衣壳被运送至核孔复合体，内部的病毒基因组rcdna释放入细胞核。在细胞核内，rcdna可能通过细胞的dna复制机制转化成共价闭合环状dna(cccdna)。病毒利用cccdna转录出3.5kb，2.4kb，2.1kb及约0.8kb的mrna，其中3.5kb为前基因组rna(pgrna)，可反转录出基因组dna并作为编码病毒核心蛋白和聚合酶蛋白的模板，hbsag合成后在粗面内质网中多聚化，并转运至高尔基体前腔以包装核心颗粒，装配好的hbv颗粒与亚病毒颗粒转运至高尔基体进行hbsag的糖基化修饰，最后以出芽方式将完整的病毒粒子分泌出宿主细胞而完成生活周期。

流感病毒是正粘病毒科(orthomyxoviridae)的代表种，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(a)、乙(b)、丙(c)三型。甲型流感病毒经常发生抗原变异，可以进一步分为h1n1、h3n2、h5n1、h7n9等亚型(其中的h和n分别代表流感病毒两种表面糖蛋白)。流感病毒侵袭的目标是呼吸道粘膜上皮细胞。主要传播途径是带有流感病毒的飞沫，经呼吸道进入体内。少数也可经共用手帕、毛巾等间接接触而感染。流感病毒侵入体内后依靠血凝素吸附于宿主细胞表面，经过吞饮进入胞浆；进入胞浆之后病毒包膜与细胞膜融合释放出包含的ss-rna；ss-rna的八个节段在胞浆内编码rna多聚酶、核蛋白、基质蛋白、膜蛋白、血凝素、神经氨酸酶、非结构蛋白等构件；基质蛋白、膜蛋白、血凝素、神经氨酸酶等编码蛋白在内质网或高尔基体上组装m蛋白和包膜；在细胞核内，病毒的遗传物质不断复制并与核蛋白、rna多聚酶等组建病毒核心；最终病毒核心与膜上的m蛋白和包膜结合，经过出芽释放到细胞之外，复制的周期大约8个小时。严重的流感病毒具有传播快，致死率高的特点。

目前我国常用的抗流感病毒药物主要有疫苗、离子通道m2蛋白阻抑剂和神经氨酸酶抑制剂。

疫苗：目前我国主要有病毒火活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗等三类流感疫苗。其中全病毒火活疫苗临床治疗效果最好，但是可诱使12岁以下儿童出现腹泻、腹痛、头晕、头痛等不良反应。

离子通道m2蛋白阻抑剂：金刚烷胺和金刚乙胺均是通过阻断流感病毒m2蛋白与宿主细胞蛋白进行结合，阻断流感病毒核心rna以及相关酶的释放，从而中断流感病毒的复制繁殖作用，达到抗病毒作用。但是，长期大量服用，患者可出现精神混乱、头晕、头痛、嗜睡、恶心等不良反应。

神经氨酸酶抑制剂：临床最为常用的神经氨酸酶抑制剂主要有奥司他韦和扎那米韦。通过抑制神经氨酸酶的活性，能有效降低流感病毒的活性，减少流感病毒对正常细胞的感染。临床研究发现奥司他韦对于患有心脏病以及慢性非阻塞性肺病的老年患者出现恶心、呕吐等不良反应的患者例数明显高出使用安慰剂的患者。扎那米韦可以通过口服给药、鼻内给药以及静脉注射给药等多种途径给药，其中口服给药其生物利用度高，半衰期短，经由肾脏排泄率低，对于患有慢性非阻塞性肺病的患者可导致患者出现支气管痉挛，因此对于患有哮喘或者慢性阻滞性肺病的患者在给药的同时，应给予快速扩张器官药。

