化合物的用途的制作方法

本发明涉及一种化合物的制药用途。

背景技术：

近些年来，随着环境污染加剧、人们工作压力增大以及食品安全问题的升级，恶性肿瘤的发病率攀升，癌症已成为威胁人类健康的第一杀手，肿瘤防治研究已经是亟待解决的重大社会问题。

近年来，研究表明从天然产物中寻找新型抗肿瘤药物具有广阔的前景和巨大的潜力。龙血竭为百合科剑叶龙血树的树脂，主要分布在我国云南及东南亚国家，具有活血化瘀、抗炎止痛、生肌敛疮、免疫调节等多种生理和药理作用，主要应用在心血管疾病、消化系统疾病、糖尿病及并发症、皮肤科疾病、妇科疾病和肛肠科疾病。

龙血竭75％乙醇粗提物能抑制cholangiocarcinoma细胞增殖并诱导hccc9810和qbc939细胞系凋亡，且成时间和浓度依赖性。龙血竭75％乙醇粗提物明显下调抗凋亡蛋白survivin的表达及上调促凋亡蛋白bak的表达，同时也抑制体内肿瘤生长。

从龙血竭中分离的芪类化合物中，除了紫檀芪外，4′5-二羟基-3-甲氧基二苯乙烯及白藜芦醇都具有抑制人黑色素瘤细胞hsc-1增殖的作用，并具有时效和量效关系。4′5－二羟基-3-甲氧基二苯乙烯和白藜芦醇通过诱导癌细胞凋亡，阻滞细胞周期，有效抑制体外癌细胞增殖是其抗癌作用机制之一。

此外，龙血竭中包含的抗肿瘤作用成分afromontoside在抑制鼻咽癌kb细胞活性、gracillin抑制宫颈癌细胞、甾体皂苷类抑制白血病hl260细胞生长等方面都有报道。

如下所示的式(ⅰ)所示化合物是从龙血竭中分离到的一种化学成分，但尚未见任何有关其药理活性的报道：

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种化合物用于制备抗肿瘤的药物的用途。本发明的目的是通过如下技术方案实现的。

一种化合物、其前药或其药用盐用于制备抗肿瘤药物的用途，所述化合物具有如式(i)所示的结构：

根据本发明的用途，优选地，所述药用盐选自盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、延胡索酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、琥珀酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐或乳酸盐中的任意一种。

根据本发明的用途，优选地，所述抗肿瘤药物以所述化合物、其前药或其药用盐为唯一活性成分。

根据本发明的用途，优选地，所述抗肿瘤药物还包含药学上可接受的辅料。

根据本发明的用途，优选地，所述抗肿瘤药物为原料药或制剂。

根据本发明的用途，优选地，所述制剂选自片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、口服液或注射剂。

根据本发明的用途，优选地，所述制剂为缓释剂型或控释剂型。

根据本发明的用途，优选地，所述肿瘤为mtor信号通路过度活化所致的肿瘤。

根据本发明的用途，优选地，所述抗肿瘤药物通过上调mapk信号通路并且抑制mtor信号通路而实现抗肿瘤作用。

根据本发明的用途，优选地，所述肿瘤为肝癌。

本发明的化合物、前药或药用盐可用于制备抗肿瘤药物。该化合物对肿瘤细胞，特别是人肝癌细胞具有良好的细胞毒活性，可有效抑制人肝癌细胞增殖，促进细胞凋亡的发生，抑制人肝癌细胞的迁移、侵袭能力，而且具有良好的抗血管形成活性，通过上调mapk信号通路并且抑制mtor信号通路而实现抗肿瘤作用。本发明的化合物、前药、药用盐特别适合mtor信号通路过度活化所致的肿瘤的治疗，特别是肝癌的治疗。

附图说明

图1为人肝癌细胞系hepg2、skhep-1经0、5、10μm的式(ⅰ)所示的化合物处理48小时后、经hoechst33258染液避光染色后的照片。

图2为huvec细胞经0、3、6、9μm的式(ⅰ)所示化合物预处理24h后的微管形成情况的照片。

图3为mapk信号通路和mtor信号通路中的关键蛋白电泳图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

本发明的化合物的结构如下所示：

本发明中，所述化合物的分子式为c32h32o6，分子量为512。该化合物为已知化合物，可以采用已知的方法制备得到，例如采用文献《龙血竭总酚提取物中的黄酮二聚体》(dao-ranpang,etc.,flavonoiddimersfromthetotalphenolicextractofchinesedragon’sblood,theredresinofdracaenacochinchinensis,fitoterapia，2016，115(p135-141))公开的方法制备得到。

