本发明公开的内容提供了具有治疗和诊断效用的抗体-尿素酶偶联物。更加具体而言，本发明公开的内容涉及通过将一个或多于一个完全抗体与尿素酶偶联而制备的诊断偶联物和/或治疗偶联物。
背景技术：
癌症占美国总死亡率的五分之一，并且是第二致死病因。癌症通常由细胞群的不受控的分化来表征。这种不受控的分化可涉及血细胞，例如各种不同类型的淋巴瘤，或在特定组织或器官中聚集的或特定组织或器官本身具有的细胞，例如，实体瘤，所述实体瘤例如，继发性或原发性乳腺肿瘤、肺肿瘤、肝肿瘤、食道肿瘤、胃肿瘤、肠肿瘤、脑肿瘤、骨肿瘤或前列腺肿瘤。
多种治疗方式已计划用于癌症治疗。一种这样的治疗方式涉及使用特定酶抑制癌细胞的生长。本领域已知的一种这样的酶是尿素酶，其是催化尿素水解成二氧化碳和氨的酶。更加具体而言，尿素酶催化尿素水解以生成氨和氨基甲酸盐，生成的氨基甲酸盐随后通过自发水解作用降解而生成另一氨和碳酸。就这点而言，尿素酶的活性倾向于增加其所在的局部环境的ph值，因为尿素酶产生氨，氨为碱性分子。
在本领域中，已意识到在治疗癌症中使用靶向肿瘤相关抗原的抗体的概念有一段时间(herlynet.al.，(1980)cancerresearch40，717)。然而，就尿素酶而言，毒性成分是尿的酶降解产生的碱性环境。在这种情况下，所使用的抗体仅需要具有对对应抗原的高结合亲和性。虽然治疗性抗体可与尿素酶一同使用，但是，目前正在进行的临床试验仅仅使用了高亲和性抗体片段。这种方式产生了若干独特的考虑因素，包括尿素酶是非常大的酶而抗体片段显著较小这一事实。为了解决由尿素酶的尺寸产生的可能的空间位阻，常规使用非人类抗体片段的多个拷贝。
因为这些片段的多个拷贝被用于确保合适的结合，需要限制抗体上所包括的其他成分。而且，因为抗体片段上的结合位点可能有限，所以通过单一栓系(tether)使各个抗体片段与尿素酶结合。而且，虽然抗体片段的免疫原性看起来最小，但是非免疫原性方式会消除不良免疫反应的甚至最小的可能性或消除联合给药免疫抑制剂的需要。
技术实现要素：
本发明公开的内容涉及抗体-尿素酶偶联物。所述偶联物包括共价结合至尿素酶的一个或两个抗体，所述抗体与尿素酶共价结合从而形成抗体-尿素酶偶联物，所述偶联物任选地包括与所述尿素酶或所述抗体结合的一个或多于一个治疗剂。
在一种实施方式中，本发明提供抗体-尿素酶偶联物，该偶联物包含共价结合至尿素酶的抗体，所述抗体共价结合至尿素酶从而形成抗体-尿素酶偶联物。一方面，所述偶联物还包含共价结合至所述抗体或所述尿素酶的治疗剂。
一方面，所述抗体-尿素酶偶联物包括共价结合至所述尿素酶的至少两个抗体。在一些方面，所述抗体中的至少一个在两个或多于两个位点处共价结合至所述尿素酶。在一些方面，所述抗体中的至少一个在三个或多于三个位点处共价结合至所述尿素酶。在一些方面，抗体中的每一个在两个或多于两个位点处共价结合至所述尿素酶。
在一些方面，所述抗体中的至少一个是完全抗体。在一些方面，所述完全抗体包括至少两个fab片段和fc片段。在一些方面，所述完全抗体的分子量为至少120kda，或130kda，或140kda或150kda。在一些方面，所述完全抗体在两个或多于两个位点处共价结合至所述尿素酶。
在一些方面，所述抗体不指向异常朊病毒。
本发明的这些方面和其他方面在下文中进一步描述。
具体实施方式
释义
应当注意地是，除非上下文另有明确说明，本文以及后附的权利要求书中所使用的单数形式(“a”，“an”和“the”)包括复数指代物。因此，例如，涉及“溶剂(solvent)”的内容包括多种这样的溶剂。
本文使用的术语“包含(comprising或comprises)”是指组合物和方法包括所记载的元素，但是不排除其他元素。当使用“基本由......构成”限定组合物和方法时，其是指排除对用于所述目的的组合具有实质性意义的其他元素。因此，基本由本文限定的元素构成的组合物或工艺不排除对要求保护的内容的基本特性和新特性不产生实质性影响的其他物质或步骤。“由......构成”是指排除超过痕量元素的其他成分和实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个限定的实施方式在本发明公开的内容的范围内。
