组织工程半月板复合支架及其制备方法与流程

本申请属于医疗器械
技术领域：
，尤其涉及一种组织工程半月板复合支架及其制备方法。
背景技术：
：半月板位于股骨髁与胫骨平台之间，内外各一，其主要功能在于营养膝关节、润滑膝关节、稳定膝关节及缓冲膝关节应力等。半月板的损伤及退变会引起半月板功能的丧失，降低对膝关节软骨保护作用，从而诱发膝关节疾病。临床上可以通过将半月板部分或全部切除手术来解决半月板损伤及退变问题，在短期内可以缓解膝关节病症。但是如果半月板损伤及退变发生在无血管区的内侧部分，其切除后往往难以自行愈合，不可避免地引起远期退行性关节变化，导致膝骨关节炎。组织工程以及再生医学的发展为半月板损伤修复提供了新的治疗模式，其中组织工程支架作为种子细胞和生物信号分子等活性物质的载体，对新生组织的再生有着至关重要的作用。目前的组织工程支架难以同时兼顾优良的力学性能和生物相容性，形成的新生半月板的形态、结构、力学性能及生理功能仍然存在较多的不足，甚至会造成膝关节微环境的改变，加速退行性关节变化或加重膝骨关节炎。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种组织工程半月板复合支架及其制备方法，使半月板复合支架同时兼顾优异的力学性能和生物相容性，并能够提供优良的细胞生长所需微环境，从而使新生半月板具有优良的形态、结构、力学性能及生理功能。本发明第一方面提供一种组织工程半月板复合支架，其包括：支架，支架呈c形、且与待再生修复半月板的初始形状一致，支架包括多个沿支架的环向延伸的第一可降解高分子材料纤维和多个沿支架的径向延伸的第二可降解高分子材料纤维，第一可降解高分子材料纤维与第二可降解高分子材料纤维多层交叉排列以形成具有多个第一孔的框架结构体，第一孔的孔径为750μm～1500μm；基质材料，复合于支架的多个第一孔内部以形成具有多个第二孔的半月板复合支架，第二孔的孔径为90μm～150μm。本发明第二方面提供一种组织工程半月板复合支架的制备方法，方法包括以下步骤：建模步骤，构建待再生修复的半月板在未损伤时的三维数据模型；打印步骤，以可降解高分子材料为原料，依据三维数据模型，打印得到支架，其中支架呈c形、且与待再生修复半月板的初始形状一致，支架包括多个沿支架的环向延伸的第一可降解高分子材料纤维和多个沿支架的径向延伸的第二可降解高分子材料纤维，第一可降解高分子材料纤维与第二可降解高分子材料纤维多层交叉排列以形成具有多个第一孔的框架结构体，第一孔的孔径为750μm～1500μm；亲水性处理步骤，对支架进行亲水性处理；冻干半月板复合支架制备步骤，将含有基质材料的溶液填充于支架的多个第一孔内部，并经冷冻干燥处理，获得冻干半月板复合支架；后处理步骤，将冻干半月板复合支架进行交联处理和灭菌处理，获得半月板复合支架，半月板复合支架具有多个第二孔，第二孔的孔径为90μm～150μm。相对于现有技术，本发明至少具有以下有益效果：本发明提供的组织工程半月板复合支架，其构型与个体精准匹配，并同时兼顾优异的力学性能和生物相容性，还能够提供优良的细胞生长所需微环境，在体内和体外条件均可有利于细胞的生长、增殖及再分化，从而可以很好地促进无血管区内侧部分的缺损半月板的再生修复，使新生半月板具有优良的形态、结构、力学性能及生理功能，保护膝关节。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据附图获得其他的附图。图1a-图1b为本发明一个实施例的组织工程半月板复合支架示意图。图2为本发明一个实施例的组织工程半月板复合支架的横截面扫描电镜图。图3为本发明一个实施例的组织工程半月板复合支架的支架示意图。图4为本发明一个实施例的支架的第一可降解高分子材料纤维与第二可降解高分子材料纤维交叉排列示意图。图5a-图5d为本发明一个实施例的绵羊内侧半月板多角度医学图像。图6为本发明实施例4的组织工程半月板复合支架植入绵羊膝关节内侧半月板缺损位置后的新生半月板组织。具体实施方式为了使本申请的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合具体实施例对本申请进行详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本申请，并非为了限定本申请。为了简便，本文仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。在本文的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包含本数，“一种或多种”中“多种”的含义是两个以上。本申请的上述
