具有抗炎症及抗菌效果的A.C.C.提取物及包含其作为有效成分的组合物的制作方法

本发明涉及具有抗炎症及抗菌效果的提取物和抗菌及抗炎症组合物。

背景技术：

体内引起的炎症反应是受到伤疤或细菌感染之类的物理、化学刺激时恢复受损部位的重要的身体防御机制之一，受到刺激时，血管活性物质局部游离，由此血管透过性增加，诱发炎症。并且，炎症反应是根据外部刺激在生物体内形成的恢复体系，临床上伴随着发作、发热、肿胀、疼痛等而出现。炎症反应相关的细胞有巨噬细胞、单球细胞、淋巴球、肥大细胞、纤维芽细胞、血小板等，巨噬细胞(machrophage)被称作引起炎症反应的主要细胞，这些在受到刺激的情况或者被免疫细胞分泌的细胞因子(cytokine)而激活，生成一氧化氮(nitricoxide)(no)和cytokine，对生物防御起到重要作用。并且，炎症反应时，生成及释放组织胺、血清素、花生四烯酸(arachidonicacid)代谢组、活性氧、细胞因子等之类的炎症介质因子。

反复的炎症反应在炎症细胞中引起活性氧簇和活性氮簇的过多生成，引起永久的转基因，由此还可导致不可逆的病变。即，虽然炎症反应是在生物体内引起的防御机制，但持续引起炎症反应时，促进粘膜损伤，最终引起浮肿、疼痛、发作、发热等，可导致心血管疾病、类风湿关节炎、支气管炎及癌症之类的与慢性炎症相关的疾病。

大体上说，一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，nos)中的inos与炎症反应相关，因γ-干扰素(interferon-γ)、炎症性细胞因子及lps的刺激而表达。众所周知，体内的no在抗菌和肿瘤切除中担当重要功能，但由inos形成的no引起血管透过性的增加、浮肿等反应，促进炎症介质物质的合成，使炎症加重。

众所周知，脂多糖(lipopolysaccharide，lps)为革兰阴性菌的细胞外膜中的内毒素，这刺激巨噬细胞或单球细胞，刺激肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，il-1β)及白细胞介素-6(il-6)等炎症介质性细胞因子(cytokine)的分泌，来催化炎症反应。tnf-α为在体内中巨噬细胞、淋巴球及白细胞等生成的细胞因子(cytokine)，在正常状态下未生成，若巨噬细胞受到刺激，则被合成而分泌。il-6为代表性的促炎性细胞因子(pro-inflammatorycytokine)的一种，从包含单球细胞的多种细胞中分泌，在初期免疫反应中起到重要作用。众所周知，il-1β与il-6及tnf-α一起表示代表性的炎症性cytokine之一，是生成no的介质物质，并且是引起局部炎症，并实现t细胞激活和b细胞的成熟及nkcell激活的cytokine。据报道，这种炎症介质性物质的合成与通过环氧化酶(cyclooxygenase，cox)，将花生四烯酸(arachidonicacid)转换为白三烯(leukotriene)、前列腺素(prostaglandin)、血栓素(thromboxane)等的过程及nitricoxide(no)的生成相关，最终对宿主带来致命性结果。尤其是，no为反应性高的物质，并且是对细菌、病毒、菌及寄生虫之类的病原菌执行先天免疫反应所需的作用的物质，其通过nosynthase(nos)，由l-精氨酸(l-arginine)制作而成，nos分为原生型(constitutivenos，cnos)和诱生型(induciblenos，inos)。其中，已知，inos当受到外部刺激或pro-inflammatorycytokine等的刺激时，生产大量的no，引起血管透过性及浮肿等，诱发炎症反应，严重的情况下，还蔓延到类风湿关节炎及自身免疫性疾病之类的免疫性疾病。与此相关地，需要一起开发具有抗菌及抗炎症活性的天然物提取物和有效的抗炎症治疗剂。

