一种抗肿瘤药物的作用靶点及抗肿瘤药物的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种抗肿瘤药物的作用靶点及抗肿瘤药物。

背景技术

肿瘤是危害人类健康和生命的主要疾病，目前肿瘤治疗主要以手术治疗为主，辅助化疗、放疗或者生物治疗方式，有临床实践证明，部分早期恶性程度低或者某些特定肿瘤可以通过一定的方法根治，但是单靠手术治疗不能防止肿瘤的复发和远处转移，放疗虽然已经能根治多种肿瘤，但仍有一定的局限性，化疗的发展史较短，但对于某些肿瘤已取得相当高的治愈率，作为一种全身性的治疗方法，较之其他方法可能最大程度的杀灭患者体内的肿瘤细胞，而且化疗正在从姑息治疗向根治水平过渡，因此化疗在肿瘤治疗中占有十分重要的地位。但是化疗对肿瘤细胞的选择性抑制作用差，而且全身用药副作用大，包括消化道反应、骨髓抑制、脱发、心肝肾等重要器官不良反应以及远期的致癌和致畸等都限制了其应用范围，因此提高化疗药的疗效对于肿瘤治疗意义重大。

肿瘤的靶向治疗是目前肿瘤治疗领域前景广阔的新方法，通过抑制vegf或者egf均可抑制肿瘤的生长(benevento,i.,defelice,f.,musio,d.,andtombolini,v.theadditionoftargettherapytoneoadjuvantchemoradiotherapyinlocallyadvancedrectalcancer.chemotherapy.2017.)；通过carf敲除可降低肿瘤的生长速度以及其肺部转移(kalras,chaudharya,yoonar，etal.carfenrichmentpromotesepithelial-mesenchymaltransitionviawnt/β-cateninsignaling:itsclinicalrelevanceandpotentialasatherapeutictarget.oncogenesis.2018.)；通过靶向抑制黑色素瘤细胞上的pd-1因子，可以抑制肿瘤的生长速度(sonjak,christianp,stevenr.b，thomass.k,tobiass，etal.melanomacell-intrinsicpd-1receptorfunctionspromotetumorgrowth.cell.2015.)。因此肿瘤的靶向治疗结合化疗为肿瘤治疗提供了新思路，寻找新的提高化疗疗效的方式有重大意义。

已有文献报道人外周血中的b细胞可共表达cd39和cd73两种外核苷酸酶，这两种分子可以介导atp的降解以及腺苷的合成，从而执行免疫抑制功能。

技术实现要素：

本发明提供了一种抗肿瘤药物的作用靶点及抗肿瘤药物。

本发明经研究发现，荷瘤小鼠血清中的cd19⁺evs含量远高于正常小鼠，并且是因为b细胞分泌的evs增多。通过对于影响evs分泌的相关因子检测，发现rab27a介导了这一过程，荷瘤小鼠b细胞中rab27a表达水平升高，促进b细胞释放更多的evs。通过使用针对rab27a基因的sirna干扰，降低细胞中rab27a的表达水平，可以有效抑制b细胞分泌cd19⁺evs，结果发现能大大提高化疗的疗效。

本发明提供了一种抗肿瘤药物的作用靶点，所述作用靶点为人rab27a基因或其表达产物rab27a蛋白。

本发明又提供了人rab27a基因或其表达产物rab27a蛋白作为靶点在抗肿瘤药物开发中的应用。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物能够降低人rab27a基因表达或减弱rab27a蛋白的活性。所述抗肿瘤药物可以是小分子化学药物，也可以是针对rab27a蛋白的单抗类药物，或者rna干扰类药物。