其他类：盐酸巴比多尔可以抑制流感病毒脂膜与宿主细胞表面蛋白的融合从而起到抗病毒的作用，ifn-β干扰素可以有效激活细胞内抗病毒蛋白基因，从而抑制病毒蛋白质合成。

上述药物中多为化学合成药物，具有一定副作用，因此从天然物质中提取抗流感病毒的有效成分具有重大意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供短叶苏木酚酸甲酯在制备抗流感病毒药物中的应用。

发明人通过实验发现，短叶苏木酚酸甲酯在0.78～100μg/ml范围内表现出较强的抗甲型流感病毒h1n1亚型的作用，其ic50值为18.90±5.65μmol/l，与对照药物利巴韦林(ic50＝0.56±1.10μmol/l)相比稍低。空斑实验结果显示短叶苏木酚酸甲酯对h1n1病毒引起mdck细胞(犬肾上皮细胞)形成的空斑具有抑制作用并具有浓度依赖性。短叶苏木酚酸甲酯能够抑制病毒np蛋白和pb2聚合酶在mdck细胞中的表达，且随着浓度的增加，抑制作用增强。同时短叶苏木酚酸甲酯对h3n2亚型病毒也具有抑制作用，其ic50＝71.74±1.48μg/ml。

本发明所采取的技术方案是：

短叶苏木酚酸酯在制备抗流感病毒药物中的应用。

作为上述应用的进一步改进，短叶苏木酚酸酯为短叶苏木酚酸药学上可接受的酯。

作为上述应用的进一步改进，短叶苏木酚酸酯药学上可接受的酯为其c1～c4的酯。

作为上述应用的进一步改进，短叶苏木酚酸酯为短叶苏木酚酸甲酯。

一种治疗流感的组合物，其活性成分包括短叶苏木酚酸酯，以及至少一种抗流感病毒的活性成分，或一种改善流感症状的活性成分。

作为上述组合物的进一步改进，短叶苏木酚酸酯药学上可接受的酯为其c1～c4的酯。进一步的，短叶苏木酚酸酯为短叶苏木酚酸甲酯。

本发明的有益效果是：

短叶苏木酚酸甲酯在0.78～100μg/ml范围内表现出较强的抗甲型流感病毒h1n1亚型的作用，其ic50值为18.90±5.65μmol/l，与对照药物利巴韦林(ic50＝0.56±1.10μmol/l)相比稍低。空斑实验结果显示短叶苏木酚酸甲酯对h1n1病毒引起mdck细胞(犬肾上皮细胞)形成的空斑具有抑制作用并具有浓度依赖性。短叶苏木酚酸甲酯能够抑制病毒np蛋白和pb2聚合酶在mdck细胞中的表达，且随着浓度的增加，抑制作用增强。同时短叶苏木酚酸甲酯对h3n2亚型病毒也具有抑制作用，其ic50＝71.74±1.48μg/ml。

附图说明

图1是短叶苏木酚酸甲酯对mdck细胞活力的影响；

图2是短叶苏木酚酸甲酯对h1n1抑制作用；

图3是短叶苏木酚酸甲酯抑制病毒引起空斑的形成；

图4是短叶苏木酚酸甲酯对病毒np和pb2在mdck细胞中表达的抑制作用；

图5是短叶苏木酚酸甲酯对h3n2的抑制作用。

具体实施方式

短叶苏木酚酸酯在制备抗流感病毒药物中的应用。

作为上述应用的进一步改进，短叶苏木酚酸酯为短叶苏木酚酸药学上可接受的酯。

作为上述应用的进一步改进，短叶苏木酚酸酯药学上可接受的酯为其c1～c4的酯。

作为上述应用的进一步改进，短叶苏木酚酸酯为短叶苏木酚酸甲酯。

一种治疗流感的组合物，其活性成分包括短叶苏木酚酸酯，以及至少一种抗流感病毒的活性成分，或一种改善流感症状的活性成分。

作为上述组合物的进一步改进，短叶苏木酚酸酯药学上可接受的酯为其c1～c4的酯。进一步的，短叶苏木酚酸酯为短叶苏木酚酸甲酯。

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

抗流感病毒活性

细胞与病毒：

mdck细胞：犬肾上皮细胞，由本实验室于液氮中保存，复苏后用含10％fbs，1％青霉素、链霉素的dmem高糖培养基进行培养。

毒株：甲型流感病毒a/puertorico/8/34(h1n1)