技术实现要素：

本发明提供利用天然物中药材，具有抗菌及抗炎效果的提取物，尤其是，其目的在于，确认对包含黄柏的总14种的中药材进行蒸馏提取而获得的a.c.c.提取物的抗炎症活性，并确认临床效果。

本发明的另一目的在于，确认a.c.c.提取物为一起具有抗炎症效果与强效抗菌效果的有效成分。

并且，其目的在于，确认a.c.c.提取物在临床上也是通过抗炎症及抗菌作用而缓解尿布疹及痱子等的症状的物质，由此确认a.c.c.提取物可用作对炎症性疾病有效的治疗剂。

本发明为了解决上述问题，提供由黄柏(phellodendronbark)、黄芩(scutellariabaicalensis)、芍药(paeonialactiflorapall)、白鲜(dictamnusdasycarpusturcz)、知母(anemarrhenaasphodeloides)、白矾(alumen)、龙脑香(dryobalanopsaromaticagaermer)、日本薄荷(menthaarvensisvar.piperascens)、土木香(inulahelenium)、朝鲜野丁香(syringavelutinavar.kamibayashii)、刻叶紫堇(corydalisincisa)、鳢肠(ecliptaprostrata)、忍冬(lonicerajaponica)及甘草(glycyrrhizauralensis)中药材配合而成的a.c.c.提取物。

尤其是，其特征在于，用于制备上述提取物的中药材的配方分别为黄柏(phellodendronbark)16～24重量百分比、黄芩(scutellariabaicalensis)1～7重量百分比、芍药(paeonialactiflorapall)5～11重量百分比、白鲜(dictamnusdasycarpusturcz)5～11重量百分比、知母(anemarrhenaasphodeloides)1～7重量百分比、白矾(alumen)4～12重量百分比、龙脑香(dryobalanopsaromaticagaertner)1～7重量百分比、日本薄荷(menthaarvensisvar.piperascens)1～7重量百分比、土木香(inulahelenium)1～7重量百分比、朝鲜野丁香(syringavelutinavar.kamibayashii)1～7重量百分比、刻叶紫堇(corydalisincisa)1～7重量百分比、鳢肠(ecliptaprostrata)1～7重量百分比、忍冬(lonicerajaponica)1～7重量百分比、甘草(glycyrrhizauralensis)1～7重量百分比。

上述提取物，其特征在于，对包含phellodendronbark(黄柏)的总14种的中药材进行蒸馏提取而获得的样品(a.c.c.提取物)具有抗菌及抗炎症活性。在相关实验中，确认被脂多糖(lipopolysaccharide，lps)刺激的raw264.7细胞中释放细胞的nitricoxide(no)生成量和炎症性细胞肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，il-1β)及白细胞介素-6(il-6)生成量的变化。其结果，a.c.c提取物无细胞毒性地强效抑制被lps增加的no与炎症性细胞因子的生成。

并且，其特征在于，本发明的a.c.c.提取物对绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa，methicillin-resistantstaphylococcusaureus)、白念珠菌(candidaalbicans)及变异链球(streptococcusmutans)菌具有抗菌作用。a.c.c.提取物在上述细菌中呈现99.9％的强效细菌减少率，这意味着a.c.c.提取物为一起具有抗炎症效果与抗菌效果的有效成分。

在相关实验中，利用绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa，methicillin-resistantstaphylococcusaureus)、白念珠菌(candidaalbicans)及变异链球(streptococcusmutans)菌株，确认抗菌活性，将其临床适用，给患有尿布疹、瘙痒症、痱子症状的婴·幼儿涂布a.c.c.提取物时，呈现出疹、过敏性皮肤、溃烂、瘙痒症、痱子等症状改善效果，可用肉眼确认婴·幼儿皮肤的痱子经过2周后缓解得相当不错。由此可确认a.c.c.提取物在临床上也是通过抗炎症及抗菌作用而缓解尿布疹及痱子等症状的物质，a.c.c.提取物可成为对炎症性疾病有效的替代方案。