除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的表达成分的量、反应条件等的所有数字在所有情况下均被理解为由术语“约”修饰。因此，除非有相反说明，在下文的说明书和所附的权利要求书中列出的数字参数是近似值。每个数字参数应至少根据所报告的有效数字的数值并应用常规四舍五入法来解释。当在数字标号(例如，温度、时间、量和浓度，包括范围)之前使用术语“约”时表明可改变正负10％、正负5％或正负1％的近似值。
术语“尿素酶”是指具有尿素酰胺水解酶(e.c.3.5.1.5)的酶活性的酶，其是天然生成的或通过例如重组核酸技术和/或化学合成而获得。尿素酶还包括融合蛋白，该融合蛋白包括整个尿素酶，其亚单位或片段，和/或保持多肽的尿素酰胺水解酶活性的带有氨基酸取代、缺失或添加的尿素酶。
“偶联物”是指共价连接以形成较大的构建体的两个或多于两个分子。在一些实施方式中，所述偶联物包括结合至一个抗体或共价连接的两个抗体的尿素酶。一方面，所述连接是直接连接，其中，尿素酶上的反应性官能团结合至抗体上的互补反应性官能团，例如赖氨酸的氨基官能团结合至天冬氨酸或谷氨酸的羧基官能团。应当理解的是，这种反应可能需要对羧基基团进行常规修饰以使其更具有反应性。
另一方面，所述连接通过具有两个或多于两个官能团的连接体实现，所述官能团例如，羧基或氨基，所述官能团使得连接体与尿素酶和抗体这两者发生反应。连接体是本领域熟知的并且通常包括1至20个原子，所述原子包括碳、氮、氢、氧、硫，等等。所述反应性官能团可以是相同的，例如，草酸、琥珀酸，等等；或者可以是正交官能团，例如，氨基(偶联之后成为nh)和羧基(偶联之后成为co或coo)。
一方面，合适的连接体是r1-l-r2，其中，r1和r2是相同的官能团或不同的官能团，r1和r2中的一个连接至抗体，另一个连接至尿素酶。r1和r2可独立地选自：-nh-，-co-，-coo-，-o-，-s-，-nhnh-，-n＝n-，＝n-nh-，等等。l可以是直烃链或分支的烃链，例如，烷基链，其中，一个或多于一个碳被氧、氮、酰胺、硫、亚砜、砜、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基等任选地取代。另一方面，所述连接体可以是氨基酸残基或肽。在一些情况下，所述连接体是可由酶裂解的或通过ph的改变在靶定位点或接近靶定位点处裂解。一些连接体和适于制备偶联物的步骤在美国专利us4,414,148，us4,545,985，us4,569,789，us4,671,958，us4,659,839，us4,680,338，us4,699,784，us4,894,443和us6,521,431中描述。
术语“抗体”是指完全或基本完全哺乳动物抗体，包括从小鼠、美洲驼、猪、大鼠、牛、绵羊等获得的那些抗体。基本完全抗体包含与完全抗体具有至少90％同源性或所述基本完全抗体被截短以包括抗体的结合位点和完全抗体的至少70％。诸如包含少于抗体的70％的那些抗体片段之类的抗体片段不在本文公开的抗体的定义范围内。本文使用的“抗体片段”是指少于抗体的70％的完全抗体的一部分。优选地，抗体识别诸如癌症抗原之类的疾病抗原。然而，优选地，所述抗原不是朊病毒抗原。
术语“治疗剂”是指针对给定疾病或诸如微生物之类的致病原提供治疗或预防作用的任何药剂。优选地，所述治疗剂是抗癌剂，例如，阿霉素，柔红霉素，表柔比星，长春碱，长春新碱，米托蒽醌，博来霉素，丝裂霉素，氮芥，等等。
本文使用的术语“治疗(treat，treating或treatment)”包括缓解、降低或改善疾病或病症或其一种或多于一种症状，预防其他症状，改善或预防症状的潜在代谢原因，抑制疾病或病症，例如，阻止或抑制疾病或病症的发展，减轻疾病或病症，导致疾病或病症减退，缓解由疾病或病症产生的病症，或抑制疾病或病症的症状，并且该术语意在包括预防。该术语还包括缓解疾病或病症，例如，使临床症状减退。该术语还包括实现治疗益处和/或预防益处。治疗益处是指使正在被治疗的潜在失调根除或得到改善。而且，治疗益处通过根除或改善与潜在失调相关的生理症状中的一种或多于一种来实现，这样，在个体中观察到改善，尽管如此，个体仍然患有潜在的失调。对于预防益处而言，将组合物给药于处于患上特定疾病风险中的个体或给药于报告了疾病的生理症状中的一种或多于一种的个体，即便还未诊断出这种疾病。