本发明中，前药是指药物经过化学结构修饰后得到的在体外无活性或活性较小、在体内经酶或非酶的转化释放出本发明化合物而发挥药效的化合物。

本发明中，所述药用盐可以为药学上可接受的任意种类的盐，不做具体限制。例如，所述药用盐可以选自盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、延胡索酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、琥珀酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐或乳酸盐中的任意一种。

本发明中，所述抗肿瘤药物可以以式(ⅰ)所示化合物、前药或其药用盐为唯一活性成分；也可以包含其他具有抗肿瘤活性的活性成分，或者包含本身不具有抗肿瘤作用、但能够辅助式(ⅰ)所示化合物、前药或其药用盐发挥抗肿瘤作用的活性成分。

本发明中，所述抗肿瘤药物可以包含药学上可接受的辅料。所述药学上可接受的辅料的种类不做限制。

本发明中，所述抗肿瘤药物可以为原料药，也可以为制剂。所述制剂的剂型可以为任意药用剂型，不做特别限制。优选地，所述剂型为口服剂型或注射剂型，更优选为口服剂型。所述口服剂型可以为缓释或控释剂型，例如缓释胶囊剂、缓释片剂等。例如，所述剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、口服液、注射剂等。

本发明中，所述肿瘤可以为任意肿瘤，特别是恶性肿瘤(癌症)。mtor(mammaliantargetofrapamycin)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能被雷帕霉素(rapamycin)特异性抑制。mtor信号通路能够调节细胞增殖、细胞凋亡、血管形成、侵袭迁移、细胞分化、能量代谢、自噬、蛋白翻译等细胞生物学过程。mtor信号通路异常(如过度活化)在肿瘤的发生发展过程中非常常见。针对肿瘤信号通路的抗癌药物具有选择性高，副作用低的特点。本发明的化合物、前药、药用盐能够通过有效抑制mtor信号通路而实现抗肿瘤作用。因此，根据本发明的一个实施方式，所述肿瘤为mtor信号通路过度活化所致的肿瘤。本发明的化合物、前药或其药用盐能够通过抑制mtor信号通路而实现抗肿瘤作用。本发明中，所述化合物、前药、药用盐还能够通过上调mapk信号通路而实现抗肿瘤作用。

本发明中，优选地，所述肿瘤为肝癌。所述式(ⅰ)所示化合物、前药或其药用盐对人肝癌细胞具有良好的细胞毒活性，可有效抑制人肝癌细胞增殖，促进细胞凋亡的发生，抑制人肝癌细胞的迁移、侵袭能力，而且具有良好的抗血管形成活性。

以下通过实施例对本发明进行详细说明。

以下实施例中，各试剂、抗体、细胞系的来源如下：

dmem基础培养基、胎牛血清、青霉素链霉素混合液、0.25％胰蛋白酶-edta、二甲基亚砜dmso、流式凋亡检测试剂盒、β-actin购于santacruz公司；ps6、s6、p-p38、p38、p-erk、erk购于cst公司；人肝癌细胞系skhep-1、hepg2细胞，人脐静脉内皮细胞huvec购自美国atcc。skhep-1、hepg2、huvec细胞用dmem完全培养基培养(含有10％的fbs、100u/ml青霉素、100g/ml链霉素)，细胞培养条件为37℃，5％co2，饱和湿度培养。

实施例1-细胞增殖实验

实验方法：

取对数生长期的hepg2、skhep-1细胞，分别制备细胞悬液，调整细胞数量为3.5×10⁴个/ml～4.0×10⁴个/ml，加入96孔板，每孔100μl。细胞培养24小时使其完全贴壁，将式(ⅰ)所示化合物的母液用完全培养基稀释成不同浓度的工作液，每个浓度设置5个复孔。分别于加药后24小时，48小时，72小时后，析出孔板中原来的培养基，将5mg/mlmtt试剂用基础培养基配成10％的浓度并加入到96孔板中，将孔板放在37℃浮箱孵育作用4小时，取出，每孔加入150μldmso溶解震摇10min，酶标仪测定测量波长570nm，进行od值的测量。计算药物对细胞增殖的抑制率。