本发明的另一方面，其特征在于，提供包含上述a.c.c.提取物作为有效成分的抗菌及抗炎症组合物。由于上述a.c.c.提取物呈现抗炎症效果与抗菌作用的协同作用，因此可用作有效的炎症治疗剂。

对包含黄柏的总共有14种的中药材进行蒸馏提取而获得的a.c.c.提取物一起具有抗炎症效果和强效的抗菌效果。

并且，本发明的a.c.c.提取物减少tnf-α、il-1β及il-6的生成，由此呈现通过调节inos的表达而抑制no生成的抗炎症效果。

因此，本发明的a.c.c.提取物在临床上也是通过抗炎症及抗菌作用而缓解尿布疹及痱子等症状的物质，可用作有效的炎症治疗剂。

附图说明

图1为包含phellodendronbark(黄柏)的14个天然物的蒸馏提取的示意图。

图2为表示利用mttassay方法确认用lps处理a.c.c提取物而对raw264.7细胞带来的毒性的结果的图表。(*，p<0.05，**，p<0.01comparedtocontrol.con；control，lps1μg/ml；1μg/mllipopolysaccharide，a0；lps1μg/ml，a1；a.c.c.1μg/ml，a5；a.c.c.5μg/ml，a10；a.c.c.10μg/ml，q.c10μm；quercetin10μm.)

图3为表示在raw264.7细胞中被lps诱导而增加的no生成因a.c.c.提取物而浓度依赖性地抑制的图表。(###，p<0.001comparedtocontrol，and***，p<0.001comparedto1μg/mllps.con；control，lps1μg/ml；1μg/mllipopolysaccharide，a0；lps1μg/ml，a1；a.c.c.1μg/ml，a5；a.c.c.5μg/ml，a10；a.c.c.10μg/ml，q.c10μm；quercetin10μm.)

图4为表示a.c.c.提取物对raw264.7细胞的cytokine生成抑制带来的效果的图表。

(a)a.c.c.提取物对tnf-α的剂量依赖性的影响(effectsofa.c.c.extractsontnf-αindose-dependentmanner)。

(b)a.c.c.提取物对il-1β的剂量依赖性的影响(effectsofa.c.c.extractsonil-1βindose-dependentmanner)。

(c)a.c.c.提取物对il-6的剂量依赖性的影响(effectsofa.c.c.extractsonil-6indose-dependentmanner)。

pro-inflammatorycytokines为被lps刺激的raw264.7细胞，在培养基中测定。###，p<0.001comparedtocontrol，and**，p<0.01，and***，p＜0.001comparedto1μg/mllps.con；control，lps1μg/ml；1μg/mllipopolysaccharide，a0；lps1μg/ml，a1；a.c.c.1μg/ml，a5；a.c.c.5μg/ml，a10；a.c.c.10μg/ml.

图5为表示使用a.c.c.提取物之后尿布疹及痱子等的症状变化的图表。(n＝18).*，p<0.05，and***，p<0.001comparedto0week

图6为表示使用a.c.c.提取物之后尿布疹及痱子等的症状变化的图片。

具体实施方式

以下，通过实施例，更详细的说明本发明。但是，这些实施例只不过是本发明的例示性记载内容，而本发明的范围并不局限于这些实施例。

实施例1.材料的挑选及a.c.c.提取物的准备

基于本草学，进行文件调查，总共挑选出14种的中药材。中药材购买了由首尔药令市的ck(株)出品的包装为生药制剂而销售的产品。达尔伯克改良伊格尔培养基(dulbecco’smodifiedeagle’smedium，dmem)、胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)购买于海克隆(hyclone)(logan，ut，usa)。青霉素(penicillin)(100u/ml)、链霉素(streptomycin)(100ug/ml)购买于gibco(生命技术有限公司，盖瑟斯堡，md，usa，lifetechnology1nc.，gaithersburg，md，usa)。lps、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4，5-dimethylthiazol-2-y1)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，mtt)、亚硝酸钠(sodiumnitrite)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide)(dmso)购买西格玛化学品公司(sigmachemicalco.)(st.louis，mo，usa)。nitriteoxide(no)检测试剂盒(detectionkit)购买于内含子(intron)来使用，elisa分析试剂盒(assaykit)购买于赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)。