发明内容并不意欲描述本申请中的每个公开的实施方式或每种实现方式。如下描述更具体地举例说明示例性实施方式。在整篇申请中的多处，通过一系列实施例提供了指导，这些实施例可以以各种组合形式使用。在各个实例中，列举仅作为代表性组，不应解释为穷举。首先说明本发明实施例第一方面提供的组织工程半月板复合支架。图1a至图1b是示出了本发明一个实施例的组织工程半月板复合支架100的示意图，图2是示出了本发明一个实施例的组织工程半月板复合支架100的横截面扫描电镜图。请一并参照图1a、图1b和图2，本发明一个实施例的半月板复合支架100包括支架110和复合在支架110内的基质材料120。其中，支架110采用具有生物相容性且可降解的高分子材料，使其随着新生半月板的生成过程可自然降解。请一并参照图3，图3是示意性地示出了本发明一个实施例的组织工程半月板复合支架的支架结构，支架110呈c形，其形状与待再生修复半月板的初始形状一致。在本实施例中，待再生修复半月板的初始形状指的是待再生修复半月板在未损伤时的形状。可以理解的是，前述一致可以指的是相同，也可以是允许存在医学上可接受的偏差。请一并参照图4，图4是示意性地示出了本发明一个实施例的支架中第一可降解高分子材料纤维与第二可降解高分子材料纤维交叉排列结构。支架110包括多个第一可降解高分子材料纤维111和多个第二可降解高分子材料纤维112。其中，第一可降解高分子材料纤维111呈弧形、并沿支架110的环向延伸，多个第一可降解高分子材料纤维111平行排列且相间隔；第二可降解高分子材料纤维112可以是呈直线形、并沿支架的径向延伸，多个第二可降解高分子材料纤维112呈放射状排列且相间隔；第一可降解高分子材料纤维111与第二可降解高分子材料纤维112相交叉排列。多层交叉排列的第一可降解高分子材料纤维111与第二可降解高分子材料纤维112形成具有多个第一孔的框架结构体。由可降解高分子材料纤维按照预定的排布方式排列形成的支架110，使得半月板复合支架100具有较好的拉伸弹性模量和压缩弹性模量，满足力学性能需求。特别地，该种支架110仿生待再生修复的半月板的胶原纤维排列结构特点，有利于保证新生半月板具有优良的形态、结构、力学性能及生理功能。在其他的一些实施例中，还可以是支架110的表面部分具有多个第三可降解高分子材料纤维呈交叉放射状排列且相间隔，有利于使半月板复合支架100的表面形态与原生半月板的表面形态更加一致。支架110的内侧部分包括多个第一可降解高分子材料纤维111和多个第二可降解高分子材料纤维112，其中，第一可降解高分子材料纤维111呈弧形、并沿支架110的环向延伸，多个第一可降解高分子材料纤维111平行排列且相间隔；第二可降解高分子材料纤维112可以是呈直线形、并沿支架的径向延伸，多个第二可降解高分子材料纤维112呈放射状排列且相间隔；多个第一可降解高分子材料纤维111与多个第二可降解高分子材料纤维112多层交叉排列。在该些实施例中，支架110具有多个第一孔。进一步地，支架110的第一孔的孔径优选为750μm～1500μm。基质材料120复合于支架110的多个第一孔内部。本发明实施例的半月板复合支架100具有多个第二孔，第二孔的孔径优选为90μm～150μm。本发明实施例的组织工程半月板复合支架100，其构型与个体精准匹配，并同时兼顾优异的力学性能和生物相容性，将其植入半月板缺损部位，能够使损伤的半月板保持正常的关节活度和强度。