所述的抗肿瘤药物，有效成分为能够特异性敲低人rab27a基因表达的sirna。优选的，所述sirna的序列为：

正义链序列：5’-cggaucaguuaagugaagaaadtdt-3’，

反义链序列：5’-uuucuucacuuaacugauccgdtdt-3’。

优选的，在使用时，所述抗肿瘤药物与化疗药物联用。

所述抗肿瘤药物用于降低人rab27a基因表达或减弱rab27a蛋白的活性，从而有效抑制b细胞分泌cd19⁺evs，而人外周血中的b细胞可共表达cd39和cd73两种外核苷酸酶，这两种分子可以介导atp的降解以及腺苷的合成，从而执行免疫抑制功能。经研究发现b细胞分泌的evs也能够携带cd39和cd73，这些evs能够通过循环系统到达肿瘤微环境，对于肿瘤的发展以及治疗疗效能够产生一定产生影响。cd19⁺evs具有免疫抑制作用，其作用以一种剂量依赖方式作用于atp将其水解为腺苷，化疗中产生的大量atp因此被降解为腺苷而大大削弱化疗的疗效。所以，根据上述作用原理，本发明所述抗肿瘤药物对一般的肿瘤均有效果。优选的，所述抗肿瘤药物用于治疗肠癌。

本发明经研究发现，cd19⁺evs可作为一种新的体外早期肿瘤的临床检验指标，对比荷瘤小鼠与正常小鼠，发现荷瘤小鼠血清中cd19⁺evs水平明显升高，并进一步探究了影响cd19⁺evs水平的因素，发现荷瘤小鼠b细胞中rab27a蛋白水平升高，促进b细胞释放更多的evs。通过使用针对rab27a基因的sirna干扰，降低细胞中rab27a蛋白水平的表达，可以有效抑制b细胞分泌cd19⁺evs，结果发现能大大提高化疗的疗效。

附图说明

图1为小鼠结肠癌mc38肿瘤模型实验血清中和脾脏中cd19⁺evs水平检测结果图，其中图a为标准曲线，图b为血清，图c为脾脏，“***”表示p＜0.001(下同)。

图2为荷瘤小鼠和正常小鼠脾脏中cd19⁺b细胞数目及比例的的对比结果图，其中图a为脾脏总细胞数目，图b为其中cd19阳性细胞比例，图c为其中cd19阳性细胞数目，“**”表示p＜0.01，“*”表示p＜0.05(下同)。

图3为对荷瘤小鼠和正常小鼠中影响b细胞分泌囊泡能力的分子进行筛选的结果图，分别为rab1b、rab2b、rab5b、rab5c、rab6a、rab7、rab11、rab27a、rab27b、rab35、smad3、tsg101。

图4为对荷瘤小鼠和正常小鼠b细胞中rab27a及rab27b蛋白表达水平比较结果图。

图5为体外敲低raji细胞系的rab27a后检测细胞对应的分泌囊泡水平结果图，其中，图a为rab27a的表达水平westernbloting检测结果，图b为酶标仪检测evs含量结果，图c为流式分析检测evs含量结果柱状图，图d为流式分析检测evs结果图。

图6为体外敲低raji细胞系的rab27b后检测细胞对应的分泌囊泡水平结果图，其中，图a为rab27b的表达水平westernbloting检测结果，图b为酶标仪检测evs含量结果，图c为流式分析检测evs含量结果柱状图，图d为流式分析检测evs结果图。

图7为在条件性敲除rab27a小鼠体内b细胞的敲低情况检测结果图，其中图a为转录水平检测结果，图b为蛋白水平检测结果。

图8为使用条件性敲除rab27a小鼠构建mc38肿瘤模型，给予化疗治疗，观察肿瘤大小以及生存率的变化的结果图，其中，图a为肿瘤大小结果，图b为生存率结果。

图9为b-nsg小鼠人源化重构效果流式检测图，其中，图a为cd45阳性的免疫细胞，图b为cd4阳性的t细胞，图c为cd8阳性的t细胞，图d为cd19阳性的b细胞。

图10是fam-labeledrab27asirna进入灭活的ebv结果图，其中图a为不同孵育时间比较，曲线1为对照，曲线2为4h，曲线3为2h，图b为不同sirna浓度比较，曲线1为对照，曲线2为10μm，曲线3为20μm，曲线4为30μm。

图11为rab27asirna与灭活ebv体外共孵育后体外感染人b淋巴瘤细胞raji，rab27a蛋白表达水平结果图，其中，图a和b为荧光显微镜观察图，图c为westernbloting检测图。