抗体-尿素酶偶联物
本发明公开的内容涉及一个至两个或多于两个抗体与尿素酶的偶联。这种偶联被认为增加了抗体-尿素酶偶联物与抗原靶点的结合亲和性，因为抗体的尺寸与尿素酶的尺寸大致相同，从而显著降低了使用抗体片段产生的任何空间位阻。亲和性的这种增加允许每个尿素酶使用1个抗体或2个抗体。而且，本发明公开的抗体-尿素酶偶联物可直接结合至一个或两个抗体，任选地可通过连接体结合至一个或两个抗体。抗体尺寸相对于抗体片段尺寸的增加允许使用多个偶联位点以使结合稳定。在一种实施方式中，偶联物包括在单个抗体和单个尿素酶之间的1个至8个偶联位点。在另一实施方式中，偶联位点的数目为2个至8个。在一种实施方式中，偶联物包括在单个抗体和单个尿素酶之间的2个，或3个或4个至8个偶联位点。在另一实施方式中，偶联位点的数目为至少2个，3个或4个。
甚至更进一步，其他成分(例如，但不限于：诸如抗癌剂之类的治疗剂)也可结合至抗体以进一步提高治疗作用。在一种优选的实施方式中，抗体不指向异常朊病毒。
通常，抗体的尺寸可与尿素酶尺寸相当，因为尿素酶的尺寸较大，因此所述抗体是非典型的。迄今为止，通常为约150kda的完全抗体需要使用抗体片段与酶偶联，从而提供合适的结果。在这种情况下，本发明的发明人已发现由于尿素酶尺寸与抗体尺寸相当，因此，所使用的偶联物有利地是抗体-尿素酶偶联物，特别是当使用多个偶联位点时，所述抗体-尿素酶偶联物产生更高的结合亲和性和提高的稳定性。这是可能的，由于尿素酶具有独特的大的且无定形尺寸，例如，545kda的jackbean尿素酶(由氨基酸序列计算的质量)。此外，示例性的尿素酶的尺寸还在抗体和酶之间产生多个偶联点，这可进一步稳定抗体和尿素酶之间的结合，提供1∶1，2∶1或可能地3∶1的抗体∶尿素酶结合比例。
在另一实施方式中，如进一步降低或抑制免疫排斥所必需的，抗体-尿素酶偶联物可以是人源化的。
尿素酶
本领域已有多种研究提供了关于来自多种进化多样性细菌、植物、真菌和病毒的尿素酶的遗传学的详细信息(mobley，h.l.t.et.al.，(1995)microbiol.rev.59：451-480；eurj.biochem.，175，151-165(1988)；labigne，a.(1990)国际公布wo90/04030；clayton，c.l.et.al.，(1990)nucleicacidres.18，362；以及美国专利us6,248,330和us5,298,399，上述参考文献的全部内容通过引用并入本文)。特别感兴趣的尿素酶在植物中找到(sirko，a.和brodzik，r.(2000)actabiochimpol47(4)：1189-95)。如上所述，一种示例性的植物尿素酶是jackbean尿素酶。示例性的jackbean尿素酶的氨基酸序列由下述seqidno：1表示。其他有用的尿素酶序列可在公共数据库中识别，例如，entrez(ncbi.nlm.nih.gov/entrez)。
在本发明的实施方式中，尿素酶是具有如下所示的seqidno.1的jackbean尿素酶：
抗体
本文使用的“抗体”或“抗原-结合多肽”是指特异性识别并且结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完全抗体和任何抗原结合片段或其单个链。
“完全抗体”是指如下抗体，所述抗体包括两个抗原结合区域(fab)和fc片段。在一些实施方式中，完全抗体包括两个轻链和两个重链。
多种抗体可用于本发明公开的内容的实施。例如，可使用多克隆和单克隆抗体。单克隆抗体可根据常规技术生成，例如，杂交瘤合成，重组dna技术和蛋白质合成。
在优选的实施方式中，抗体不指向异常朊病毒。
偶联
本发明公开的抗体-尿素酶偶联物可通过本领域已知的任何常规手段制备。例如，抗体可直接偶联至尿素酶或通过连接体偶联至尿素酶。化学偶联分子的方式是本领域技术人员所熟知的。将抗体偶联至尿素酶的方法在例如美国专利us7,211,250和us7,264,800中公开，该美国专利的全部内容通过引用并入本文。
稳定尿素酶