1.化合物的细胞毒性

mtt法测定短叶苏木酚酸甲酯对mdck细胞的毒性：

1)mdck细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板，在5％co2，37℃的细胞培养箱中培养24h；

2)将2倍梯度稀释的短叶苏木酚酸甲酯加入到96孔板中，继续培养48h后，弃上清，每孔加入100μlmtt溶液(0.5mg/ml)，在5％co2，37℃的细胞培养箱继续培养4h；

3)小心吸弃培养上清，加入150μldmso后，将培养板放置在微孔板振荡器中振荡10min，使沉积在细胞中的甲瓒完全溶解；用多功能酶标仪在570nm波长处检测各孔光吸收度，即可间接反映化合物对细胞存活率的影响。

结果如图1所示，短叶苏木酚酸甲酯对mdck细胞的半数毒性浓度(cc50)大于200μg/ml。

2.mtt检测化合物对h1n1的抑制活性

1)mdck细胞以2×10⁴个/孔接种于96孔板，在5％co2，37℃的细胞培养箱中培养24h，待细胞长至单层，弃培养上清，pbs洗2次，每孔加入100μl流感病毒液(moi＝0.01)，于5％co2，37℃的细胞培养箱中吸附细胞1h；

2)弃病毒液，加入浓度梯度的化合物(用含1μg/mltpck-胰酶的dmem配制)，在5％co2，37℃的细胞培养箱继续培养48h；

3)弃上清，每孔加入100μlmtt溶液(0.5mg/ml)，在5％co2，37℃的细胞培养箱继续培养4h；

4)小心吸弃培养上清，加入150μldmso后，将培养板放置在微孔板振荡器中振荡10min，使沉积在细胞中的甲瓒完全溶解；用多功能酶标仪在570nm波长处检测各孔光吸光度。根据吸光值的大小，计算出化合物对病毒的ic50。

结果如图2所示，mtt结果显示短叶苏木酚酸甲酯在0.78-100μg/ml范围内表现出较强的抗h1n1作用，其ic50值18.90±5.65μmol/l，与对照药物利巴韦林(ic50＝0.56±1.10μmol/l)相比稍低。

3.空斑实验检测化合物抑制病毒对细胞的感染

流感病毒感染细胞后，在细胞内大量繁殖，引起细胞代谢的变化，可导致细胞发生病变，即细胞肿胀变圆，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞会发生部分或全部脱落。因此，为研究短叶苏木酚酸甲酯的抗甲型流感病毒活性，发明人观察其对病毒引起细胞空斑的抑制作用。实验方法如下：

1)mdck细胞以2×10⁵个/孔接种于12孔板，在5％co2，37℃的细胞培养箱中培养24h，待细胞长至单层，弃培养上清，pbs洗2次，加入0.5ml病毒液(moi＝0.01)，于5％co2，37℃的细胞培养箱中吸附细胞1h；

2)弃病毒液，每孔加入1.5ml含2倍梯度稀释的化合物，2％琼脂，0.05‰deae以及1μg/mltpck-胰酶的2×mem，在5％co2，37℃的细胞培养箱继续培养72h；

