一种可载药明胶栓塞微球的制备方法与流程

本发明涉及一种可载药明胶栓塞微球的制备方法。

背景技术：

作为介入放射学的最重要基本技术之一，经导管血管栓塞术(tae)是在医学影像设备的引导下，经导管向靶血管内注入或导入栓塞物质，使血管闭塞，从而达到预期治疗目的的技术，具有微创性、准确定位、低并发症、疗效好和可重复性强等优点。近年来越来越多的栓塞物质被国家食品药品监督管理局cfda批准用于血管、肿瘤等的栓塞临床手术，其中包括聚乙烯醇颗粒栓塞剂、聚乙烯醇栓塞微球、医用聚醚型聚氨脂栓塞剂等。而且栓塞疗法在治疗恶性肿瘤、子宫肌瘤、血管瘤、血管畸形和止血等方面取得了良好的效果。明胶是由胶原蛋白水解得到的一种天然高分子材料，具有生物相容性好、易得、吸水易膨胀、可生物降解等优点，无毒，无害，被广泛应用在食品、医药等领域。由明胶经过交联制得的明胶微球外观光滑呈球形，可以更好的适配血管；吸水后的明胶微球有弹性，能够达到较好的栓塞效果；明胶微球在体内可被生物降解，再通性能良好；基于明胶的分子结构，其可负载表柔比星等抗肿瘤药的可载药性能良好。

长期的临床实验表明，目前市面上售的明胶栓塞产品没有明确的降解时间，从而导致体内降解和血管再通时间不确定。传统的明胶微球降解时间范围较大，如14～90天，不利于临床监控。此外现阶段微球制备方式均是大尺度控制，微球尺寸宽，很难实现微球的粒径均一性。故仍存在粒径不均一、尺寸制备不可控等问题。尺寸太大，难以对末梢血管进行有效栓塞，尺寸太小，容易造成错误部位栓塞坏死，出现严重的并发症。如现有专利通过乳化交联聚合反应能制得100～300um、300～500um、500～700um的明胶微球，但其更小规格与更大规格微球仍不具备，且尺寸范围太宽。

技术实现要素：

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种可载药明胶栓塞微球的制备方法。本发明方法合成的明胶栓塞微球降解时间为5～45天，降解时间范围缩小，提高栓塞效率，而且产品规格多，微球粒径范围窄，粒径范围分别为50～100μm、50～150μm、100～150μm、150～250μm、250～350μm、350～560μm、560～710μm、710～1000μm、1000～1400μm、1400～2000μm、2000～2500μm，能更好地运用于临床。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种可载药明胶栓塞微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)将明胶溶解到注射用水中，配成质量分数为10～40％的明胶水溶液，然后将明胶水溶液置于40～70℃水浴中加热搅拌0.5～1.0h，超声10～30min，封口后置于40～70℃水浴中保温，备用；

(2)取油相溶液置于反应容器中，设置反应温度40℃～70℃，搅拌速度100～1000rpm，将步骤(1)所得明胶水溶液加入到油相溶液中，滴加完成后，降低反应体系的温度至5～25℃，加入碱性物质调节体系ph值到8.0～10.0，加入交联剂水溶液，控制滴加时间为0.5～1h，滴加完成后继续恒温反应5～20h；

所述油相溶液为矿物油、硅油或与水不互溶的有机溶剂中的一种或多种；

所述交联剂为甲醛、乙二醛、戊二醛或内交联剂中的一种或多种；

所述交联剂水溶液的质量百分比浓度为10％～35％；

所述明胶水溶液的加入量与油相溶液的体积比为1：2～10；

(3)反应结束后，所得反应液经后处理得到可载药明胶栓塞微球。

作为优选，步骤(2)中，油相溶液为液体石蜡或者乙酸乙酯。

进一步地，步骤(2)中，采用蠕动泵滴加装置或微流控芯片装置进行滴加明胶水溶液，与采用其他滴加方式相比，采用蠕动泵滴加装置或微流控芯片装置进行滴加明胶水溶液，更易于控制所得明胶微球的粒径且保障所得的明胶微球拥有更窄的粒径分布范围。

进一步地，步骤(2)中，蠕动泵滴加装置主要包括输水泵、蠕动泵、水浴锅、反应釜、保温套管，输水泵的出口通过软管与水浴锅的入口连接，水浴锅的出口与输水泵的入口连接形成闭合的循环回路，保温套管的外管的内径是内管外径的1.5～10倍，且内管由外管一端的小孔穿入，从外管的另一端的小孔穿出，两管接触的地方用防水胶粘合；现有的普通蠕动泵滴加装置由于缺少保温设备，容易导致在滴加过程中明胶溶液由于温度降低而凝固，从而出现导管堵塞现象，而本发明采用改进之后的蠕动泵滴加装置包括保温套管，能够有效避免堵塞导管。