根据各个比率，配合除了黄柏之外的13种中药材，将第三蒸馏水40l用作溶剂，在80℃下蒸馏提取11小时(参照图1、表1)。

表1

表1.材料及a.c.c.提取物中的比率

实验例1：基于mttassay的细胞毒性测定

raw264.7细胞的培养

raw264.7细胞购买于韩国细胞株银行。使用含有penicillin/streptomycin100unit/ml和10％fbs的dmem培养基，在37℃、5％co2培养箱(incubator)中培养，隔3天一次进行继代培养。

raw264.7细胞生存率测定，将96孔板(wellplate)调节为2×10⁴cells/well的浓度之后，培养24小时，执行稳定化。24小时之后，全部去除well的培养基。以将a.c.c.提取物的最终浓度达到1、5、10μg/ml的方式稀释于培养液，并处理在细胞株之后，培养3小时。3小时之后，在除了对照组之外的well处理lps1μg/ml。24小时之后均去除培养基之后，在各well添加mtt溶液(0.2μg/ml无酚红dmem，0.2μg/mlinphenolredfreedmem)100μl，在37℃、5％co2incubator中反应2小时，使mtt还原。之后，在各well添加dmso溶液来溶解所生成的甲臜(formazan)。利用酶标仪(microplatereader)，在545nm下测定吸光度。

实验例2：nitricoxide生成量的测定

在6wellplate中，以1×10⁵cells/well的浓度，添加raw264.7细胞。在37℃、5％co2incubator中保管24小时之后，在raw264.7细胞处理1、5、10μg/mla.c.c.提取物，3小时之后，处理lps1μg/ml，培养24小时。用基于格里斯反应(griessreaction)的nitriteoxide(no)detectionkit(intron)来分析nitricoxide。在细胞培养上清液中放入格里斯试剂(griessreagent)并混合，在常温下反应10分钟之后，利用酶标仪(microplatereader)，在520nm吸光度下测定。基于亚硝酸钠(sodiumnitrite)的不同浓度标准曲线，适用于式中，确定培养液内的no浓度。

实验例3：炎症相关cytokines分泌量的测定

在6wellplate中添加1×10⁵cells/well的浓度的raw264.7细胞，以便测定作为炎症诱发细胞因子的tnf-α、il-6及il-1β生成量。24小时之后，处理1、5、10μg/mla.c.c.提取物，3小时之后，将1μg/ml的lps处理在除了对照组以外的所有well。培养24小时之后，利用elisakit(thermofisherscientific)，分析分泌在培养基的tnf-α、il-6及il-1β。利用microplatereader，在450nm下测定。

实验例4：抗菌活性的测定

为了察看a.c.c.提取物的抗菌活性，使用纸盘(paperdisc)测定抗菌力。试验之前培养的试验菌株，1.0×10⁴以上接种在各培养基。在灭菌的paperdisk装载a.c.c.100μl之后，干燥30分钟，以备用。在接种试验菌株的培养基上，按间隔放置装载有a.c.c.的paperdisk之后，在incubator中培养24-48小时。测定paperdisk周边的抑菌圈，进行结果判定及分析。

实验例5：临床研究

通过公告而召集的被试者，根据对象的特性，由代理人(监护人)制作“预先问卷”。通过预先问卷调查，掌握症状、皮肤状态等之后，提供组合物，研究人员教育被试者每天同样的时间，以每天1cc的量涂布5-10次，如此涂布14天。并且，为了客观的研究结果，拍摄患处图片，比较分析涂布前与涂布后，此时图片中除外如脸部一样可识别个人的部位。涂布14天之后，代理人制作“试验问卷”。资料的保管机关根据生命伦理法，从研究结束的时间点起保管3年，信息保护期间之后，个人信息及图片将通过不能复原的方法永久删除。