图12为rab27asirna与灭活ebv体外共孵育后体外感染人b淋巴瘤细胞raji，raji细胞分泌evs结果图。

图13为rab27asirna与灭活ebv体外共孵育后感染人外周血单核细胞分离得到的b细胞，rab27a表达水平结果图。

图14为实施例13中小鼠处理方式示意图。

图15为实施例13中小鼠生存率与生存时间关系图。

图16为实施例13中小鼠肿瘤大小与生存时间关系图。

图17为实施例13中重构荷瘤小鼠肿瘤大小与生存时间关系图。

图18为实施例13中重构荷瘤小鼠生存率与生存时间关系图。

具体实施方式

雌性c57bl/6(6-8周)小鼠购买于上海斯莱克实验动物有限公司；cd19-cre小鼠购买于thejacksonlaboratory；rab27a^fl/fl小鼠购买于广州赛亚生物生物科技有限公司；hif1α^fl/fl小鼠由复旦大学刘光伟教授提供；nodprkdc^scidil2rg^-/-(nsg)小鼠购买于北京百奥赛图生物技术有限公司。所有小鼠均培育于spf级设施。人结肠癌细胞系lovo、小鼠结肠癌细胞系mc38购买于美国菌种保藏中心(atcc)，b淋巴瘤细胞系raji和b95-8购买于中科院细胞库。

实施例1

以雌性spf级c57bl/6为实验对象，利用小鼠结肠癌细胞系mc38构建荷瘤小鼠模型，采用酶联免疫吸附双抗体夹心法检测血清以及脾脏组织上清液中的cd19⁺evs含量。

使用酶联免疫吸附双抗体夹心法(elisa)检测血清中cd19阳性的外泌体(cd19⁺evs)含量。具体步骤如下：

(1)收集小鼠脾脏组织，用注射器的活塞挤压以制成组织悬液；(2)转移到15ml的圆锥形试管中并使大块沉淀到试管底部或者通过尼龙滤网过滤，得到单细胞悬液；(3)1500rpm，4℃离心沉淀细胞悬液4-5分钟，收集上清；(4)取小鼠外周血与1.5ml管，室温静置2小时后，4℃过夜，第二天4000rpm，20分钟离心，吸取上清；(5)以elisa包被缓冲液为介质，抗rab5b的抗体(santacruz，货号sc-373725)作为包被抗体，抗体终浓度是4μg/ml，4℃包被96孔酶标板过夜；(2)含0.05％吐温的pbs缓冲液(pbst)洗板4遍后，用含10％胎牛血清的pbs缓冲液，室温封闭1小时；(3)pbst洗板4次后，加入100μl待检血清，37℃孵育过夜；(4)pbst洗板4次后，以含10％胎牛血清的pbs缓冲液为介质，抗cd19的抗体(ebioscience，货号13-0199-82)为检测抗体，终浓度为4μg/ml，37℃孵育1小时；(5)pbst洗板4次后，加入100μl的avidin-hrp(ebioscience，货号18-4100)室温孵育1小时；(6)pbst洗板6次后，加入0.3mg/ml的二甲基联苯胺底物室温反应15分钟；(7)加入50μl1n的h2so4终止反应，450nm测量吸光度(od)值；(8)根据标准曲线计算得到待检测样品中相对的cd19⁺-exo含量。

根据elisa的检测原理，最终测得的od值实际是由外泌体中cd19分子的绝对数量决定，而cd19分子绝对数量与外泌体的质量成正比。如果1μgsp-evs与nμg血清cd19⁺evs均含有x个cd19分子，那么它们将对应相同的od值。根据按上述步骤(1)～(7)方法测得某一血清样品od值后，通过标准曲线计算出的外泌体质量，需要乘以系数n，才为实际血清中cd19⁺evs的质量。在n系数未知的情况下，所测得的血清中cd19⁺evs的质量均为相对质量。

标准曲线确定：将已知浓度的raji-evs按浓度梯度稀释，然后按上述步骤(1)～(7)方法检测各浓度下的od值，计算获得cd19阳性的外泌体含量与吸光度(od)值相互关系的标准曲线。每次实验均独立制作标准曲线。在此，列举了某次实验为制作标准曲线所选取sp-evs的浓度及对应的od值。检测了0、3.75、7.5、15、30μg的sp-evs对应的od值分别为0.065、0.258、0.465、0.968、1.831，sp-exo的质量与od值之间的线性方程为y＝16.748x-0.7651，r²＝0.999，其中x为od值，y为sp-exo的质量(μg)(图1a)。