3)剔除琼脂覆盖层，用4％多聚甲醛配制的0.1％结晶紫37℃染色30min～1h，吸去染液后，比较药物处理组和病毒组所形成的空斑数，检测化合物的抗病毒活性。

实验结果如图3所示，短叶苏木酚酸甲酯对病毒形成的空斑具有抑制作用并具有浓度依赖性。

4.westernblotting测定化合物抑制病毒在mdck细胞中的复制

流感病毒的核糖核蛋白复合物(vrnp)构成了病毒的核心，vrnp复合物包含了rna聚合酶(pb1、pb2、pa)和np蛋白，因此检测pb2和np蛋白在加样细胞中的表达即可反映化合物对病毒的抑制作用。通过westernblotting实验检测短叶苏木酚酸甲酯对病毒在宿主细胞内蛋白表达的影响。实验方法如下：

1)细胞的培养及处理：mdck细胞以4×10⁵个/孔接种于6孔板，在5％co2，37℃的细胞培养箱中培养24h；弃培养上清，pbs洗2次，加入1ml病毒液(moi＝0.01)，于5％co2，37℃的细胞培养箱中吸附细胞1h；弃病毒液，将2倍梯度稀释的化合物加入到6孔板中，设细胞对照孔和病毒对照孔，继续培养24h；弃上清，经预冷的pbs洗3次；

2)蛋白提取及浓度测定：弃pbs，每孔加入100μlripa裂解缓冲液(含蛋白酶、核酸酶抑制)，置于冰上裂解2min，用细胞刮子将培养皿的细胞刮下来，收集到无菌的1.5mlep管中；将ep管放置在预冷至4℃的冷冻离心机中，12000rpm离心15min，移取80μl上清蛋白样品到新的1.5mlep管中；吸取2.5μl蛋白样品，用bca蛋白定量试剂，按照试剂盒说明书，绘制标准曲线，测定蛋白浓度，对蛋白样品进行归一化定量；往蛋白样品中加入定量后的上样缓冲液和2％β-巯基乙醇，于金属浴中100℃变性5min，样品用于westernblotting；

3)westernblotting：sds-page电泳：以10％的分离胶和4％的浓缩胶，按每条泳道总蛋白量为50μg上样20μl。接通电源，浓缩胶85v，恒压电泳约15min；分离胶120v，继续电泳至蛋白标准品充分分离；电转膜(湿法)：取出凝胶，剪裁与分离胶大小一致的pvdf膜，预标记好蛋白正反面，按照阴极塑料夹板-海绵垫层-滤纸-凝胶-pvdf膜-滤纸-海绵垫层-阳极塑料夹板的方式装备转膜三明治，放置转膜槽中，100v恒压转膜75min；转膜结束后，取出pvdf膜，立即移至5％脱脂牛奶中，室温封闭1h；孵一抗：用tbs-t缓冲液室温下洗涤3次，加入含检测蛋白的一抗(5％牛血清蛋白液配制)，4℃摇床过夜；孵二抗：取出检测蛋白条带，用tbs-t缓冲液洗涤，每10min洗1次，共3次；加入含相应二抗的5％脱脂牛奶，室温孵育1h；取出条带，用tbs-t缓冲液洗涤，每5min洗1次，共6次；化学发光显影：将pvdf膜浸泡在ecl发光液中表面2min，取出吸干后，用保鲜膜包裹，放入显影暗盒中。在暗室中，在蛋白膜上方放置x-ray胶片，盖上夹子，曝光一定的时间，取出胶片，于显影液中显影，定影液中定影。

实验结果如图4所示，与病毒对照组比较，短叶苏木酚酸甲酯能够抑制np和pb2在mdck细胞中的表达，且随着浓度的增加，抑制作用增强。

5.化合物对h3n2的抑制活性

如图5所示，短叶苏木酚酸甲酯对h3n2也具有抑制作用，其ic50＝71.74±1.48μg/ml。实验方法同“2.mtt检测化合物对h1n1的抑制活性”，但其中h1n1病毒株替换成h3n2病毒株。

通过药物联用，可以获得更好的疗效。可以预见，将短叶苏木酚酸甲酯与其他抗流感病毒药物或改善感冒症状的药物联用，可以更好地用于治疗流行性感冒。