含静脉瓣的生物源性静脉的制备方法与流程

本发明涉及生物医学工程，具体地指一种含静脉瓣的生物源性静脉的制备方法。

背景技术：

下肢静脉曲张是临床上的常见病，易发于45岁以上的人群。患者早期很少出现明显的临床症状，但到后期则可能出现下肢浅静脉显露，伴酸、沉、胀、痛、易疲劳等症状，严重者可并发血栓性浅静脉炎、瘀积性皮炎、瘀积性溃疡、曲张静脉团出血。下肢静脉曲张的病因是静脉瓣功能不全，导致下肢静脉血液充盈，压力高，从而静脉曲张，静脉曲张导致局部血液循环障碍并影响肢体外观，目前治疗下肢静脉曲张最有效的方法是高位结扎和大隐静脉剥离，这类方法都仅仅是对症治疗，无法恢复静脉瓣的功能，没有消除静脉曲张的根本病因，并且对患者伤害大，术后患者恢复比较慢，复发率比较高，还会造成多个手术瘢痕的遗留。

生物材料在人体内表现出良好的生物相容性及血流动力学特征，公开号为cn105770991a的中国发明专利公开了一种生物源性静脉瓣膜的制备方法，但将制得的牛的颈静脉管道植入狗后腔静脉2周后吻合口处如图1所示，超声显示吻合口直径0.48厘米，静脉内直径0.69厘米，吻合口狭窄部位横截面积/非吻合口横截面积＝48.4％，吻合口增生导致吻合口横截面积下降了51.6％；内膜处如图2所示，超声显示增生处内径0.53cm，其它处内径0.7cm，横截面积减少了43％，血管内膜显著增生。吻合口及内膜的增生会阻挡血流，造成含静脉瓣的牛颈静脉狭窄，甚至闭塞的严重后果。因此，需要开发出一种异种植入后静脉内膜及吻合口内膜增生受到明显抑制的含有静脉瓣膜的生物源性静脉的制备方法。

雷帕霉素是一种高效的免疫抑制剂，临床上多用于器官移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗，《局部应用雷帕霉素在预防移植静脉再狭窄中的作用》(中国动脉硬化杂志；2006年11期)中公开了在已知血管外面局部应用雷帕霉素，可以在一定时间内抑制移植血管的的吻合口增生，从而降低静脉移植术后的再狭窄发生率。但上述文献的方法实验对象是自体血管移植，不涉及免疫排斥反应，把牛的含静脉瓣的静脉移植到狗的静脉属于异种移植，异种之间产生更大的排斥反应，严重会导致静脉及吻合口狭窄甚至闭塞，对抗免疫排斥反应要求更高，文献中的方法无法满足。文献中处理方式是将雷帕霉素加入生物蛋白胶后注射在移植静脉的周围间隙，雷帕霉素被涂抹于血管外膜，雷帕霉素需要渗透过血管壁进入静脉内膜来起到抑制静脉内膜增生的作用，静脉内膜中雷帕霉素的浓度无法得到保证，还有文献中雷帕霉素是吻合口吻合完毕后使用，不同的手术者和不同的病人在使用量和具体位置有个体差异性，不利于保证效果的稳定性，自体血管移植无法大规模批量生产，限制了推广，自体血管的获取对病人造成二次创伤不可忽视。因此，亟待开发出一种制备方法，使含有静脉瓣的生物源性静脉内膜上稳定含有高浓度雷帕霉素，能够更强抑制静脉内膜和吻合口增生，即使异种植入后也能预防血管内膜和吻合口增生，避免静脉狭窄和闭塞，而且能够大规模推广应用，同时保证稳定的质量，更需要避免病人二次创伤。

技术实现要素：

本发明的目的就是要解决上述背景技术的不足，提供一种异种植入后静脉内膜及吻合口增生受到明显抑制的含静脉瓣的生物源性静脉的制备方法。

本发明的技术方案为：一种预防异种植入后内膜增生的含静脉瓣的生物源性静脉的制备方法，其特征在于，步骤为：

a、剪取直径0.5～1.5cm，长3～5cm含有完整瓣膜的猪或牛的颈静脉管道，清理并消毒；

b、对步骤a中得到的材料进行细胞裂解处理、细胞消化及核酸消化处理；

c、将经过步骤b处理的材料依次进行共价键合肝素处理、离子结合肝素处理、共价键合肝素处理；

d、将经过步骤c处理的材料浸入雷帕霉素溶液与丙交酯乙交酯共聚物plga混合形成的处理液中并且在处理液中匀速拉动1～10分钟，再将静脉内膜外翻浸入处理液中匀速拉动1～10分钟，取出放置于空气中自然晾干至溶液完全挥发，烘干保存；每1l所述雷帕霉素溶液由125～500mg雷帕霉素溶于100～200ml无水乙醇后加入pbs溶液定容得到，每1l雷帕霉素溶液与500～1000mgplga混合。