对每组7只正常小鼠和荷瘤小鼠的血清和脾脏上清cd19⁺evs检测结果如图1b和1c所示，血清和脾脏上清中两种小鼠的cd19⁺evs均有明显差异，荷瘤小鼠血清和脾脏上清中cd19⁺evs明显高于正常小鼠。

实施例2

采用流式细胞术对正常小鼠和荷瘤小鼠的脾脏b细胞进行计数和比例分析。步骤如下：

(1)收集小鼠脾脏组织，用注射器的活塞挤压以制成组织悬液；(2)转移到15ml的圆锥形试管中并使大块沉淀到试管底部或者通过尼龙滤网过滤，得到单细胞悬液；(3)1500rpm，4℃离心沉淀细胞悬液4-5分钟，弃掉上清；(4)上一过程得到的沉淀，用红细胞裂解液裂解红细胞，加入两倍体积的无血清1640培养基，同样条件下离心，弃掉上清；(5)用2mlpbs缓冲液重悬样本，进行细胞计数；(6)再次离心细胞，弃掉上清，重悬细胞使其细胞数达到1×10⁷个/ml；(7)取出1×10⁷个细胞离心获得细胞沉淀，以0.5μlanti-mousecd19apc(biolegend，货号152409)流式抗体溶于100μlpbs，重悬细胞，室温避光染色20分钟；(8)pbs缓冲液洗两遍，500μlpbs缓冲液重悬上机；(9)根据一定体积内细胞数目计算总细胞数，结果如图2。

设置分组为每组3到4只小鼠，与正常小鼠相比，荷瘤小鼠的脾脏细胞数目明显增多(图2a)，但是cd19阳性的细胞比例明显低于正常组(图2b)，cd19阳性的细胞数目基本相同(图2c)，说明荷瘤小鼠体内evs分泌增多并非由于cd19阳性细胞数目增多，而是由于细胞分泌能力增强所致。

实施例3

由于rab家族对evs的分泌具有调控作用，因此针对b细胞内rab家族相关因子进行实时荧光定量pcr检测，筛选影响囊泡分泌的因子。具体方法如下：

(1)取荷瘤小鼠和正常小鼠的脾脏组织，使用实施例2中的方法获取脾脏单细胞悬液；(2)采用mousebcellisolationkit(stemcell，货号19854)，按照说明书要求的方法，进行小鼠b细胞分选；(3)将分选获得细胞溶于500μltrizolreagent(takara，货号9109)，4℃过夜，隔日提取rna；(4)每管加入100μl三氯甲烷，涡旋震荡1分钟；(5)用力甩从而混匀试剂，1分钟；(6)室温静置10分钟，之后12000g，4℃离心15分钟；(7)吸取上层水相于新的ep管，加入等体积异丙醇，上下颠倒6次；(8)室温静置10分钟，之后12000g4℃离心10分钟；(9)弃净上清，加入1毫升75％无水乙醇，12000g，4℃离心10分钟；(10)弃净上清，风干10分钟，之后加入10μldepc水，测rna浓度；(11)用depc水将rna浓度调至100-200ng/μl；(12)利用cdnasynthesiskit(cwbio，货号cw2569m)反转录试剂盒对目的rna进行反转录，按照试剂盒要求的方法获得相对应的cdna；(13)以上述cdna为模板，以小鼠β-actin为内参，利用相应的引物，如β-actin、rab1b、rab2b、rab5b、rab5c、rab6a、rab7、rab11、rab27a、rab27b、rab35、smad3、tsg101进行实时荧光定量(qpcr)测定，相对应的qpcr引物如表1所示。

表1

(14)扩增体系为6.25μlsybr(vazyme2×chamqsybrqpcrmastermix，货号q311-02-aa)、0.5μl相对应的引物、5.75μlcdna；(15)计算出所需要的cdna含量并且按照此含量的两倍，对其进行一定的稀释；(16)将上述sybr和引物配成混合液，加入qpcr板(bio-rad)，而后逐个加入cdna，设置2个复孔；(17)封板，100g、1分钟甩板，上机；(18)对qpcr结果进行分析，得到的结果如图3所示，在两种小鼠之中，只有rab27a和rab27b的表达水平差异具有统计学意义，此结果说明，对影响囊泡分泌具有明显调控作用的是rab27a和rab27b。