进一步地，步骤(2)中，微流控芯片装置主要包括注射泵控制器、温度控制器、单通道微液滴生成芯片、搅拌器、反应釜，注射泵控制器通过微管与单通道微液滴生成芯片连接，温度控制器主要用于监测与控制单通道微液滴生成芯片的温度，单通道微液滴生成芯片通过油相的剪切力与流体界面张力之间的相互作用将水相分割成所需粒径的液滴。

作为优选，步骤(2)中，蠕动泵滴加装置采用的针头规格为14g～34g，此针头规格有利于较好地合成明胶微球，如果针头规格更小，也无法合成更小规格的微球，还会导致滴加速度减慢；如果针头规格更大，无法达到最佳流速，导致成球效果变差。

作为优选，步骤(2)中，微流控芯片装置的芯片管道出口内径为50～2500μm。

作为优选，步骤(2)中，明胶水溶液的滴加流速为1～20ml/min，以此流速进行滴加，既不会因为流速过快而发生连接管爆裂，也不会因流速过慢而影响成球效果。

作为优选，步骤(2)中，碱性物质以水溶液的形式加入，碱性物质为氢氧化钠或氢氧化钾。

进一步地，步骤(3)中，反应液的后处理方法为：将所得反应液静置分层，滤去油相溶液，利用非离子型亲水性表面活性剂洗涤明胶微球至油相溶液完全除去，再用注射用水洗涤所得明胶微球中残留的交联剂至残留量低于50ug/100mg，将洗涤后的明胶微球冷冻干燥，得到可载药明胶栓塞微球。

进一步地，所述的非离子型亲水性表面活性剂为吐温80溶液或乙二醇溶液。

进一步地，所述冷冻干燥的温度为-30～-45℃，冷冻干燥时间20h以上，直到最终所得可载药明胶栓塞微球的水分残留量低于3％。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明的制备方法简单，易实现，单批次合成的明胶微球粒径范围较集中，粒径大小均一；制备的明胶微球具有无毒、无害、生物相容性好、可生物降解等优点。

(2)本发明主要通过控制蠕动泵滴加装置中针头的大小、微流控芯片装置中微流控芯片的内径和液体流速、明胶水溶液和油相的温度和流速、搅拌速度来控制所得可载药明胶栓塞微球的粒径。

(3)本发明采用蠕动泵滴加装置或微流控芯片装置，并且通过改变不同的合成条件，制备不同粒径范围的明胶微球，可以更方便的将明胶微球靶向介入到指定位置，缩小栓塞区域。

(4)本发明能够制备具有不同降解时间的明胶微球，降解时间为5～45天，明胶微球降解时间范围缩小，提高栓塞效率。

(5)本发明制备的明胶微球弹性较强，能够维持在较大形变和较大压力下而不破碎，更好的应用在临床，提高栓塞成功率。

(6)通过离子交换将药物负载在微球上，根据不同的降解时间选择在一定的时间内释放药物，提高药效的发挥，减少给药次数、消减药物谷峰现象。

附图说明

图1是实施例1中明胶微球的光学显微镜图。

图2是实施例2中明胶微球的光学显微镜图。

图3是实施例3中明胶微球的光学显微镜图。

图4是实施例4中明胶微球的光学显微镜图。

图5为蠕动泵滴加装置结构示意图。

图6为微流控芯片装置结构示意图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方式对本发明作进一步的阐述。所述实施例仅为对本发明的解释和说明，不作为对本发明保护范围的限制。

实施例1

(1)配置明胶溶液，将明胶溶解到注射用水中，配成质量分数为20％的明胶溶液900ml，并置于50℃水浴中加热搅拌1.0h至溶解均匀。溶解后超声30min除去溶液中的气泡，封口后置50℃水浴中保温备用；

(2)合成明胶微球，量取3000ml的液体石蜡倒入反应釜，设置反应温度为50℃，设置搅拌速度300～500rpm，使用蠕动泵滴加装置，选取针头规格为20g，将步骤(1)中的明胶溶液以10ml/min的流速滴加到液体石蜡中，滴加完成后降低反应体系温度为10～12℃，加入0.1mol/l的氢氧化钠溶液调节体系ph值到8.0～8.5，用恒压滴定漏斗将160ml质量百分比浓度为35％的甲醛溶液逐滴滴加到反应体系中，控制滴加时间为1h，滴加完成后继续恒温反应15h得到反应混合液；