将半月板细胞、软骨细胞及间充质干细胞等接种至半月板复合支架100的多个第二孔内，由于本发明的组织工程半月板复合支架100能够提供优良的细胞生长所需微环境，在体内和体外条件均可有利于细胞的生长、增殖及再分化，从而可以很好地促进无血管区内侧部分的缺损半月板的再生修复，使新生半月板具有优良的形态、结构、力学性能及生理功能，保护膝关节。第一可降解高分子材料纤维111的直径优选为100μm～300μm。第二可降解高分子材料纤维112的直径优选为100μm～300μm。第三可降解高分子材料纤维的直径优选为100μm～300μm。作为优选地，支架110的孔隙率为85％～99％。作为优选地，半月板复合支架100的孔隙率为80％～95％。作为优选地，半月板复合支架100的拉伸弹性模量为10mpa～100mpa、压缩弹性模量为10mpa～60mpa。可降解高分子材料可以是任意符合生物相容性及力学性能要求的高分子材料，例如为聚己内酯pcl、聚氨酯pu、聚乳酸pla、聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga、聚乳酸-聚己内酯共聚物pcla、聚氨基酸paa及聚乙醇酸pga中的一种或多种。作为优选地，可降解高分子材料的平均分子量为10000～1000000。基质材料120可以是有利于种子细胞及生物信号分子等活性物质的附着，且有利于细胞生长、增殖及再分化的材料，优选为天然材料，例如脱细胞半月板细胞外基质、脱细胞软骨细胞外基质、脱细胞脐带华通胶(wharton’sjelly)细胞外基质、i型胶原、ii型胶原、细菌纤维素、蚕丝蛋白及糖胺多糖中的一种或多种。将半月板细胞、软骨细胞及间充质干细胞接种至半月板复合支架100上培养50h～350h，如72h～336h，如150h～300h，即可用于半月板部分缺损及半月板全缺损的修复。接下来说明本发明实施例第二方面提供的一种组织工程半月板复合支架的制备方法，通过该方法能够实现本发明实施例第一方面的组织工程半月板复合支架。本发明一个实施例的组织工程半月板复合支架的制备方法包括以下步骤：建模步骤s100，构建待再生修复半月板未损伤时的三维数据模型。作为一个示例，步骤s100包括：步骤s110，通过微计算机断层扫描技术(microcomputedtomography，简称micro-ct)或磁共振成像技术(magneticresonanceimaging，简称mri)获取与待再生修复的半月板相对应的完好半月板的医学影像数据。其中待再生修复的半月板相对应的完好半月板可以是患者完好膝关节中的与待再生修复的半月板相对应的半月板。根据个体精准的半月板医学影像数据，能够制备出与个体精准匹配的半月板复合支架。例如，请参照图5a至图5d，其为通过micro-ct成像技术获取绵羊内侧半月板的医学影像数据，并构建出的绵羊内侧半月板的三维数据模型。步骤s120，通过图形处理软件，利用与待再生修复的半月板相对应的完好半月板的医学影像数据，构建出该完好半月板的三维数据模型，再将该完好半月板的三维数据模型经镜像操作，得到待再生修复半月板未损伤时的三维数据模型。步骤s130，对待再生修复半月板未损伤时的三维数据模型进行分层切片处理，获取待再生修复半月板未损伤时的二维数据图像信息。在步骤s130之前，还可以对待再生修复半月板未损伤时的三维数据模型进行局部结构修正和形态优化。打印步骤s200，以可降解高分子材料为原料，依据基于待再生修复半月板未损伤时的三维数据模型处理得到的二维数据图像信息，打印得到支架。可降解高分子材料可以是如前文所述的可降解高分子材料。作为优选地，在步骤s200，打印头的直径为100μm～300μm，挤出速度为0.01mm/s～0.03mm/s，打印速度为5mm/s～10mm/s，层厚为0.03mm～0.10mm。亲水性处理步骤s300，对支架进行亲水性处理。在步骤s300，可以采用碱性刻蚀处理法或等离子体处理法对支架进行亲水性处理。作为采用碱性刻蚀处理法对支架进行亲水性处理的一个示例，步骤s300包括：步骤s310，将支架通过无菌三蒸水洗涤数次，例如2次、3次、4次。