实施例4

对荷瘤小鼠和正常小鼠b细胞中rab27a及rab27b蛋白表达水平进行比较，首先构建实施例1中的荷瘤小鼠，以正常c57小鼠作为对照组，制备实施例2中的小鼠脾脏细胞悬液，使用mousebcellisolationkit(stemcell，货号19854)分选两组小鼠的b细胞。使用分选得到的b细胞制备蛋白样本，利用weaternbloting的方法鉴别两组小鼠rab27a和rab27b的表达水平差异，具体步骤如下：

(1)构建实施例1中的荷瘤小鼠，使用实施例2中的方法制备单细胞悬液；(2)使用上述分选试剂盒中的方法，分别对两组小鼠进行b细胞分选；(3)使用celllysisbuffer(cellsignalingtechnology，货号#9803)和工作浓度1mmpmsf，配制成mix，35μl/管，充分吹散细胞，对细胞进行低温裂解30分钟；(4)12000g，低温离心10分钟；(5)弃掉沉淀，吸取上清液置于冰上；(6)使用5×sds使上清液蛋白变性，混匀，样本煮沸5min，上样进行westernbloting，电泳90v1小时20分钟；(7)低温转膜，pvdf膜覆盖相应的条带位置，330ma90分钟；(8)脱脂牛奶溶于pbst缓冲液配成5％封闭液室温封闭膜2小时；(9)按照抗体的稀释比例，使用5％bsa溶液作为溶剂，使用相应的抗体anti-rab27a(abclonal，货号a1934)、anti-rab27b(abclonal，货号a10389)进行4℃孵育，水平摇床过夜；(10)回收抗体，pbst缓冲液冲洗膜四次，每次10分钟；(11)同样使用5％bsa溶液作为溶剂，按照一定的比例以及对应的一抗种属稀释二抗，二抗室温反应，水平摇床1小时；(12)回收二抗，pbst缓冲液冲洗膜四次，每次10分钟；(13)曝光，使用曝光液(新赛美，货号p10300a、p10300b)，tanon4500成像仪进行曝光；(14)结果如图4，rab27a条带位置是25kd，rab27b条带位置是25kd。通过对结果进行分析，相比于正常小鼠，荷瘤小鼠的b细胞中rab27a表达水平明显升高。

实施例5

体外分别敲低raji细胞系的rab27a和rab27b，检测细胞对应的分泌囊泡水平。实验步骤如下：

(1)设计人rab27a和rab27bsirna，

hrab27asirnaf：5’-cggaucaguuaagugaagaaadtdt-3’，

hrab27asirnar：5’-uuucuucacuuaacugauccgdtdt-3’；

hrab27bsirnaf：5’-gacgccaugggcuucuuauuadtdt-3’，

hrab27bsirnar：5’-uaauaagaagcccauggcgucdtdt-3’；

ncsirnaf：5’-uucuccgaacgugucacgudtdt-3’，

ncsirnar：5’-acgugacacguucggagaadtdt-3’。

上述sirna序列中，3’端的dtdt表示两个dna序列中出现的碱基t来替代两个rna序列中出现的u，不影响抑制效果，减少成本，还能增强抗酶降解能力(序列表中，由于软件问题，省略3’端的dtdt)。