实验例6：统计分析

所有测定值由平均±标准偏差值表示，适当地通过两侧独立样品t-检验(t-test)或方差分析检验(anovatest)执行统计分析。在各组之间的组平均值显示相当大的差异时，通过事后测验方法scheffe’s方法，适用该分析。

实验结果

1.a.c.c.提取物对raw264.7细胞引起的细胞毒性

为了确认a.c.c.提取物对raw264.7细胞引起的影响，按不同浓度(1、5、10μg/m1)预处理a.c.c.提取物之后，处理1μg/ml的lps。培养24小时之后，利用mttassay方法，确认细胞毒性。其结果确认，细胞生存率分别为98.47、90.91、93.23％，对细胞生存不呈现显著意义的高生存率(图2)。

2.a.c.c.提取物对raw264.7细胞的no生成抑制带来的效果

用巨噬细胞刺激lps时，表达诱生型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，inos)，生成过量的no。生成的no促进炎症反应，诱发组织损伤。因此，要报道a.c.c.提取物是否抑制no之类的炎症性介质物质。其结果确认，在raw264.7细胞处理lps时，与对照组相比，no生成从0.45增加至3.15，即，增加7倍。当以1、5、10μg/ml处理a.c.c.提取物而测定no的生成抑制效果时，其结果确认，在raw264.7细胞中因lps诱导而增加的no生成因a.c.c.提取物而浓度依赖性地被抑制(参照图3)。

3.a.c.c.提取物对raw264.7细胞的cytokine生成抑制带来的效果

在诱导炎症反应的过程中，伴随着no及pge2之类的炎症介质物的生成与通过免疫反应的炎症性cytokine的生成。代表性的cytokine有tnf-α、il-1β及il-6。为了察看a.c.c.提取物对炎症介质性cytokine生成带来何种影响，通过elisaassay方法，测定tnf-α、il-1β及il-6的变化量。按不同浓度，在raw264.7细胞处理a.c.c.提取物之后，进行lps处理。其结果，在raw264.7细胞处理lps时，与对照组相比，tnf-α、il-1β及il-6增加得相当多(图4)。但是，通过处理a.c.c.提取物，减少tnf-α、il-1β及il-6。尤其是，当以10μg/ml浓度处理a.c.c.提取物时，减少得相当多。通过这种结果确认，a.c.c.提取物抑制在raw264.7细胞中诱导炎症的cytokine，由此具有抗炎症效果。

4.a.c.c.提取物的抗菌活性效果

作为瘙痒、小儿出疹的主要病原菌，已知a群链球菌(streptococcuspyogenes)及金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)。并且，作为女性阴道炎(vaginalcandidiasis)、出疹、瘙痒感的主要病原真菌，有白色念珠菌(candidaalbicans)，由此，当男性的大腿根等皮肤折叠而潮湿的部位被霉菌感染时，可发生股癣或擦烂性念珠菌病之类的皮肤感染症。在本实验中，通过以下表的方法，对绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa，methicillin-resistantstaphylococcusaureus)、白念珠菌(candidaalbicans)及变异链球(streptococcusmutans)菌进行实验，a.c.c.提取物在总共为5种的菌株中呈现99.9％的强效的细菌减少率(％)(表2)。