(3)反应结束后，将所得反应混合液静置分层，滤去油相，用质量分数为1％的吐温80水溶液，洗涤明胶微球8-10遍至液体石蜡洗涤完全，再用注射用水洗涤明胶微球中残留的游离甲醛，洗涤至含量低于50ug/100mg，设置冷冻干燥温度-45℃、干燥时间为20h，将明胶微球冷冻干燥后即得明胶微球。合成的明胶微球粒径为560～710μm，明胶微球的光学显微镜图如图1所示。

降解实验：取100mg步骤(3)得到的微球置于100ml含质量分数2％胃蛋白酶的0.1mol/l盐酸溶液中，150r/min，37℃水浴消化。以完全消化所需时间为微球降解时间，即得该规格微球降解时间为133min。通过与现有明确的体内降解时间的微球产品进行相同条件的实验对比，可以得出该法制得的微球在人体内降解时间为10～30天。

取100mg步骤(3)得到的微球置于10ml溶有50mg的表柔比星的生理盐水中，每隔10min摇晃一次，20min后抽取1ml溶液，用微孔滤膜过滤。用移液枪移取50μl滤液，加入9.95ml生理盐水中，混匀后，在495nm波长处测定稀释液的吸光度。根据线性回归方程y＝0.1072x-0.0019，r²＝0.9975，其中x为稀释液吸光度，y为表柔比星质量浓度，就可计算出溶液中表柔比星的浓度。

载药量的计算：

载药量＝(w1/w2)×100％，其中w1为微球中所含药物的质量，w2为微球的总质量。

最终算出目标微球的载药量为8.6％。

实施例2

(1)配置明胶溶液，将明胶溶解到注射用水中，配成质量分数为15％的明胶溶液900ml，并置于60℃水浴中加热搅拌1.0h至溶解均匀，溶解后用超声30min除去溶液中的气泡，封口后置60℃水浴中保温备用；

(2)合成明胶微球，量取5000ml的液体石蜡倒入反应釜，设置反应温度为60℃，设置搅拌速度700～1000rpm。使用微流控芯片装置滴加步骤(1)中的明胶溶液，选取芯片管道出口内径为50μm，控制明胶溶液流速为5ml/min，滴加完成后降低反应体系温度为5℃，加入0.1mol/l的氢氧化钾溶液调节体系ph值到8.5～9.0，用恒压滴定漏斗将160ml质量百分比浓度为35％的戊二醛溶液逐滴滴加到反应体系中，控制滴加时间为1h。滴加完成后继续恒温反应20h，得到反应混合液；

(3)反应结束后，将所得反应混合液静置分层，滤去油相，用质量分数为0.5％的吐温80水溶液洗涤明胶微球8-10遍至液体石蜡洗涤完全，再用注射用水洗涤明胶微球中残留的游离甲醛，洗涤至含量低于50ug/100mg设置冷冻干燥温度-45℃、干燥时间为30h，将明胶微球冷冻干燥后即得明胶微球。合成的明胶微球粒径为50～150μm，明胶微球的光学显微镜图如图2所示。

降解实验步骤：取100mg步骤(3)得到的微球置于100ml含质量分数2％胃蛋白酶的0.1mol/l盐酸溶液中，150r/min，37℃水浴消化。以完全消化所需时间为微球降解时间，即得该规格微球降解时间为720min。通过与现有明确体内降解时间的微球产品进行相同条件的实验对比可以得出该法制得的微球在人体内降解时间为5～45天。

取100mg步骤(3)得到的微球置于10ml溶有50mg阿霉素的生理盐水中，每隔10min摇晃一次，20min后抽取1ml溶液，用微孔滤膜过滤。用移液枪移取50μl滤液，加入9.95ml生理盐水中，混匀后，在495nm波长处测定稀释液吸光度。根据线性回归方程y＝0.0094x-0.0011，r²＝0.9956，其中x为稀释液吸光度，y为多柔比星质量浓度，就可计算出溶液中多柔比星的浓度。

载药量的计算：

载药量＝(w1/w2)×100％，其中w1为微球中所含药物的质量，w2为微球的总质量。

最终算出目标微球的载药量为9.1％。

实施例3

(1)配置明胶溶液，将明胶溶解到注射用水中，配成质量分数为10％的明胶溶液900ml，并置于60℃水浴中加热搅拌1.0h至溶解均匀，溶解后用超声30min除去溶液中的气泡，封口后置60℃水浴中保温备用；