实验结果：

采用mtt法分别测定了0～10μm浓度下的式(ⅰ)所示化合物对人肝癌细胞系hepg2、skhep-1增殖活性的影响，结果如表1所示。对照组(0μm)对人肝癌细胞系hepg2、skhep-1增殖活性没有抑制作用；随着药物浓度的增加，增殖抑制率越来越大。式(ⅰ)所示化合物作用hepg2、skhep-1细胞48h，其ic50分别为12.37μm、20.60μm。由此可见，式(ⅰ)所示化合物对人肝癌细胞具有明显的增殖抑制作用。

表1

实施例2-细胞凋亡实验

实验方法：

(1)hoechst染色法：取对数生长期的hepg2、skhep-1细胞，用完全培养基吹打成单细胞悬液接种在12孔板中，放在培养箱中培养24h使其贴壁后，分别加入不同浓度的式(ⅰ)所示化合物培养48h，用pbs清洗两次，用4％的多聚甲醛固定10min，用终浓度为1μg/ml的hoechst33258染液避光染色30min，置于倒置荧光显微镜下，观察，拍照。实验至少独立重复三次。

(2)流式细胞术测定法:hepg2、skhep-1细胞浓度分别为1x105/ml接种在6孔板中，过夜贴壁后，分别加入终浓度为0，5，10，15μm的式(ⅰ)所示化合物，培养48h，按annexinv-fitc/pi检测试剂盒方法操作进行。简言之，以0.25％胰蛋白酶(不含edta)消化成单细胞悬液进行实验，使得收集的细胞总数约为1x106。用pbs洗细胞2次(1000rpm离心，5min)后收集细胞。加入300μl的annexinvbindingbuffer悬浮细胞。加入5μlannexinv–fitc和5μlpropidiumiodide混匀。避光，室温反应15min，流式细胞仪分析。

实验结果：

(1)人肝癌细胞系hepg2、skhep-1经0、5、10μm的式(ⅰ)所示化合物处理48小时后经hoechst33258染液避光染色。结果如图1所示。

(2)人肝癌细胞系hepg2、skhep-1经0、5、10、15μm的式(ⅰ)所示化合物处理48小时后，经annexinv-fitc/pi染色后，利用流式细胞仪检测可得到细胞早期调亡、晚期凋亡、坏死和活细胞百分率。结果如表2所示。随着给药浓度的上升，肿瘤细胞凋亡率逐渐升高，细胞凋亡率与剂量成正相关。

表2

实施例3-细胞划痕实验

实验方法：

将hepg2、skhep-1细胞接种在12孔板中，待细胞处于亚融合状态时，换用无血清的dmem高糖养基饥饿培养12h。用10μl的白色枪头垂直轻柔划痕，均匀用力。1×pbs清洗因划痕而飘起的细胞碎片，至少3次。拍照，作为加药前的空白对照。用不含血清的基础培养基将式(ⅰ)所示化合物母液稀释成0，2，4，8μm的工作液，分别加药刺激细胞，划痕后12h，24h于相差显微镜下观察拍照，评价细胞迁移能力的大小。

实验结果：

细胞划痕实验被用来评价细胞体外的迁移能力。观察不同浓度的式(ⅰ)所示化合物对hepg2、skhep-1细胞体外迁移能力的影响。所选择的给药浓度均在低细胞毒的范围内，进一步排除因细胞毒作用而致使细胞的迁移能力受到抑制的可能。每种肿瘤细胞根据其自身迁移能力的强弱调整实验条件进而开展试验。结果如表3所示。对照组(0μm)对hepg2、skhep-1细胞不显示迁移抑制作用；hepg2、skhep-1细胞随着药物浓度的升高，划痕愈合能力减弱。因此，式(ⅰ)所示化合物可以在细胞毒较低的浓度范围内良好地抑制肿瘤细胞的迁移。

表3

实施例4-细胞侵袭实验

实验方法：

取对数生长期的hepg2、skhep-1细胞，更换培养液为无血清的培养液饥饿12h，以减少血清的干扰。将transwell小室置于24孔板中，将matrigel胶与细胞培养基按1:12比例混匀。取60μl均匀铺到transwell小室的上室中，操作易轻柔，避免气泡产生。将铺好matrigel胶的小室放在细胞培养箱内，时间控制在半小时到四小时之间，使胶凝固。将细胞消化后离心，用无血清培养基悬浮，细胞计数板计数5×10⁵/ml，下室加入750μl含10％fbs的完全培养基，上室加入200μl无血清培养基的细胞悬液。于细胞培养箱内培养36h后，用棉签擦掉上室细胞，多聚甲醛通透4min，甲醇固定15min，结晶紫染色10min后用pbs冲洗小室，将染料去除，显微镜下取样，拍照，计算视野内细胞的数量。