步骤s320，将支架置入碱溶液中浸泡处理，以改善其表面亲水性。上述碱溶液可以是含有碱性化合物的水溶液，其碱性化合物例如是氢氧化钠、氢氧化钾等。例如，上述碱溶液为浓度为2mol/l～6mol/l的氢氧化钠水溶液，如浓度为3mol/l～5mol/l的氢氧化钠水溶液。上述浸泡处理的时间可以是30min～3h，如1h～2h。步骤s330，将支架通过无菌三蒸水洗涤至中性。作为采用等离子体处理法对支架进行亲水性处理的一个示例，可以是采用氧气等离子体处理支架，使支架材料表面形成有亲水性基团羟基等，改善支架表面的亲水性。当然，还可以是采用二氧化碳等离子体处理支架，或者采用氧气和二氧化碳的复合气体对支架进行等离子体处理，使支架材料表面形成亲水性基团羟基、羰基及羧基等，均能实现改善支架表面的亲水性。冻干半月板复合支架制备步骤s400，将含有基质材料的溶液填充于支架的多个第一孔内部，并经冷冻干燥处理，获得冻干半月板复合支架。上述含有基质材料的溶液中，基质材料可以是如前文所述的基质材料，溶剂可以为水、乙醇等。作为优选地，含有基质材料的溶液中基质材料的质量与溶液的体积之比为1％～5％。在步骤s400，可以采用本领域已知的方法将含有基质材料的溶液填充于支架的第一孔内部，例如通过注射器将含有基质材料的溶液注入支架的第一孔内部，再例如将支架浸入含有基质材料的溶液中，使含有基质材料的溶液充分渗入支架的第一孔内部。在步骤s400，可以采用本领域已知的方法对填充有基质材料溶液的支架进行冷冻干燥处理，例如使用真空冷冻干燥机，在-10℃～-60℃进行冷冻干燥12h～48h，如20h～36h，再如24h～30h。通过冷冻干燥处理，将溶剂去除，保证基质材料在支架内部分布的均匀性，并且不会造成支架及基质材料的物性发生改变，有利于使半月板复合支架形成优良的微环境。后处理步骤s500，将冻干半月板复合支架进行交联处理和灭菌处理，获得半月板复合支架。在步骤s500，可以采用本领域已知的方法对冻干半月板复合支架进行交联处理和灭菌处理。作为一个示例，步骤s500包括：步骤s510，在采用化学方法、辐照方法及干热方法中的一种或多种对冻干半月板复合支架进行交联处理，获得初始半月板复合支架。通过交联处理，能够提高半月板复合支架的力学性能。其中基质材料交联处理还能够改善基质材料的降解速率，防止其收缩变形，保证半月板复合支架的外观形态及其内部的特定微结构，从而有利于细胞的生长、增殖及再分化。可以采用化学方法对冻干半月板复合支架进行交联处理。例如将冻干半月板复合支架加入含有交联剂的溶液中进行交联处理，交联剂可以是碳二亚胺(edac)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、京尼平(genipin)及戊二醛(gda)中的一种或多种，溶剂可以是水及乙醇中的一种或多种。还可以采用辐照方法对冻干半月板复合支架进行交联处理。例如在电子束辐照、紫外光辐照或γ射线辐照下对冻干半月板复合支架进行交联处理，可以不使用交联剂，提高半月板复合支架的生物相容性。当然，在其他的实施例中，也可以同时使用交联剂。还可以采用干热方法对冻干半月板复合支架进行交联处理。步骤s520，采用辐照灭菌及环氧乙烷灭菌中的一种或两种对初始半月板复合支架进行灭菌处理，获得半月板复合支架。作为示例，可以采用钴60辐照对初始半月板复合支架进行辐照灭菌处理。也可以是将初始半月板支架置入环氧乙烷中进行灭菌处理。采用本发明实施例的组织工程半月板复合支架的制备方法，能够得到本发明实施例的组织工程半月板复合支架，其构型与个体精准匹配，并同时兼顾优异的力学性能和生物相容性，将其植入半月板缺损部位，能够使损伤的半月板保持正常的关节活度和强度。并且能够提供优良的细胞生长所需微环境，在体内和体外条件均可有利于细胞的生长、增殖及再分化，从而可以很好地促进无血管区内侧部分的缺损半月板的再生修复，使新生半月板具有优良的形态、结构、力学性能及生理功能。实施例下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。