优选的，所述每1l雷帕霉素溶液由250mg雷帕霉素溶于125ml无水乙醇后加入pbs溶液定容得到。

优选的，每1l雷帕霉素溶液与750gplga混合。

优选的，所述共价键合肝素处理过程为：浸入1mol/l羟胺硫酸盐溶液中，室温下处理12h后用蒸馏水漂洗，浸入heparin-edc液中进行肝素交联处理，随后用pbs溶液冲洗；肝素交联的条件为37℃下摇动交联48～72h。

优选的，所述离子结合肝素处理过程为：浸入含1mg/mlpei的0.15mnacl水溶液中，室温下处理30min后用pbs溶液冲洗，浸入含0.5mg/ml肝素钠的pbs溶液中室温下处理30min后用pbs溶液冲洗，再重复执行上述操作14遍。

优选的，所述步骤b、c中的处理过程均在摇动转速为70～100rpm的摇床中进行。

本发明利用雷帕霉素抑制增生的原理，将雷帕霉素涂层于血管内膜和外膜，然后移植于异种静脉，使静脉内膜含有高浓度的雷帕霉素，防止静脉内膜及吻合口异常增生导致静脉狭窄、闭塞。

本发明的有益效果为：

1.通过静脉管道正反面两次浸入雷帕霉素处理液中，使雷帕霉素从血管内膜和外膜两侧进行附着渗透，浸入处理液时匀速拉动使雷帕霉素与内膜、外膜均匀结合，使处理后的血管均匀含有高浓度的雷帕霉素。

2.体外完成雷帕霉素涂层，有利于保证血管内膜上的雷帕霉素浓度稳定，消除个体吸收造成药物作用浓度的差异性。

3.雷帕霉素易于得到，已经商业化生产，提高了大规模处理含静脉瓣的牛颈静脉的可行性。

4.处理工艺清晰明了，保证了大规模处理质量的稳定性。

5.避免了获取自体血管造成的二次创伤。

附图说明

图1为现有技术得到的含静脉瓣的牛颈静脉植入狗后腔静脉后吻合口超声图

图2为现有技术得到的含静脉瓣的牛颈静脉植入狗后腔静脉后静脉内膜超声图

图3为本发明制得的含静脉瓣的牛颈静脉植入狗后腔静脉超声图

具体实施方式

下面具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

a、取直径在0.5～1.5cm并带有瓣膜的屠宰场日常宰杀的新鲜牛颈静脉管道，翻面后找到瓣膜部分，剪取长3～5cm含有完整瓣膜的区段，翻回正面后修剪掉静脉外周脂肪组织及多余的结缔组织，并用生理盐水顺行灌洗清除淤血块，再浸入0.1％(w/v)新洁尔灭溶液中消毒30min后用pbs溶液冲洗干净备用。

b、使用含0.5％(w/v)tritonx-100的pbs液处理步骤a中得到的材料48h，裂解细胞，并用pbs溶液冲洗。再浸入含0.025％(w/v)胰蛋白酶及0.02％(w/v)edta的pbs溶液(0.025g胰蛋白酶，0.02gedta溶于100mlpbs溶液中)中处理30min，消化细胞，并用pbs溶液冲洗。最后浸入含30u/mldnasei及0.3mg/mlrnasea的pbs溶液中处理24h，消化核酸，并用pbs溶液冲洗；

各处理过程均在37℃下，摇动转速70～100rpm的摇床中进行。

c、共价键合肝素处理：将上述处理的材料浸入1mol/l羟胺硫酸盐溶液中，室温下以70～100rpm摇动转速处理12h后用蒸馏水漂洗3次，每次10min，浸入heparin-edc液(1.67gedc+0.835g肝素钠+0.05mol/lhcl200ml，ph1.5)中在37℃，70～100rpm摇动转速下摇动交联48h后用pbs溶液冲洗3遍；