实验结果：

transwell实验被用来评价细胞体外的侵袭能力。观察不同浓度的式(ⅰ)所示化合物对hepg2、skhep-1细胞体外侵袭能力的影响。所选择的给药浓度同样均在低细胞毒的范围内，每种肿瘤细胞根据其自身侵袭能力的强弱调整实验条件进而开展试验。与对照组0μm相比，随着给药浓度的升高，穿越小室的细胞数目均逐渐下降。式(ⅰ)所示化合物对人肝癌细胞侵袭的抑制率如表4所示。对照组(0μm)对hepg2、skhep-1肿瘤细胞的侵袭不显示抑制作用；式(ⅰ)所示化合物对肿瘤细胞的侵袭能力具有良好的抑制作用。

表4

实施例5-微管形成实验

实验方法：

取对数生长期的huvec细胞，以1×10⁵/ml的细胞密度接种在6孔板中，过夜贴壁后，分别加入终浓度为0，3，6，9μm的式(ⅰ)所示化合物，培养24h。将4℃过夜化冻的matrigel人工基质胶平铺于96孔板的孔底，每孔70μl，放于5％co2、37℃恒温培养箱内30min使胶固化，处理过的各组huvec细胞用dmem完全培养基稀释为密度为1×10⁵/ml的细胞悬液，接种于上述铺好胶的96孔板，每孔200μl，常规培养10h，每隔2小时观察微管样结构形成情况，倒置显微镜下随机取5个视野拍照。实验重复三次。

实验结果：

血管生成在肿瘤的生长、转移以及复发的过程中扮演重要角色。血管生成是一个涉及多步骤的复杂的过程，主要包括：血管基底膜的降解；血管内皮细胞的增殖、迁移；新的血管网络的形成。为了研究式(ⅰ)所示化合物对血管形成的作用，我们开展了细胞增殖抑制实验。

将不同浓度的式(ⅰ)所示化合物(0、5、10、15、20μm)作用于人脐静脉血管内皮细胞huvec，48h后mtt法检测结果如表5所示。对照组(0μm)对huvec的增殖不显示抑制作用；随着给药浓度的逐渐上升，对huvec的增殖抑制率逐渐增加。

表5

内皮细胞可以在matrigel胶上融和成微管，可以利用内皮细胞的这种成管特性来研究药物对内皮细胞成管的作用。式(ⅰ)所示化合物(0、3、6、9μm)预处理huvec细胞24h后，观察其成管能力，结果如图2所示，在低浓度3μm时微管的形成受影响较小，在9μm的药物作用下，微管形成的阻断效果很明显，仅局部形成一些细、短、小的管，或者是一些小环。

实施例6-westernblotting

实验方法：

细胞用预冷的1×pbs洗两遍，然后加入适量裂解液，用细胞刮刀将细胞和裂解液刮入1.5mlep管中，98℃煮沸10分钟，然后离心。取15孔8％～15％sds-page蛋白胶，蛋白样品加样量为15μl/孔，电泳，转膜，5％脱脂奶粉(tbst稀释)室温轻摇封闭1小时，用抗体稀释剂将相应的一抗稀释到浓度为1:1000，4℃过夜孵育，1×tbst漂洗3次，每次10min，hrp标记二抗用抗体稀释剂稀释，终浓度为1:5000或1:10000，室温摇床轻摇4h，曝光、显影。

实验结果：

mapk信号通路主要包括jnk、p38和erk，该通路被激活在一定程度上可以促进肿瘤细胞的凋亡。对mapk信号通路中的几个关键蛋白的表达的检测结果见图3。结果显示，在hepg2、skhep-1细胞中erk和p38的磷酸化水平随着式(ⅰ)所示化合物给药浓度的上升而增加，提示式(ⅰ)所示化合物能够激活mapk信号通路。

mtor信号通路的激活与肿瘤关系密切，在肿瘤血管形成、加速细胞周期、抑制细胞凋亡等方面发挥重要作用，肿瘤细胞中经常存在着mtor信号通路的持续激活。为了研究式(ⅰ)所示化合物对mtor信号通路的影响，检测了相关蛋白的表达，结果如图3所示。随着给药浓度的上升，在hepg2和skhep-1细胞中式(ⅰ)所示化合物可明显降低p-s6(p-s6是mtor活性的标志物)的蛋白水平，提示式(ⅰ)所示化合物能够抑制mtor信号通路。

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。