实施例1通过micro-ct成像技术，获取绵阳内侧半月板的医学影像数据，并进行三维重建处理，获得绵羊内侧半月板的三维数据模型；通过物理脱细胞的方法制备脱细胞半月板细胞外基质，并制备含有脱细胞半月板细胞外基质的水溶液，其中脱细胞半月板细胞外基质的质量与水溶液的体积比为2％；以聚己内酯为原料，依据三维数据模型，打印得到支架，其中呈c形、且与待再生修复半月板的初始形状一致，支架包括多个沿支架的环向延伸的第一可降解高分子材料纤维和多个沿支架的径向延伸的第二可降解高分子材料纤维，多层交叉排列的第一可降解高分子材料纤维与第二可降解高分子材料纤维形成具有多个第一孔的框架结构体，第一孔的孔径为750μm～1500μm；对支架进行氧气等离子体处理，改善支架的亲水性；将含有脱细胞半月板细胞外基质的水溶液填充到经亲水性处理的支架的多个第一孔内部，经冷冻干燥处理，并经化学方法交联处理、环氧乙烷灭菌处理，获得组织工程半月板复合支架，半月板复合支架具有多个第二孔，第二孔的孔径为90μm～150μm。实施例2与实施例1不同的是，可降解高分子材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，基质材料为i型胶原，采用辐照方法交联处理。实施例3与实施例1不同的是，可降解高分子材料为聚氨酯，基质材料为细菌纤维素，采用辐照方法交联处理，采用钴60辐照灭菌处理。实施例4与实施例1不同的是，采用碱性刻蚀处理法对支架进行亲水性处理，包括：将支架通过无菌三蒸水洗涤3次；将支架在5mol/l的氢氧化钠溶液中浸泡2h；用无菌三蒸水将支架洗涤至ph为中性。实施例5与实施例1不同的是，基质材料为蚕丝蛋白，采用辐照方法交联处理，采用钴60辐照灭菌处理。测试部分(1)拉伸试验：将制备得到的组织工程半月板复合支架裁取宽10mm、长20mm、厚度5mm的长方形试样，用生理盐水浸泡3h，之后用力学试验机夹具夹持固定，以5mm/min的拉伸速率对样品进行拉伸直至样品断裂，得到拉伸应力和拉伸应变曲线，根据应力-应变曲线计算拉伸弹性模量。实施例1～5的测试结果示于下面的表1。表1实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5拉伸弹性模量/mpa32.331.631.132.030.5(2)压缩试验：将制备得到的组织工程半月板复合支架裁取宽5mm、长度5mm、厚度5mm的长方形试样，用生理盐水浸泡3h，之后置于力学试验机的两压盘之间，以5mm/min的压缩速率对样品进行压缩至30％应变，得到压缩应力和压缩应变曲线，根据应力-应变曲线计算压缩弹性模量。实施例1～5的测试结果示于下面的表2。表2实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5压缩弹性模量/mpa18.918.519.018.817.8(3)绵羊内侧半月板缺损修复试验：将绵羊麻醉后打开膝关节，切除内侧半月板，将制备得到的组织工程半月板复合支架缝合于缺损半月板原位，而后依次缝合肌肉、筋膜、皮肤，关上膝关节。术后3个月再次打开膝关节，进行检查。采用实施例1至实施例5的半月板复合支架的绵羊植入处无感染、无溃烂情况发生，可见本发明实施例的半月板复合支架具有良好的生物相容性。实施例1至实施例5的半月板复合支架部分降解，仍有残余；已降解的半月板复合支架处已形成新生半月板组织，取样分析证明，新生半月板组织与原生完好的半月板形态一致，并具有平行和交叉排列的新生胶原纤维；经检测，新生半月板组织能够充分发挥半月板的生理功能，对膝关节软骨起到了有效的保护作用。其中实施例4的半月板复合支架，其形态、结构、力学性能及生理功能与原生半月板的一致性程度更高，效果更好。可见，本发明实施例1至实施例5提供的组织工程半月板复合支架，具有多孔结构、且力学强度适用于半月板移植，尤其是能够很好地促进无血管区内侧部分的缺损半月板的再生修复，保护膝关节。以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以权利要求的保护范围为准。当前第1页12