(2)体外培养raji细胞系，12孔板铺板2×10⁶个/孔，使用干扰试剂transit-tkotransfectionreagent(mirus，货号mir2150)，按照试剂说明书标准操作步骤进行操作；(3)设置阴性对照组加入ncsirna，操作同上；(4)逐滴加入对应的细胞培养孔，轻摇混匀；(5)37℃细胞培养箱，培养24小时；(6)收取细胞，使用实施例4中的方法，进行westernbloting检测相应蛋白表达情况，以评估干扰效果；(7)收集细胞培养上清，将培养上清一分为二，一部分按照300g，10分钟、2000g，20分钟、10000g，30分钟的梯度转速离心，之后取上清液，100000g，1小时在4℃下离心；(8)弃上清，300μl/管重悬，使用bcaproteinassaykit(thermofisher，货号23225)对获得的evs浓度进行测定；(9)另一部分细胞培养上清，使用4μmaldehyde/sulfatelatexbeads(invitrogen，货号1736853)，工作浓度为40nm,anti-cd63(santacruz，货号sc-5275)，浓度200μg/ml,取100μl乳胶微粒溶液和10μganti-cd63混匀，4℃放置1小时；(10)加fbs50μl封闭1小时；(11)pbs缓冲液冲洗一遍，3500g，5分钟离心；(12)pbs重悬分成n+1份，分别加入pbs和相应培养孔的细胞上清，封口，4摄氏度摇床过夜；(13)pbs洗一遍，同速离心后弃上清，100μl/管pbs重悬，peanti-humancd9(biolegend，货号312106)5μl/管，混匀，室温避光染色20分钟；(14)1ml/管pbs洗两次，300μl重悬流式上机。

结果显示，wb结果显示如图5a、6a所示，rab27a和rab27b的干扰效果良好，rab27a干扰之后，raji上清中的evs含量经过酶标仪检测之后，以od值计算其质量，可以观察到对照组的evs含量明显高于rab27a干扰组(图5b)，而rab27b干扰组的evs含量与对照组差异不大(图6b)；对evs进行流式分析，相比于对照组，rab27a干扰组evs含量明显减少(图5c、d)，rab27b干扰组含量无明显差异(图6c、d)。此结果说明，相比于rab27b，rab27a在evs的分泌中有明显重要的调控作用。

实施例6

检测在条件性敲除rab27a小鼠体内，b细胞内rab27a的敲低情况。

(1)利用cd19-cre小鼠与rab27a^fl/fl小鼠杂交，从而获得rab27a^{fl/fl*cd19-cre}小鼠；(2)确定小鼠的鉴定引物和pcr程序以及小鼠基因条带位置(参照thejacksonlaboratory)；(3)鼠尾基因鉴定小鼠基因型，取小鼠尾部提取的dna为模板、引物、2×taq酶和ddh2o，体系分别为2μl、1μl、6μl、3μl，进行pcr扩增；(4)pcr扩增产物进行dna凝胶电泳，对小鼠基因型鉴定；(5)分别取rab27a^{fl/fl*cd19-cre}小鼠和rab27a^fl/f小鼠，按照实施例4中的方法分选b细胞，一部分提取b细胞中的蛋白进行westernbloting电泳，检测蛋白水平rab27a表达差异；(6)另一部分使用实施例3中的提取b细胞rna，反转录得到cdna,进行qpcr检测转录水平上rab27a表达差异；(7)使用mousetcellisolationkit(stemcell，货号19851a)分选小鼠t细胞，同样的检测t细胞在蛋白水平和转录水平上rab27a表达差异；(8)结果如图7所示，在b细胞内条件敲除rab27a小鼠，无论是在转录水平(图7a)还是蛋白水平(图7b)，在rab27a条件敲除小鼠体内，b细胞表达rab27a明显下降，而t细胞内并无明显改变。证明条件敲除小鼠构建成功。

实施例7

使用rab27a^{fl/fl*cd19-cre}和rab27a^fl/f小鼠构建b16/f10荷瘤模型，给予以及不给予化疗，观察肿瘤大小以及生存率的变化的结果图。

(1)使用rab27a条件敲除小鼠，接种b16/f10细胞系，按照实施例1中的方法构建荷瘤小鼠模型，记录为第0天；(2)将两种小鼠分为化疗组和对照组，每组5只小鼠，化疗组化疗剂量为50mg/kg/injection，分别在第5天、第9天、第13天腹腔化疗一次；(3)分别测量肿瘤大小，记录小鼠的生存率；(4)结果如图8所示，相比于其他组，rab27a^{fl/fl*cd19-cre}+ctx组荷瘤小鼠的肿瘤体积明显偏小(图8a)，其生存率也得到提高(图8b)；rab27a^fl/f+ctx组的生存率位居第二，其肿瘤大小也很较小，说明化疗在肿瘤治疗中也有一定的作用，综上，在化疗状态下，b细胞内rab27a敲低可以减缓肿瘤进程，提高荷瘤小鼠的生存率。