表2

表2.a.c.c.提取物的抗菌活性效果

因此，可知a.c.c.提取物是对以上5种菌具有强效的抗菌效果的有效成分。

5.a.c.c.提取物对婴·幼儿的尿布疹、痱子的影响

将患有尿布疹、瘙痒症、痱子症状的婴·幼儿作为对象，涂布a.c.c.提取物时，临床上确认了出疹、过敏性皮肤、溃烂、瘙痒症、痱子等症状是否得到改善。临床试验前，以出疹、过敏性皮肤、溃烂、瘙痒症及痱子等总共5种项目，进行预先问卷调查。以总共4分为满分进行，出疹项目为2.61±1.1分，最高，其次分数高的痱子项目为2.41±1.1分。制作预先问卷之后，每天在同样的时间，一天5～10次涂布1cc量，如此涂布14天，过14天之后，制作试验问卷。其结果，使用后分数均为1.5分以下，呈现整体上得到改善的形态。使用前最高的出疹与痱子全部分别为1.39±0.70、1.35±0.70分，确认减少得相当多的结果(图5、表3)。并且，对婴·幼儿的临床试验前与将a.c.c.提取物涂布1周之后，以及将a.c.c.提取物涂布2周之后的经过进行比较而观察。其结果，皮肤的痱子经过2周时，可确认消失得相当多。因此，a.c.c.提取物被视为对尿布疹及痱子等的症状有效果(参照图6)。

表3

表3.a.c.c.提取物对婴幼儿的尿布疹、痱子带来的影响

由本发明的上述实验结果，可确认a.c.c.提取物在作为小鼠巨噬细胞的raw264.7细胞中不具有细胞毒性(图2)，这意味着a.c.c.提取物在细胞中呈现的效果是与细胞的生存率的变化无关的固有的效果。

为了确认a.c.c.提取物的抗炎症效果，以不同浓度，将a.c.c.提取物预处理在raw264.7细胞3小时，将1μg/mllps处理24小时之后，测定细胞中炎症性因子no的生成变化。其结果，根据lps而增加的no生成量被a.c.c.提取物浓度依赖性地减少(图3)。

这种结果意味着a.c.c.提取物在通过lps进行的炎症过程中抑制重要介质因子no的形成，由此具有抗炎症作用。

并且，当开始炎症反应时，炎症反应的转录因子nf-κb被激活，调节tnf-α、il-1β及il-6之类的重要炎症促进蛋白的基因表达，已知这些调节inos的激活而对炎症反应起到重要作用。因此，确认对作为炎症的重要指标的炎症介质性细胞因子(tnf-α、il-1β及il-6)带来的a.c.c.提取物的效果。在raw264.7细胞处理lps，诱发炎症，此时，确认a.c.c.提取物如何改变tnf-α、il-1β及il-6的生成量的结果，可见a.c.c.提取物浓度依赖性地强效减少被lps诱导的炎症因子(图4)。

通过这些结果明确得知，a.c.c.提取物减少tnf-α、il-1β及il-6的生成，由此呈现通过调节inos的表达而抑制no生成的抗炎症效果。并且，a.c.c.提取物对pseudomonasaeruginosa、staphylococcusaureus、mrsa(methicillin-resistantstaphylococcusaureus)、candidaalbicans及streptococcusmurans菌，呈现99.9％的强效细菌减少率(％)(表1)。这说明a.c.c.提取物是呈现抗炎症效果和抗菌作用的协同效果的有效的炎症治疗剂，具有可利用性。为了明确地确认这些，将患有尿布疹、瘙痒症、痱子症状的婴·幼儿作为对象，评价了涂布a.c.c.时是否有出疹、过敏性皮肤、溃烂、瘙痒症、痱子等的症状改善效果。评价预先问卷的结果显示，在4分为满分的情况下，出疹项目为2.61±1.1分，最高，使用14天之后，分数为1.39±0.70分，比使用前减少得相当多(图5)。并且，观察婴·幼儿的临床试验前、后的经过的结果可确认，将a.c.c.提取物使用2周时，皮肤的痱子缓解得相当不错。这明确说明，a.c.c.提取物在临床上也是通过抗炎症及抗菌作用而缓解尿布疹及痱子等的症状的物质(图6)。因此，具有抗炎症及抗菌效果的a.c.c.提取物及将其作为主原料的产品可作为对炎症性疾病有效的替代方案。