(2)合成明胶微球，量取3000ml的乙酸乙酯倒入反应釜，设置反应温度为50℃，设置搅拌速度100～300rpm，使用蠕动泵滴加明胶装置，选取针头规格为20g，将步骤(1)中的明胶溶液以15ml/min的流速滴加到所述的乙酸乙酯中，滴加完成后降低反应体系温度为10℃，加入1mol/l的氢氧化钠溶液调节体系ph值到8.0～9.0，用恒压滴定漏斗将200ml质量百分比浓度为20％的甲醛溶液逐滴滴加到反应体系中，控制滴加时间为1h，滴加完成后继续恒温反应20h得到反应混合液；

(3)反应结束后，将所得反应混合液静置分层，滤去油相，用质量分数为1％的吐温80水溶液洗涤明胶微球8-10遍至液体石蜡洗涤完全，再用注射用水洗涤明胶微球中残留的游离甲醛，洗涤至含量低于50ug/100mg，设置冷冻干燥温度-45℃、干燥时间为30h，将明胶微球冷冻干燥后即得明胶微球。合成的明胶微球粒径为1000～2000μm，明胶微球的光学显微镜图如图3所示。

降解实验：取100mg步骤(3)得到的微球置于100ml含质量分数2％胃蛋白酶的0.1mol/l盐酸溶液中，150r/min，37℃水浴消化。以完全消化所需时间为微球降解时间，即得该规格微球降解时间为110min。通过与现有明确体内降解时间的微球产品进行相同条件的实验对比可以得出该法制的微球在人体内降解时间为8～25天。

取100mg步骤(3)得到的微球置于10ml溶有50mg顺铂的生理盐水中，每隔10min摇晃一次，20min后抽取1ml溶液，用微孔滤膜过滤。用移液枪移取50μl滤液，加入9.95ml生理盐水中，混匀后，在495nm波长处测定稀释液吸光度。根据线性回归方程y＝0.0893x+0.0022，r²＝0.9994，其中x为稀释液吸光度，y为顺铂质量浓度，就可计算出溶液中顺铂的浓度。

载药量的计算：

载药量＝(w1/w2)×100％，其中w1为微球中所含药物的质量，w2为微球的总质量。

最终算出目标微球的载药量为7.6％。

实施例4

(1)配置明胶溶液，将明胶溶解到注射用水中，配成质量分数为10％的明胶水溶液900ml，并置于60℃水浴中加热搅拌1.0h至溶解均匀，溶解后用超声30min除去溶液中的气泡，封口后置60℃水浴中保温备用；

(2)合成明胶微球，量取3000ml的乙酸乙酯倒入反应釜，设置反应温度为50℃，设置搅拌速度500～700rpm，使用蠕动泵滴加明胶装置，选取针头规格为15g，将步骤(1)中的明胶溶液以10ml/min的流速滴加到所述的乙酸乙酯中，滴加完成后降低反应体系温度为10℃，加入1mol/l的氢氧化钠溶液调节体系ph值到8.0～9.0，用恒压滴定漏斗将200ml质量百分比浓度为20％的甲醛溶液逐滴滴加到反应体系中，控制滴加时间为1h，滴加完成后继续恒温反应20h得到反应混合液；

(3)反应结束后，将所得反应混合液静置分层，滤去油相，用质量分数为0.5％的吐温80水溶液洗涤明胶微球8-10遍至液体石蜡洗涤完全，再用注射用水洗涤明胶微球中残留的游离甲醛，洗涤至含量低于50ug/100mg，设置冷冻干燥温度-45℃、干燥时间为30h，将明胶微球冷冻干燥后即得明胶微球。合成的明胶微球粒径为300～400μm，明胶微球的光学显微镜图如图4所示。

降解实验步骤：取100mg步骤(3)得到的微球置于100ml含质量分数2％胃蛋白酶的0.1mol/l盐酸溶液中，150r/min，37℃水浴消化。以完全消化所需时间为微球降解时间，即得该规格微球降解时间为120min。通过与现有明确体内降解时间的微球产品进行相同条件的实验对比可以得出该法制的微球在人体内降解时间为7～27天。

取100mg步骤(3)得到的微球置于10ml溶有50mg伊立替康的生理盐水中，每隔10min摇晃一次，20min后抽取1ml溶液，用微孔滤膜过滤。用移液枪移取50μl滤液，加入9.95ml生理盐水中，混匀后，在495nm波长处测定稀释液吸光度。根据线性回归方程y＝0.0901x+0.0009，r²＝0.995，其中x为稀释液吸光度，y为伊立替康质量浓度，就可计算出溶液中伊立替康的浓度。

载药量的计算：

载药量＝(w1/w2)×100％，其中w1为微球中所含药物的质量，w2为微球的总质量。

最终算出目标微球的载药量为7.2％。

显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。