在一些实施方式中，本发明提供通过将尿素酶与一个或两个或多于两个抗体偶联稳定尿素酶的方法，所述抗体用于本发明公开的内容中描述的尿素酶-抗体偶联物。这种偶联被认为增加抗体-尿素酶偶联物与抗原靶点的结合亲和性，因为抗体的尺寸与尿素酶的尺寸大致相同，从而显著降低了由使用抗体片段而产生的任何空间位阻。亲和性的这种增加允许每个尿素酶使用1个或2个抗体。而且，本发明公开的内容的抗体-尿素酶偶联物可直接结合至一个或两个抗体，任选地可通过连接体结合至一个或两个抗体。抗体尺寸相对于抗体片段尺寸的增加允许使用多个位点偶联以使结合得以稳定。在一种实施方式中，偶联物包括在单个抗体和单个尿素酶之间的1个至8个偶联位点。在另一实施方式中，偶联位点的数目是2个至8个。在一种实施方式中，偶联物包括在单个抗体和单个尿素酶之间的2个，或3个，或4个至8个偶联位点。在另一实施方式中，偶联位点数目是至少2个，3个或4个。
在一些实施方式中，抗体和尿素酶至少形成防止或减少抗体和尿素酶之间的解离的化学键，例如，共价键或离子键。一方面，所述化学键是不稳定的，这样，所述化学键在某些体内环境中降解(例如，肿瘤细胞附近，肿瘤细胞附近的ph不同于正常组织)。另一方面，所述化学键是非不稳定的并且在正常生理条件下是稳定的。
实施例
下列实施例以举例说明本发明公开的各种不同的实施方式的目的给出。这些实施方式无意以任何方式限定本发明公开的内容。本领域技术人员会理解的是，本发明公开的内容恰好适于实施本发明的目的并且获得本文所述的结果和优势，以及本文固有的任何目的、结果和优势。本实施例(以及本文所述的方法)目前代表优选的实施方式。它们是示例性的并且无意限定本发明公开的范围。如权利要求书的范围所限定的，包括在本发明公开的内容的实质范围内的各种不同的改变和其他应用对于本领域技术人员而言是明显的。
实施例1
抗体-尿素酶偶联物通过使用siab(琥珀酰亚胺基-(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯)作为连接体，将抗-erbb2单克隆抗体4d5与尿素酶偶联而制备。siab是用于通过n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯和碘代乙酰基反应性基团进行胺-与-巯基偶联的中等长度的交联体。siab生成长度为约10.6埃的间隔臂。siab由thermoscientific销售，并且其在偶联中的应用在例如hermanson，bioconjugatetechniques，1996，sandiego，academicpress中第542页，553页和568页描述。偶联程度可通过增加相对于抗体使用的连接体的量来增加。而且，抗体可首先通过使用连接体的多个等同物由连接体处理，随后连接体和抗体的组合可与尿素酶结合。
首先，抗-erbb2单克隆抗体4d5由siab(siab∶igg的摩尔比＝3.8∶1)在原始缓冲基质的ph条件下活化70分钟。随后加入tris-hcl缓冲液在室温下淬灭反应10分钟，得到最终浓度5mm。得到的溶液用冰/水冷却，并且在涡流搅拌的同时加入冷却的高纯度的尿素酶(5mg/ml，～oc，gmp等级的jackbean尿素酶)。蛋白质摩尔比为1∶2/igg∶hpu。添加1/10体积的tris-hcl(200mm，ph8.45)以在90分钟内调节ph至8.0-8.3。对于稳定性而言，添加水解的siab，使大部分尿素酶的表面亚硫酸氢盐溢出。摩尔比为1∶7(尿素酶∶氢-siab)，室温，30分钟。随后通过添加半胱氨酸溶液(200mmtris-hcl缓冲液中含有100mm，ph8.45)淬灭反应，得到最终浓度5mm，室温，十分钟。得到的混合物由gehealthcaresuperose610/300柱进行sec分离，收集各个组分。汇集组分f10-13分钟并且相对于含有1％蔗糖和0.2mm的edta的20mm的精氨酸缓冲液，在ph7.0的条件下进行透析(mwco12-14kd)。随后，通过下列方法分析收集的样品：sds-page，采用bca规程的蛋白质分析方法，采用管规程的尿素酶活性分析方法，以及elisa结合分析方法以揭示偶联物是活性的。
通过上述内容可以理解的是，虽然本发明公开的特定实施方式以举例说明的目的在本文中进行描述，但是，在不背离本发明公开的实质和范围的条件下可做出各种不同的改变。
在本发明公开的内容的全文中参考了各种不同的专利申请和公开出版物，各种不同的专利申请和公开出版物中的每一个的全部内容通过引用并入本文。