实施例8

b-nsg小鼠是一种严重免疫缺陷小鼠，在这种小鼠体内回输cd34⁺人造血干细胞,构建人的免疫系统，能够更加真实的反应疾病状态下人体免疫功能变化。通过对重构小鼠脾脏内免疫细胞进行流式细胞分析，观察各种免疫细胞的比例，从而验证小鼠的重构效果。具体操作步骤：

(1)取产妇脐带血，与无菌生理盐水1:1混匀，使用human1×lymphocyteseparationmedium(dakewe，货号dkw-klsh-0100)对人血液中的pbmc进行分离；(2)取洁净的15毫升管，加入3毫升人淋巴细胞分离液，而后缓慢沿管壁加入6毫升人血和生理盐水混合液，800g，25分钟室温离心；(3)观察液体分层，缓慢吸取白膜层，即为人单个核细胞层；(4)1500rpm，5分钟离心，分选液重悬计数；(5)使用stemcellhumancd34positiveselectionkit，按照试剂盒内标准步骤，从上述重悬细胞液中分选人cd34阳性干细胞；(6)使用rs2000pro(radsource)对b-nsg小鼠进行辐照，剂量1.5gy；(7)尾静脉回输b-nsg小鼠，每只小鼠回输约10⁵个细胞构建人源化小鼠；(8)2个月之后，取小鼠脾脏，制备实施例1中的细胞悬液；(9)使用apcanti-humancd45(biolegend，货号304011)peanti-humancd19(biolegend，货号302207)alexafluor594anti-humancd8a(biolegend，货号301056)fitcanti-humancd4(ebioscience，货号11-0084-42)进行实施例2中的染色过程，进行流式细胞学检测。

结果如图9所示，流式结果分析显示，脾脏中的cd45阳性的免疫细胞约占24％(图9a)，人cd19阳性的b细胞所占的比例最高约为94％(图9d)，cd4阳性的t细胞约占4％(图9b)，cd8阳性的t细胞约占1.4％(图9c)，表明b-nsg小鼠重构成功。

实施例9

ebv病毒能够高效特异性的感染人b淋巴细胞(pattengale,p.k.,smith,r.w.,andgerber,p.selectivetransformationofblymphocytesbye.b.virus.lancet.)，体外培养人b淋巴瘤细胞b958，收集细胞培养上清，提取b958细胞分泌的ebv，然后室温紫外照射1小时使其灭活。

将灭活ebv与不同浓度的fam-labeledrab27asirna在37℃共同孵育2h，之后ebv吸附乳胶微粒，进行流式，观察fam-labeledrab27asirna是否可进入ebv，具体操作步骤如下：

(1)取灭活的ebv分别与30、20、10μm的fam-labeledrab27asirna于37℃避光孵育2小时和4小时；(2)使用pbs缓冲液洗两遍，100μlpbs重悬；(3)使用稀释过100倍的乳胶微粒，取100μl与上述iebvs/rab27asirna混匀，室温静置20分钟；(4)而后加入50μlfbs，室温封闭1小时；(5)3500g，5分钟，使用pbs洗一遍；(6)200μl重悬上机。

结果分析，图10a显示孵育时间为2小时和4小时，不同作用时间其作用效率相差不大。图10b显示在与不同浓度fam-labeledrab27asirna作用时，相比于对照组，其荧光强度都有一定的增强，表明rab27asirna进入ebv之中，但是30μm时作用效果最好。

实施例10

由于ebv具有特异性的感染b细胞的能力，b淋巴细胞瘤细胞系b958可以分泌ebv，因此体外培养b958细胞系，收集细胞培养上清，采用梯度离心最终超速离心的方法，从而获得ebv，使用bca检测液对其进行半定量，估计获得的ebv含量。对获得的ebv进行紫外照射室温1小时，从而使ebv灭活，使用实施例5中的rab27asirna和灭活ebv于37℃共孵育2h后，于体外感染人b淋巴细胞瘤细胞raji，检测rab27a表达水平变化，具体实验步骤如下：