离子结合肝素处理：将上述处理的材料浸入含1mg/mlpei的0.15mnacl水溶液中，以70～100rpm摇动转速室温下处理30min后用pbs溶液冲洗3遍；再浸入含0.5mg/ml肝素的pbs溶液中，以70～100rpm摇动转速室温下处理30min后用pbs溶液冲洗3遍，再重复执行上述操作14遍；

再次进行共价键合肝素处理：处理过程与上述共价键合肝素处理过程相同，不再赘述。

d、将经过步骤c处理的材料浸入雷帕霉素溶液与plga混合形成的处理液中并且匀速拉动1～10分钟；再将静脉内膜外翻浸入处理液中匀速拉动1～10分钟，取出放置于空气中自然晾干至溶液完全挥发，然后放入20℃烘箱烘干12小时后室温保存，得到含静脉瓣的生物源性静脉；本实施例中每1l雷帕霉素溶液由250mg雷帕霉素溶于125ml无水乙醇后加入pbs溶液定容得到，每1l雷帕霉素溶液与750mgplga按比例混合得到处理液。

实施例2

除步骤d中处理液配方不同外，其余与实施例1相同。本实施例中每1l雷帕霉素溶液由125mg雷帕霉素溶于100ml无水乙醇后加入pbs溶液定容得到，每1l雷帕霉素溶液与500mgplga按比例混合得到处理液。

实施例3

除步骤d中处理液配方不同外，其余与实施例1相同。本实施例中每1l雷帕霉素溶液由300mg雷帕霉素溶于150ml无水乙醇后加入pbs溶液定容得到，每1l雷帕霉素溶液与1000mgplga按比例混合得到处理液。

实施例4

除步骤d中处理液配方不同外，其余与实施例1相同。本实施例中每1l雷帕霉素溶液由400mg雷帕霉素溶于180ml无水乙醇后加入pbs溶液定容得到，每1l雷帕霉素溶液与600mgplga按比例混合得到处理液。

实施例5

除步骤d中处理液配方不同外，其余与实施例1相同。本实施例中每1l雷帕霉素溶液由500mg雷帕霉素溶于200ml无水乙醇后加入pbs溶液定容得到，每1l雷帕霉素溶液与800mgplga按比例混合得到处理液。

实施例6

除步骤d中处理液配方不同外，其余与实施例1相同。本实施例中每1l雷帕霉素溶液由200mg雷帕霉素溶于125ml无水乙醇后加入pbs溶液定容得到，每1l雷帕霉素溶液与900mgplga按比例混合得到处理液。

上述使用的药品中：

pbs溶液：ph7.4，上海钰博生物科技有限公司；

plga：聚丙交酯乙交酯共聚物，济南岱罡生物科技有限公司其中丙交酯：乙交酯＝75:25；

pei：聚乙烯亚胺；

实验部分：

将上述制得的含静脉瓣的牛颈静脉植入狗后腔静脉，如图3所示，吻合口平滑无明显增生，静脉内膜无明显增生，血管腔无明显狭窄。

测试血管上雷帕霉素含量：

将制备得到含有雷帕霉素的血管剪碎，称重泡入15ml丙酮+15ml纯水中。放入摇床水浴37℃下100转/分振荡。

漩涡振荡5min，水浴22℃下5min，3500g(离心力)离心10min，吸取1ml上清液于2mlep管中，密塞，漩涡混匀15min，再加入500ul正己烷，漩涡30秒，5000g(离心力)离心10min，吸弃上层正己烷。下层置于水浴22℃下30min，完成样品处理，

样品经设备检测得到血管上雷帕霉素的含量，如实施例1中样品测得：用于吸收血管雷帕霉素的丙酮为1ml，血管的重量为0.36g，雷帕霉素的含量为24.63ug，血管上雷帕霉素的含量为68.41ug/g。

将实施例1-6得到的含静脉瓣的牛颈静脉进行检测，血管上雷帕霉素的含量如下表1所示。

表1

从表1可得，经本发明处理得到的血管上具有含量稳定的雷帕霉素，可充分作用于使静脉内膜，防止静脉内膜及吻合口异常增生。