(1)使用带有fam荧光的sirna，取灭活ebv与rab27asirna100μg，37℃孵育2小时，对照组使用22μgrab27asirna；(2)raji细胞铺板2×10⁶个/孔；(3)将孵育产物加到对应的raji细胞孔板中；(4)培养48h之后收取细胞，使用实施例4中westernbloting的方法，检测rab27a表达情况，结果如图11c；(5)在荧光显微镜下观察细胞荧光，结果如图11a和11b。

将ebv荷载rab27asirna后感染raji细胞系，在荧光显微镜下可以观察到ebv定位于raji细胞内(图11a)，证明其可以感染raji细胞；蛋白水平检测可以发现iebv/rab27asirna作用之后，raji细胞内rab27a蛋白表达水平明显下降，证明iebv的作用很明确，ebv携带的rab27asirna可降低rab27a的表达。

实施例11

rab27asirna与灭活ebv体外共孵育后体外感染人b淋巴瘤细胞raji，raji细胞分泌evs变化。具体步骤如下：

(1)使用实施例10中的方法将rab27asirna与灭活ebv体外共孵育后体外感染人b淋巴瘤细胞raji，24小时后收取上清用0.22um的滤器过滤，使用实施例5中的方法检测raji细胞分泌的evs变化。

(2)结果如图12，相比于对照组，iebv/rab27asirna作用于raji之后，cd63⁺evs分泌明显减少，证明rab27a对于evs的分泌具有明显的调控作用。

实施例12

rab27asirna与灭活ebv体外共孵育后感染人外周血单核细胞中的b细胞之后，rab27a蛋白表达水平结果图。

(1)使用实施例8中的方法，从人外周血中分离人外周血单核细胞(pbmcs)；(2)使用humancd19positiveselectionkit(stemcell，货号17854)，按照试剂盒标准方法，从人外周血单核细胞中分选cd19阳性的b细胞，将得到的b细胞按照实施例10中的方法进行铺板；(3)使用实施例10中的方法，将rab27asirna与灭活ebv体外共孵育后感染人b细胞，对b细胞的rab27a表达水平进行检测。(4)结果如图13，iebv/rab27asirna感染人外周血pbmcs中的b细胞之后，b细胞表达的rab27a明显降低。

实施例13

在人源化的b-nsg小鼠构建结肠癌模型，回输ebv荷载的rab27asirna，给予化疗治疗，观察小鼠肿瘤大小及生存率变化，验证iebvs/rab27asirna是否影响化疗过程中的抗肿瘤效果。

(1)使用实施例8中的方法构建人源化b-nsg小鼠，小鼠体内重构至少2个月；(2)以未重构b-nsg小鼠、重构b-nsg小鼠为对象，同时设置分组为未重构b-nsg荷瘤小鼠、重构b-nsg荷瘤小鼠、重构b-nsg荷瘤小鼠+ctx、重构b-nsg荷瘤小鼠+ctx+iebvs每组4只，皮下荷瘤人结肠癌细胞lovo，构建荷瘤小鼠模型；(3)使用实施例9中的方法制备灭活ebv；(4)按照上述分组对小鼠进行相应的处理；(5)观察小鼠的肿瘤大小和生存率；(6)使用重构小鼠皮下荷瘤人结肠癌细胞lovo构建荷瘤小鼠，具体构建步骤同上，按照图14的方法对小鼠进行相应的处理，治疗时将小鼠分为4组，即iebvs/rab27asirna、iebvs/ncsirna、iebvs/rab27asirna+ctx、iebvs/ncsirna+ctx，分别对荷瘤小鼠做相应的治疗处理，观察小鼠的肿瘤大小和生存率；(7)结果如图，相比于未重构小鼠，重构人源化小鼠有一定的抗肿瘤效应，表明重构小鼠体内的免疫系统有对抗肿瘤的作用(图15、16)；图14是重构小鼠的治疗方式，iebvs/rab27asirna、iebvs/ncsirna在小鼠未化疗情况下均不影响肿瘤进程(图17)，但iebvs/rab27asirna+ctx组小鼠相比于iebvs/ncsirna+ctx组具有明显的抗肿瘤效果(图17)，且小鼠的生存率得到提高(图18)。因此，在化疗状态下，靶向作用于b细胞敲除rab27a可以提高小鼠的抗肿瘤作用，提高小鼠的生存率。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种抗肿瘤药物的作用靶点及抗肿瘤药物

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